CN106170297A - 用于wt‑1‑阳性疾病的组合/辅助疗法 - Google Patents

Abstract

为了改善原发性疾病响应性和/或克服抗性疾病，本公开提供一种用于治疗或抑制WT‑1依赖性癌症的增殖的方法，所述方法包括向有需要的受试者提供治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂以及抗‑WT‑1/HLA抗体，即以HLA限制性方式特异性结合癌细胞表面上呈递的维尔姆斯氏肿瘤蛋白(WT‑1)的肽的抗体。

Description

用于WT-1-阳性疾病的组合/辅助疗法

相关申请的交叉引用

本申请含与以下文献的主题相关的主题：于2012年4月2日提交的名称为“T-CellReceptor Like Antibodies Specific for WT1Peptides”的共同转让的PCT国际申请序列号PCT/US2012/031892和于2013年3月15日提交的名称为“Antibodies to CytosolicPeptides”(代理人案卷号3314.030P)的共同转让的美国临时申请号61/798,563；各文献内容特此以引用的方式整体并入本文。

特此声明于2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/794,168和于2013年9月20日提交的美国临时专利申请序列号61/880,585在35U.S.C.§119(e)下的权益，并且两篇优先权文件的公开内容均以引用的方式整体并入本文。

联邦政府资助研究的权利声明

本发明在政府支持下完成，由美国国家卫生研究院提供NIH R01CA 55349和P01CA23766号资金资助。政府对本发明具有一定的权利。

序列表

本申请含于2014年3月14日建立的序列表；文件为ASCII格式，被命名为48319_SeqListing.txt并且为182,226字节。该文件特此以引用的方式整体并入本申请。

技术领域

本发明一般涉及WT-1-阳性疾病如慢性骨髓性白血病(CML)的治疗。更具体地，本发明涉及肿瘤生长的抑制以及利用酪氨酸激酶抑制剂治疗剂和针对维尔姆斯氏肿瘤癌基因蛋白(WT-1)的抗体的组合治疗。

发明背景

迄今为止，癌症(如CML)的治疗依赖以蛋白酪氨酸激酶为靶标的治疗剂。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)包含伊马替尼达沙替尼舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼，仅举几例。酪氨酸激酶抑制剂当前是以下疾病治疗中的一线治疗剂：慢性骨髓性(也被称为髓性或髓细胞性)白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、和骨髓增生异常综合征(MDS)、卵巢癌、***癌、软组织肉瘤、恶性胶质瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胃肠道间质瘤(GIST)、乳腺癌、肺癌等。然而，一些TKI(例如，伊马替尼和舒尼替尼)的临床疗效，受限于罕见的患者特异性药物耐受不良或治疗难治性疾病的发展。

除了靶向酪氨酸激酶蛋白的小分子疗法，正在开发基于使用疫苗和肿瘤特异性抗体的免疫方法的白血病治疗。例如，维尔姆斯氏肿瘤癌基因蛋白(WT-1)已经成为对于大多数白血病(包括CML以及各种癌症)的免疫疗法的具吸引力的靶标。WT-1是在胚胎形成期间在中胚层组织中正常表达的锌指转录因子。在正常成人组织中，WT-1表达在CD34⁺造血干细胞中被限制在低水平，但在多种谱系的白血病和各种实体肿瘤中过表达(1-2)。最近，据报道WT-1表达为最小残留疾病的标志。形态学缓解的急性髓性白血病(AML)患者中增加的转录水平已经预测明显的临床复发(3，4)。此外，在造血***恶性肿瘤和实体肿瘤患者中检测到的针对WT-1的抗体，表明WT-1是高免疫原性抗原(7)。

在大多数情况下，临床批准的治疗性单克隆抗体(mAb)识别细胞表面蛋白的结构。然而，WT-1是核蛋白，并且因此是经典抗体疗法所难以达到的。直到最近，靶向WT-1的免疫疗法一直受限于细胞方法，细胞方法目的仅在于产生WT-1-特异性细胞毒性CD8T细胞(CTL)应答，所述应答识别由MHC I类分子在细胞表面上呈递的肽。

为了诱导CTL应答，通常由蛋白酶体或内切/溶酶体来分解胞内蛋白，并且所得到的肽片段结合MHC I类或II类分子。这些肽-MHC复合物在细胞表面表现，其中它们通过肽-MHC(pMHC)-T细胞受体(TCR)相互作用来提供T细胞识别的靶标(8，9)。利用来源于WT-1蛋白的肽的疫苗接种诱导HLA限制性细胞毒性CD8T细胞，其能够杀死肿瘤细胞。

其它癌症治疗方法利用单克隆抗体疗法靶向癌症抗原。已显示单克隆抗体(mAb)疗法通过多种机制来发挥很强的抗肿瘤效应，所述机制包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和作用于过表达靶分子的肿瘤细胞的直接细胞抑制或细胞凋亡诱导效应。

