CN106148193A

CN106148193A - 一种环境空气中藻细胞采样与培养的方法

Info

Publication number: CN106148193A
Application number: CN201510173954.7A
Authority: CN
Inventors: 梁文艳; 胡静茹; 王媛媛
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明涉及环境空气微生物监测领域，具体地，本发明涉及环境空气中藻类细胞采样及培养的方法。所述方法包括以下步骤：1）配制液体培养基；2）向液体培养基中加入无机碳源；3）配制固体培养基，并分装于培养皿中；4）环境空气中藻细胞采样；5）培养皿密封；以及6）光照培养箱中培养，获得空气中藻细胞培养样品。本发明提供的方法优点在于该法能够使所采集到的藻细胞在实验室条件培养生长。

Description

一种环境空气中藻细胞采样与培养的方法

技术领域

本发明涉及环境空气微生物监测领域，具体地，本发明涉及一种环境空气中藻细胞采样与培养的方法。

背景技术

经济的快速发展和人口的急剧增加，促使生态环境恶化，尤其是城市环境空气的污染。按照国际标准化组织（ISO）的定义，空气污染通常是指由于人类活动或自然过程引起某些物质进入大气中，呈现出足够的浓度，达到足够的时间，并因此危害了人类的舒适、健康和福利或环境的现象。近年来，随着空气污染的加剧，人们的环保意识有了很大的提高，与之相关的研究也有很多。但就目前看来，国内对于空气污染关注的焦点主要集中于常规污染物上，如：气溶胶态颗粒物、还原型污染物（SO₂、CO等）、氧化型污染物（光化学污染等）、石油型污染物（NO₂、烯烃等）等。但对于环境空气微生物污染或者有微生物参与的二次污染等方面的关注相对较少，相关研究也不多。

空气微生物来源复杂，又随着气流而漂移，可以说在空气中无处不在。在太阳辐射相对较大，温度较高环境下容易休眠或者死亡。但当条件适宜生存，又会重新繁殖生长。根据城市地理位置、工业结构、人口容量及城市生态环境等不同，空气微生物污染程度与主要污染源都有所差异。另外，空气环境总悬浮颗粒物浓度与大气微生物含量有关。特别是颗粒物粒径小于10µm的飘尘，最易携带微生物到处飘逸。总悬浮颗粒物能减少紫外线照强度，从而降低紫外线的杀菌作用。空气微生物污染不仅能导致人类及动植物疾病的传播，而且能使工农业产品腐败变质，直接威胁和影响人类的健康及经济发展。以微生物中的藻细胞为例，藻细胞在空气中形成的微生物气溶胶粒径一般在0.5µm左右,大多是随着气流漂移而从土壤与水体中扩散到空气中。有毒藻细胞还会释放毒性物质，甚至与其他物质产生联合化学反应而使毒性进一步增强,有的甚至可以通过呼吸***、神经***等危及人体健康。因此，需要对空气微生物中的藻类细胞进行采集、分析和监测。

在现有技术中，通常采用撞击法实现空气微生物的采样，该方法的原理是利用抽气装置，以每分钟恒定气流量，让空气通过狭小喷嘴，使空气和悬浮于其中的微生物粒子形成高速气流，在离开喷嘴时气流射向固体采集面，气体沿采集面拐弯而离开，而颗粒则按惯性继续直线前进，撞击并粘附于采集面上而捕获微生物粒子，经培养后形成菌落，然后进行检测。该方法主要针对空气中的异养细菌、光合细菌、真菌、病毒、噬菌体等微生物，而缺乏针对空气中藻类细胞的采样与培养方法。与这些微生物不同，藻细胞是具有光合作用的微生物体，其生长培养方式与一般细胞、真菌、病毒完全不同，因此，目前所使用的空气微生物采样固体培养基以及培养方法并不适用于空气中藻类细胞的采集与培养。

本发明涉及一种环境空气中藻细胞采样与培养的方法，通过环境科学领域相关监测知识，建立合适的空气中藻细胞采样技术，模拟藻细胞适宜的生长环境，从而达到对空气中藻细胞采样与培养的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环境空气中藻类细胞采样与培养的方法，以解决所采集藻细胞无法正常生长的问题，实现对空气中漂浮的具有活性的藻细胞的采集，并使所采集的活性藻细胞在实验室条件下实现生长。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术步骤：

1）配制液体培养基；

2）向步骤1）中所配制的液体培养基中加入无机碳源，然后用碱性水溶液或酸性水溶液将pH值调整为7.1-7.2；

3）将步骤2）所得液体培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入凝固剂，使凝固剂溶解并混匀；

4）将步骤3）所得固体培养基进行高压灭菌，然后分装于培养皿中，盖上培养皿盖，冷却至室温；

5）打开步骤4）灭菌后的培养皿盖，将培养皿放入空气微生物撞击式采样器中进行采样；

6）将步骤5）采样后的培养皿盖上培养皿盖，并对培养皿口进行密封；

7）将步骤6）的培养皿倒置放入光照培养箱中进行培养，培养温度为25-30℃，昼:夜比为20:4-8:16，光照强度为6000Lux-9000Lux，培养时间为6-20天。

进一步，步骤1）所述藻类优先为蓝绿藻和绿藻。

进一步，步骤1）所述液体培养基优选BG-11或BB培养基，BG-11（不含无机碳源）培养液终浓度组成为：NaNO₃ 1500 mg/L、K₂HPO₄ 40 mg/L、MgSO₄·7H₂O 75 mg/L、CaCl₂·2H₂O 36 mg/L、柠檬酸6 mg/L、柠檬酸铁铵6 mg/L、Na₂EDTA 1 mg/L、H₃BO₃ 2.86 mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.81 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 0.222 mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.39 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.079 mg/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494 mg/L；BB培养液终浓度组成为：NaNO₃ 25 mg/L、CaCl₂·2H₂O 2.5 mg/L、MgSO₄·7H₂O 7.7 mg/L、K₂HPO₄ 7.5 mg/L、KH₂PO₄ 17.5 mg/L、NaCl 2.5 mg/L、Na₂EDTA 50 mg/L、KOH 31 mg/L、FeSO₄·7H₂O 4.98 mg/L、浓H₂SO₄1mL、H₃BO₃11.42 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.82 mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.44 mg/L、MoO₃ 0.71 mg/L、CuSO₄·5H₂O 1.57 mg/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49 mg/L。