如果存在可提高原发性疾病响应性、克服抗性疾病和/或降低单独治疗剂的有效剂量的辅助治疗方法，将存在极大的益处，例如，避免TKI的毒性和其它不良副作用。

发明概述

本公开提供一种用于治疗WT-1阳性疾病的方法，所述方法基于定向不同分子靶标的治疗剂的组合。所述方法并入使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(如定向Bcr-Abl的那些(伊马替尼和达沙替尼)，和定向其它分子靶标(如EGFR)的TKI(例如埃罗替尼和吉非替尼))的常规治疗，以及基于施用以HLA限制性方式识别并结合WT-1癌蛋白的肽的抗体的免疫治疗方法。

本发明基于意想不到的观察，即当与单独施用相比较时，将TKI和抗-WT-1抗体组合的治疗方案导致肿瘤生长的早期抑制以及增强的抗-肿瘤应答。在一些实施方案中，TKI与抗-WT-1抗体的共同施用允许TKI的使用量低于目前在治疗上述病状中所利用的量，同时维持TKI的疗效，并且此外同时改善肿瘤进展时间、总存活期并且降低与TKI相关的副作用。

因此，在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或抑制受试者的WT-1阳性癌症的生长的方法，所述方法通过施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂和治疗有效量的分离的抗-WT-1抗体或其抗原结合部分，即，特异性结合与MHC抗原结合的WT-1肽的抗体。酪氨酸激酶抑制剂可以定向分子靶标，例如Bcr-Abl(伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼)、EGFR(埃罗替尼和吉非替尼)、VEGFR-1(帕唑帕尼和索拉非尼)等。

在一个方面，WT-1阳性癌症选自由以下组成的组：慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性/骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、间皮瘤、卵巢癌、胃肠癌、乳腺癌、***癌和恶性胶质瘤、胃肠道间质瘤(GIST)以及包括实体瘤的其它瘤。

在一个方面，酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼、巴非替尼、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼、帕唑帕尼和舒尼替尼。在一个实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼或达沙替尼或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，伊马替尼的药学上可接受的盐是甲磺酸伊马替尼。

在另一个方面，本发明涉及使用TKI和分离的抗-WT-1抗体或其抗原结合部分的组合/辅助疗法。用于与TKI的组合疗法的抗-WT-1抗体的实例包括但不限于：

包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的抗-WT-1抗体，所述重链(HC)可变区包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且轻链(LC)可变区包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区包含如下文表1至14和图7-10中所示的氨基酸序列。

在另一个方面，WT-1抗体或其抗原结合片段包含V_H和V_L，所述V_H和V_L包含如下文表1至14和图7-10中所示的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。在又一个方面，WT-1抗体包含下文表1至14和图7-10中所示的scFv氨基酸序列。

所公开的方法采用为完全人抗体的WT-1抗体；所述抗体包含人可变区框架区和人恒定区。WT-1抗体以HLA限制性方式特异性以小于1×10^-8M的K_D结合WT-1肽；在一个实施方案中，K_D在约1×10^-11M至约1×10^-8M的范围内。WT-1抗体诱导针对WT-1阳性细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

附图简述

图1示出1μM、5μM或10μM的伊马替尼不影响人效应细胞在不同效应子:靶标比比率(E:T)下针对新鲜BV173细胞的抗原依赖性细胞毒性，所述新鲜BV173细胞来源于发病危险期的CML白血病细胞系(HLA-A0201⁺，费城染色体阳性)。改变效应子与靶标比率以证明ESKMADCC对于高E:T比率的依赖性。

图2示出抗-WT-1/HLA-A抗体的效果，命名为ESKM，对于肿瘤生长每隔13、20、27、34和40天使用和不使用伊马替尼。

图3示出在向带肿瘤的小鼠日常施用50mg/kg伊马替尼五周，施用和(右下图)和不施用(左下图)100μg抗-WT-1/HLA-A抗体每周两次后，BV173异种移植NSG小鼠的荧光素成像。对照动物接受伊马替尼或抗体(左上图)。

图4示出ESKM和1μM、5μM或10μM的达沙替尼对人效应细胞在不同效应子:靶标比比率(E:T)下针对BV173的ADCC的施用效果。

图5示出达沙替尼单独或与抗-WT-1抗体组合对超过四周治疗的NSG小鼠的BV173肿瘤生长的治疗效果。

图6示出达沙替尼单独或与抗-WT-1抗体组合对照处理5周的治疗后的BV173异种移植NSG小鼠的荧光素成像。

图7-10示出氨基酸序列，包含共有序列，用于抗-WT-1抗体的某些实施方案的CDR，所述抗-WT-1抗体可用于本公开的组合疗法。

图11示出开始治疗6天后BV173R的生长，所述治疗使用酪氨酸激酶抑制剂，伊马替尼和达沙替尼，和抗-WT-1/HLA0201抗体(ESKM)◇对照；□仅ESKM；Δ仅伊马替尼；X伊马替尼和ESKM；>l<仅达沙替尼；O达沙替尼和ESKM。

图12示出用ESKM和普纳替尼治疗的NSG小鼠的BV173R的生长。□对照；Δ仅ESKM；X仅普纳替尼；>l<普纳替尼和ESKM。

图13示出治疗五周后的BV173异种移植NSG小鼠的荧光素成像。

发明详述

本文引用的所有出版物、专利以及其它参考文献以引用的方式整体并入本公开。以引用方式并入的主题不被认为是任何权利要求限定的替代选择，除非另外明确指出。

在实践本发明时，使用了许多免疫学中的常规技术，所述技术在普通技术人员的技术范围内。这些技术更详细地描述于，例如，“Curr ent Protocols in Immunology”(John E.Coligan等编,John Wiley&Sons,Inc.1991和定期更新)；RecombinantAntibodies for Immunot herapy,Melvyn Little编辑,Cambridge University Press2009。含标准方案、为本领域的技术人员广泛已知和依赖、包括制造商的说明书和剂量信息的这些参考文献和其它参考文献的内容特此以引用的方式并入作为本公开的一部分。本申请全篇使用下列缩写：

Ab：抗体

ADCC：抗体依赖性细胞毒性

ALL：急性淋巴细胞性白血病

AML：急性髓性白血病

CDC：补体依赖性细胞毒性

CMC：补体介导的细胞毒性

CDR：互补决定区(也参见下文HVR)

C_L：轻链的恒定区

CH₁：重链的第一恒定区

CH_1,2,3：重链的第一、第二和第三恒定区

CH_2,3：重链的第二和第三恒定区

CHO：中国仓鼠卵巢

CML：慢性骨髓性白血病；也指慢性髓细胞白血病和慢性髓性白血病

CTL：细胞毒性T细胞

E:T比率：效应子:靶标比比率

Fab：抗体结合片段

FACS：荧光激活细胞分选法

FBS：胎牛血清

FR：框架区

HC：重链

HLA：人白细胞抗原

HVR-H：重链高变区(也参见CDR)

HVR-L：轻链高变区(也参见CDR)

Ig：免疫球蛋白

K_D：解离常数

k_off：解离速率

k_on：缔合速率

MHC：主要组织相容性复合物

MM：多发性骨髓瘤

scFv：单链可变片段

TKI：酪氨酸激酶抑制剂

V_H：包含重链高变区和重链可变框架区的可变重链

V_L：包含轻链高变区和轻链可变框架区的可变轻链

WT-1：维尔姆斯氏肿瘤蛋白1

在下面的描述中，本文所用的术语旨在与那些术语如它们被本领域的技术人员所已知的含义一致地解释。下面所提供的定义是为了阐明，而不是限制所定义的术语。

如本文所用，“施用(administering/administration)”是指活性成分至受试者身体的应用。

作为本领域已知的那些术语，“抗体”是指免疫***的抗原结合蛋白。如本文提及的术语“抗体”包括具有抗原结合区的完整、全长抗体，以及其保留所述“抗原结合部分”或“抗原结合区”的任何片段，或其单链，例如单链可变片段(scFv)。天然存在的“抗体”是包含由二硫键互联的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。各重链由重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定(CH)区组成。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定C_L区组成。轻链恒定区包含一个结构域，C_L。V_H和V_L区可进一步细分为具有高变性的区，称为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区，称为框架区(FR)。各V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序由氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)以及经典补体***的第一成分(C1q)。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合区”是指抗体的结合抗原并且赋予抗体以抗原特异性的区或部分；抗原结合蛋白的片段，例如，抗体包含抗体的保留特异性结合抗原(例如，肽/HLA复合物)的能力的一个或多个片段。已展示可由全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。涵盖于术语抗体的“抗体片段”的抗原结合片段的实例包括：Fab片段，其为由V_L、V_H、C_L和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)₂片段，其为包含由在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。

此外，虽然Fv片段的两个结构域，V_L和V_H，由单独的基因编码，但可以使用重组方法通过使它们能够成为单个蛋白链的合成接头将它们连接，所述单个蛋白链中，V_L和V_H区配对以形成单价分子。这些被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等，1988Science242:423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选所述片段。

“分离的抗体”旨在涵盖已经从其自然环境成分鉴定和分离和/或回收的抗体，以及“合成抗体”或“重组抗体”，即通常使用本领域技术人员已知的重组技术或使用肽合成技术所产生的抗体。

如本文所用，术语“有效量”意指将引发(例如，研究人员或临床医师)所寻求的组织、***、动物或人的生物学或医学应答的化合物或治疗剂的量。

术语“治疗有效量”意指任意的这样的量：相比于未接收这种剂量的对应受试者，所述量使得疾病、病症或副作用得到改善的治疗、治愈、预防或改进，或者疾病或病症的恶化率降低。所述术语在它的范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

本发明提供一种通过共同施用酪氨酸激酶抑制剂和抗-WT-1抗体治疗WT-1阳性疾病的改进方法。

酪氨酸激酶抑制剂

酪氨酸激酶抑制剂，以及施用途径和适当剂量的考虑对于某些癌症的治疗是本领域熟知的。这些小分子药物靶向称为酪氨酸激酶的蛋白质类的若干成员，所述酪氨酸激酶参与信号转导。这些酶在一些癌症中过度活化，导致不受控的生长。

适用于本公开方法的酪氨酸激酶抑制剂包括：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼；和巴非替尼伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼；和巴非替尼、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。下表提供一些TKI、它们的分子靶标和FDA-批准的适应症的列表。

表

甲磺酸伊马替尼(市场上称为)被批准用于治疗胃肠道间质瘤(GIST，一种罕见的胃肠道癌症)和其它间质肿瘤、Ph⁺CML、某些其它类型的白血病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、骨髓增生异常/骨髓增殖性病状和***性肥大细胞增多症。伊马替尼通常被视为用于治疗例如CML的第一代Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂。处方信息[2013:Novartis](以引用的方式整体并入)列出了对于伊马替尼施用的建议和相关数据。

达沙替尼(商品名为)被批准用于治疗一些患有CML或急性成淋巴细胞性白血病的患者。所述药物是若干酪氨酸激酶的小分子抑制剂。处方信息[Bristol-Myers Squibb](以引用的方式整体并入)列出了对于达沙替尼施用的建议和相关数据。

尼洛替尼(商品名为)被批准用于治疗一些患有CML的患者。所述药物是另一种小分子酪氨酸激酶抑制剂。处方信息[Novartis](以引用的方式整体并入)列出了对于尼洛替尼施用的建议和相关数据。

波舒替尼(商品名为)也被批准用于治疗一些患有CML的患者并且是小分子酪氨酸激酶抑制剂的另一个实例。处方信息[Pfizer](以引用的方式整体并入)列出了对于伯舒替尼施用的建议和相关数据。

普纳替尼(商品名为ICLUSIG^TM)是FDA批准的，候选用于治疗CML和费城染色体阳性急性成淋巴细胞性白血病(Ph⁺ALL)的口服药物。普纳替尼是多靶向TKI，但普纳替尼的主要靶标是BCR-ABL，这种异常的酪氨酸激酶是CML和Ph⁺ALL的标志。

本文列出的各治疗剂的处方信息以引用的方式整体并入本文。关于酪氨酸激酶抑制剂的剂量和/或副作用的另外信息可以在以下文献中找到：G.D.Demetri,Differentialproperties of current tyrosine kinase inhibitors in gastrointestinal stromaltumors；Warnault P等，Recent Advances in Drug Design of Epidermal Growth FactorReceptor Inhibitors；Sivendran S等，Treatment-related mortality with vascularendothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapy inpatients with advanced solid tumors:a meta-analysis；Cabezón-Gutiérrez L.ALK-mutated non-small-cell lung cancer:a new strategy for cancer treatment；Barni,S.The risk for anemia with targeted therapies for solid tumor；Dasanu,CACardiovascular toxicity associated with small molecule tyrosine kinaseinhibitors currently in clinical use。(参见下文参考文献号69-74)

抗-WT-1抗体

维尔姆斯氏肿瘤癌基因蛋白(WT-1)已经成为针对大多数白血病以及各种癌症的免疫疗法的具吸引力的靶标。WT-1是在胚胎形成期间在中胚层组织中正常表达的锌指转录因子。在正常成人组织中，WT-1表达在CD34⁺造血干细胞中被限制在低水平，但在多种细胞谱系的白血病和各种实体肿瘤中过表达(1-2)。最近，据报道WT-1表达为最小残留疾病的标志。形态学缓解的急性髓性白血病(AML)患者中增加的转录水平已经预测明显的临床复发(3，4)。此外，在造血***恶性肿瘤和实体肿瘤患者中检测到的针对WT-1的抗体，表明WT-1是高免疫原性抗原(7)。

在大多数情况下，临床上批准的治疗性单克隆抗体(mAb)(例如，曲妥单抗)识别细胞表面蛋白的结构。然而，WT-1是核蛋白，并且因此是经典抗体疗法所难以达到的。直到最近，靶向WT-1的免疫疗法一直受限于细胞方法，细胞方法目的仅在于产生WT-1-特异性细胞毒性CD8T细胞(CTL)应答，所述应答识别由MHC I类分子在细胞表面上呈递的肽。

为了诱导CTL应答，通常由蛋白酶体或内切/溶酶体来分解胞内蛋白，并且所得到的肽碎片结合MHC I类或II类分子。这些肽-MHC复合物在细胞表面表现，其中它们通过肽-MHC(pMHC)-T细胞受体(TCR)相互作用来提供T细胞识别的靶标(8，9)。利用来源于WT-1蛋白的肽的疫苗接种诱导HLA限制性细胞毒性CD8T细胞，其能够杀死肿瘤细胞。

现在已经确定的是，抗-WT-1抗体与小分子酪氨酸激酶抑制剂的共同施用可以提高小分子治疗剂的疗效。

在所要求保护的方法和组合物范围内的可以用于癌症组合疗法的抗-WT-1抗体包括但不限于以HLA限制性方式特异性结合WT-1肽并进一步展现出以下特性中的至少一种的那些抗-WT-1抗体：(a)以约1×10^-11M至1×10^-8M的K_D结合WT-1/HLA；(b)诱导针对WT-1表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；或(c)抑制体内WT-1阳性细胞的生长。在一些实施方案中，待与TKI施用配对的抗-WT-1抗体是包含表1-14中列出且在图7-10中示出的一个或多个氨基酸序列(scFv、VH和VL区或CDR)的那些抗体。

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

在表1-14中的序列中，黑体字指示高变重链序列和高变轻链序列之间的连接序列。

在一些实施方案中，在本发明方法中使用的抗-WT-1抗体还可涵盖包含轻链和重链高变区以及恒定区的那些，例如表13(重链)、14(轻链)和15(恒定区)中所示的。类似地，适用于实践本公开的方法的其它WT-1抗体的CDR在图7-10示出。

表13

表14

表15

在一些实施方案中，抗-WT-1抗体是其中恒定区/框架区例如通过氨基酸取代而改变的那些，以修饰抗体的特性(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：抗原结合亲和力、Fc受体结合、抗体碳水化合物，例如，糖基化、岩藻糖基化等，半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、效应细胞功能、结合位点的补充功能或引入)。

在一个实施方案中，抗体为抗-WT-1/A2抗体并且包含表9所示的人IgG1恒定区和Fc结构域。在一个实施方案中，抗-WT-1/A2抗体包含具有表9所述序列的人κ序列，或人λ序列。本发明抗体的一些互补决定区(CDR)的氨基酸序列在表1-14和图7-10中示出。

可以使用宿主表达细胞和方法来生产IgG Fc的糖基化(特别是岩藻糖基化)变体，所述方法描述于美国专利8,025,879；8,080,415；和8,084,022，其内容以引用的方式并入。简言之，通过采用RNA分离纯化标准技术和任选地基于大小的分离获得编码本文所公开的抗体的重链或轻链的信使RNA(mRNA)。然后使用本领域已知的技术生产和分离对应于编码重链或轻链的mRNA的cDNA，所述技术例如cDNA文库构建、噬菌体文库构建以及使用特定相关引物的筛选或RT-PCR。在一些实施方案中，cDNA序列可以是使用已知的体外DNA操作技术全部或部分制造以产生特定需要的cDNA序列的序列。然后可以将cDNA序列放置于载体中，所述载体含有与基因一起在阅读框内的启动子并且与低岩藻糖修饰的宿主细胞相容。

根据本公开的一些实施方案的一个方面，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法。根据这些实施方案，所述方法通过向受试者施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂和治疗有效量的抗-WT-1抗体来实现。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病状的发展、基本上改善病状的临床或美学症状或基本上防止病状的临床或美学症状的出现，并且包括，例如，减少受试者肿瘤的大小，影响受试者的缓解状态、提高预期存活可能性，增加预期寿命，以及增加疾病进展的预期时间。

如随后实施例部分中所描述的，令人惊讶地是，当一起施用时，观察到酪氨酸激酶抑制剂(如伊马替尼和达沙替尼)与抗-WT-1抗体具有有益的累加效应。重要的是，施用达沙替尼和抗-WT-抗体组合的若干动物显示治愈了它们的疾病，然而施用任一单独药物的动物没有。

TKI的适合施用途径可以(例如)包括口服、直肠、经粘膜、尤其是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。或者，可以局部而不是全身方式施用药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射至患者的组织区域内。

口服施用是酪氨酸激酶抑制剂的示例性施用。应理解，酪氨酸激酶抑制剂和抗-WT-1抗体的施用不必通过相同的路径，并且不需要同时执行。

WT-1(或抗-WT-1)抗体将在其所结合的抗原的性质方面有所不同。特异性由HLA抗原类型决定。例如，HLA-A*0201在所有39-46％的白种人中表达，因此，对WT-1肽具有特异性的抗体与HLA-A2结合代表在白种人群中使用的抗体的合适选择。对于在癌细胞表面上呈递的WT-1肽具有特异性的抗-WT-1抗体与HLA-A24结合可能更适合用于其中HLA-A24靶标特别表达的新世界当地人和亚洲人群。因此，WT-1抗体的选择，可以取决于待施用至的受试者的HLA类型。

在其它实施方案中，抗-WT-1/HLA抗体可以包含一个或多个框架区氨基酸取代，所述取代设计的用于提高蛋白质稳定性、抗体结合、表达水平或引入用于治疗剂缀合的位点。然后依照本领域技术人员已知的方法使用这些scFv以产生重组人单克隆Igs。

还包括减少白血病细胞增殖的方法，所述方法包括使白血病细胞与本发明的WT-1抗体接触。在一个相关方面，本发明的抗体可以用于白血病的预防或治疗。治疗性抗体的施用是本领域已知的。

治疗的药物组合物和方法

WT-1抗体可以足以防止、抑制、或减少肿瘤或病理病状的进展的量施用于患有肿瘤或WT-1-相关病理病状的患者以便治疗处理。进展包括，例如肿瘤或病理病状的生长、侵袭、转移和/或复发。用于此用途的有效量用将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫***的一般状况。给药方案还将随着疾病状态和患者的状态而改变，并且通常将在单次大剂量或连续注射以每日多次施用(例如，每4-6小时)范围内，或如由主治医生和患者状况所指示。

通过本发明的WT-1抗体可治疗的医疗病状的鉴定是在本领域技术人员的能力和知识范围内的。例如，患有临床上显著的白血病或容易发展临床显著症状的人个体适于施用本WT-1抗体。本领域技术熟练的临床医生例如，通过临床测试的使用、身体检查和医疗/家族史可以容易地确定，个体是否为这种治疗的候选者。

特征是WT-1表达的病理病状的非限制性实例，包括慢性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性/骨髓性白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)。此外，实体瘤，一般而言且具体而言，与间皮瘤、卵巢癌、胃肠癌、乳腺癌、***癌和成胶质细胞瘤相关的肿瘤适于使用WT-1抗体治疗。

可以使用任何合适的方法或途径来施用本发明的WT-1抗体，并且任选地，共施用抗肿瘤剂和/或其它受体的拮抗剂。施用途径包括，例如，口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内施用。然而，应当强调指出，本发明不限于任何特定的施用方法或途径。

可以理解的是，本发明的WT-1抗体将以组合物的形式施用，所述组合物还包含药学上可接受的载体。适合的药学上可接受的载体包含例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种以及其组合。药学上可接受的载体还可以包含少量增强结合蛋白质的存放期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。注射剂的组合物可以，如本领域已知的进行配制，以便在施用于哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟的释放。

本发明的其它方面包括但不限于，使用抗体和编码它们的核酸用于治疗与WT-1相关的疾病、用于诊断和预后应用以及用作用于细胞和组织中WT-1的检测的研究工具。包含所公开的抗体和核酸的药物组合物涵盖于本发明。包含本发明的核酸的用于通过载体免疫疗法的于抗体基治疗的载体，也可以考虑用于本发明。载体包含使抗体能够表达和分泌的表达载体，以及针对抗原结合蛋白(如嵌合抗原受体)的细胞表面表达的载体。

鉴于之前描述所预期的实施方案包括但不限于，以下编号的实施方案：

1.一种药物组合物，其包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；以及

(A)包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的抗体，所述重链(HC)可变区包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3,并且所述轻链(LC)可变区包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3,所述重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区包含表1-14和图7-10中所示的氨基酸序列；或

(B)包含V_H和V_L的抗体，所述V_H和V_L包含来自表1-12的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列；或

(C)包含scFv的抗体，所述scFv包含来自表1-12的氨基酸序列。

2.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼、巴非替尼、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。

3.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼、普纳替尼或达沙替尼或其药学上可接受的盐。

4.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述伊马替尼的药学上可接受的盐是甲磺酸伊马替尼。

5.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述普纳替尼的药学上可接受的盐是盐酸普纳替尼。

6.一种用于治疗或抑制WT-1阳性癌症的增殖的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂和治疗有效量的抗-WT-1抗体或其抗原结合片段。

7.如实施方案6所述的方法，其中所述WT-1阳性癌症选自选自由以下组成的组：慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性/骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、和骨髓增生异常综合征(MDS)、胃肠道间质瘤、卵巢癌、***癌、软组织肉瘤和恶性胶质瘤。

8.如实施方案6所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼、巴非替尼、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。

9.如实施方案6所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼、普纳替尼或达沙替尼或其药学上可接受的盐。

10.如实施方案6所述的方法，其中所述伊马替尼的药学上可接受的盐是甲磺酸伊马替尼。

11.如实施方案6所述的方法，其中所述普纳替尼的药学上可接受的盐是盐酸普纳替尼。

12.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体选自由以下组成的组：

(A)包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的抗体，所述重链(HC)可变区包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且轻链(LC)可变区包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区包含表1-14和图7-10中所示的氨基酸序列；或

(B)包含V_H和V_L的抗体，所述V_H和V_L包含来自表1-12的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列；或

(C)包含scFv的抗体，所述scFv包含来自表1-12的氨基酸序列。

13.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体包含人可变区框架区。

14.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体是完全人抗体。

15.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，以HLA限制性方式特异性结合WT-1肽。

16.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，以1×10^-8M或更小的K_D结合至WT-1/HLA。

17.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，以约1×10^-11M至约1×10^-8M的K_D结合至WT-1/HLA。

18.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，诱导针对WT-1-阳性细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

19.如实施方案6所述的方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分抑制体内WT-1阳性细胞的生长。

20.如实施方案6所述的方法，其中所述抗体的抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv或单链Fv(scFv)。

现在将相对于代表性实施方案中更详细地描述本发明的方法。

实施例1

材料和方法

细胞样品、细胞系和抗体。在签署关于斯隆-凯特琳癌症中心机构审查委员会(Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Review Board)批准的协议的知情同意后，通过Ficoll密度梯度离心得到从HLA-类型健康供体和患者获得外周血单核细胞(PBMC)。所有细胞由纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering CancerCenter)的细胞免疫学教研室进行HLA分型。白血病细胞系BV173(WT-1+，A0201+)由H.J.Stauss博士(University College London,London,United Kingdom)馈赠。在37℃/5％CO₂下，将细胞系在补充有5％FCS、青霉素、链霉素、2mmol/L谷氨酰胺和2-巯基乙醇的RPMI 1640中培养。

动物。六到八周大的雄性NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠，被称为NOD/SCIDγ(NSG)，购于Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)或从MSKCC动物饲养设施获得。

荧光素酶/GFP阳性细胞的转导和选择。使用含有编码luc/GFP的质粒的慢病毒载体，工程设计BV173细胞以表达高水平的GFP-萤光素酶融合蛋白(39)。使用单细胞克隆，通过流式细胞仪分析仅选择示出高水平GFP表达的细胞，并保持和用于动物研究。

实施例2

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)

ADCC被认为是治疗人mAb的主要效应机制中的一种。因此，疗效的评估，开始于测量针对BV173细胞系的ADCC的体外测试，所述BV173细胞系来源于发病危险期的CML。新鲜BV173细胞用于ADCC靶细胞。将WT-1抗体或其同种型对照人IgG1在750ng/ml在不同效应子:靶标(E:T)比率下与靶细胞和新鲜PBMC一起孵育，保持6小时。添加浓度为0、1、5和10μM的伊马替尼。收获上清液并且通过标准铬51释放测定来测量细胞毒性。

在人PBMC存在下，WT-1抗体介导针对自然呈递的RMF表位的剂量依赖性PBMCADCC，所述RMF表位通过肿瘤细胞(白血病细胞系BV173)上的HLA-A0201分子而自然呈递。重要的是，在不同剂量的伊马替尼存在时WT-1抗体能够介导ADCC。使用来自多个健康供体的PBMC作为效应细胞，在WT-1抗体为750ng/ml时一致观察到杀死。这些结果表明，伊马替尼不影响WT-1抗体介导针对细胞的特定ADCC的能力，所述细胞在体外自然表达RMF和HLA-A0201复合物(图1)。

实施例3

使用注射有HLA-A0201⁺白血病细胞系BV173的NSG小鼠来评估ESKM与TKI的体内疗效。用于与ESKM结合的伊马替尼和达沙替尼疗法的方案包括每只小鼠通过尾静脉注射3×10⁶个细胞，注射后6天荧光素成像以评价肿瘤移植，并且在第6天成像后立即开始治疗。每周使用荧光素成像以监测肿瘤生长。每日腹膜内注射TKI(50mg/kg的伊马替尼和20-40mg/kg的达沙替尼。)每周两次静脉内注射所述抗体。

实施例4

伊马替尼加上抗-WT-1/HLA抗体(ESKM)在人白血病异种移植NSG模型中的疗效。将三百万个BV173人白血病细胞通过尾静脉注射至NSG小鼠。在第6天，在所有待治疗的小鼠中通过萤火虫荧光素酶成像证实肿瘤移植；然后将小鼠随机分成不同的治疗小组(A、B、C和D)。在成像后第6天立即，每周两次通过腹膜内(IP)注射施用100μg抗-WT-1抗体ESKM开始治疗。每日还通过IP注射施用50mg/kg伊马替尼。治疗持续5周(每只小鼠10剂量的ESKM和34剂量的伊马替尼)。组A：不治疗；组B：仅伊马替尼治疗；组C：仅ESK治疗；组D：每日一次的伊马替尼和每周两次的ESK的组合。每周通过发光成像评估肿瘤生长，并且每日评估临床活性。

治疗后5周，动物通过荧光素荧光成像而成像，并且使用Living软件量化所述荧光。这允许对小鼠肿瘤负荷的定量。结果在图3中示出。与未接收伊马替尼或抗-WT-1抗体的对照动物相比，仅接收伊马替尼(50mg/kg每日)的动物具有降低的肿瘤负荷。接受每周两次100μg抗-WT-1抗体持续5周的动物明相比对照小鼠和伊马替尼治疗小鼠显改善很多。肿瘤细胞最大的减少在接受抗-WT-1抗体和伊马替尼组合(组D)的动物中发现。这些动物还显示减小的肿瘤生长，在一周前它们成像的前一天较明显。(图2)

实施例5

达沙替尼加上抗-WT-1/HLA抗体(ESKM)在人白血病异种移植NSG模型中的疗效。将三百万个BV173人白血病细胞通过尾静脉注射至NSG小鼠。在第6天，在所有待治疗的小鼠中通过萤火虫荧光素酶成像证实肿瘤移植；然后将小鼠随机分成5个不同治疗小组(A、B、C、D和E)。在成像后第6天立即，每周两次通过腹膜内(IP)注射施用100μg抗-WT-1抗体ESKM开始治疗。每日还通过IP注射施用40mg/kg达沙替尼。因为达沙替尼在水溶液中不可溶，它被溶解在50μL DMSO中而施用。组A：不治疗；组B：仅DMSO(载体对照)；组C：仅达沙替尼治疗；组D：仅ESK治疗；组E：每日一次的达沙替尼和每周两次的ESK的组合。治疗7天后，注意到用达沙替尼治疗的小鼠看起来病了，体重明显减轻。剂量减少至20mg/kg。小鼠仍然健康状况不佳，1只死亡，并且由于毒性在第11天停止达沙替尼治疗。ESK抗体持续施用满4周治疗周期。每周通过发光成像继续评估肿瘤生长。

治疗后4周的，动物通过荧光素荧光成像而成像，并且使用Living软件量化所述荧光，量化小鼠肿瘤负荷。结果在图6中示出。仅接受达沙替尼的动物起初发生肿瘤清除，但是经过4周的治疗复发了。接受每周两次100μg抗-WT-1抗体持续4周的动物相比对照小鼠明显改善得多，虽然与仅使用达沙替尼的小鼠相比，它们具有增加的肿瘤负荷。接受达沙替尼和ESK组合的小鼠中，一只小鼠颅内肿瘤复发，而其它三只小鼠保持无肿瘤。第5只小鼠在治疗的第8天死于达沙替尼毒性。

实施例6

BV173为HLA-A0201+，是表达WT1的人Ph+ALL细胞系，并且由荧光素酶标记。通过用抗性T315I Bcr-Abl质粒转导BV173来工程化酪氨酸激酶抑制剂(TKI)抗性BV173-R细胞系。通过铬释放测定，利用人PBMC效应子来评估抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。使用生物发光成像(BLI)在NOD/SCIDγ(NSG)小鼠中评价体内肿瘤生长。使用RT-PCR以评估治疗末期具有负BLI信号的小鼠中的最小残留疾病。以达最大耐受剂量使用伊马替尼、达沙替尼和普纳替尼，每日IP给药一次。每周两次IP施用100μg的ESKM。

ESKM体外介导针对BV173和BV173-R细胞系的ADCC。在BV173移植的人白血病异种移植物模型中，ESKM比伊马替尼更有效，具有78％(对52％)的中值肿瘤生长降低。伊马替尼和ESKM疗法的组合导致白血病增长降低94％。高剂量达沙替尼(40mg/kg每日)比ESKM更有效，但由于达沙替尼毒性导致复发而停止治疗。ESKM疗法与达沙替尼的组合导致75％小鼠治愈，这在停止治疗三周后通过骨髓RT-PCR证实。对于使用达沙替尼细胞减灭然后用ESKM巩固治疗的小鼠，观察到延迟复发，但没有治愈。针对体内T315I BV173-R白血病,ESKM高度优于伊马替尼和达沙替尼。针对抗性T315I白血病，ESKM和第一或第二代TKI组合疗法没有实现治愈。

10mg/kg的普纳替尼具有比单独ESKM针对BV173-R更好的效果，但使用ESKM和普纳替尼组合治疗的小鼠具有更高的肿瘤减少(图13)。结论为ESKM是对于敏感的和T315I Ph+ALL有效的治疗抗体。与伊马替尼和达沙替尼相比，通过ESKM治疗抑制抗性T315I Ph+白血病的增长更有效，并且与ESKM组合疗法优于普纳替尼。

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Claims (21)

1.一种药物组合物，其包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；以及

(A)包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的抗体，所述重链(HC)可变区包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且所述轻链(LC)可变区包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重链(HC)可变区和所述轻链(LC)可变区包含表1-14和图7-10中所示的氨基酸序列；或

(B)包含V_H和V_L的抗体，所述V_H和V_L包含来自表1-12的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列；或

(C)包含scFv的抗体，所述scFv包含来自表1-12的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼、巴非替尼、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼、普纳替尼或达沙替尼或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述伊马替尼的药学上可接受的盐是甲磺酸伊马替尼。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述普纳替尼的药学上可接受的盐是盐酸普纳替尼。

6.一种酪氨酸激酶抑制剂和一种抗-WT-1抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或抑制WT-1阳性癌症的增殖。

7.一种用于治疗或抑制WT-1阳性癌症的增殖的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂和治疗有效量的抗-WT-1抗体或其抗原结合片段。

8.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述WT-1阳性癌症选自由以下组成的组：慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、和骨髓增生异常综合征(MDS)、胃肠道间质瘤、卵巢癌、***癌、软组织肉瘤和恶性胶质瘤。

9.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、普纳替尼、巴非替尼、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。

10.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼、普纳替尼或达沙替尼或其药学上可接受的盐。

11.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述伊马替尼的药学上可接受的盐是甲磺酸伊马替尼。

12.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述普纳替尼的药学上可接受的盐是盐酸普纳替尼。

13.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体选自由以下组成的组：

(A)包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的抗体，所述重链(HC)可变区包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且所述轻链(LC)可变区包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区包含表1-14和图7-10中所示的氨基酸序列；或

(B)包含V_H和V_L的抗体，所述V_H和V_L包含来自表1-12的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列；或

(C)包含scFv的抗体，所述scFv包含来自表1-12的氨基酸序列。

14.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体包含人可变区框架区。

15.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体是完全人抗体。

16.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，以HLA限制性方式特异性结合WT-1肽。

17.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，以1×10^-8M或更小的K_D结合WT-1/HLA。

18.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，以约1×10^-11M至约1×10^-8M的K_D结合WT-1/HLA。

19.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，诱导针对WT-1-阳性细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

20.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗-WT-1抗体，或其抗原结合部分，抑制体内WT-1阳性细胞的生长。

21.如权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述抗体的抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv或单链Fv(scFv)。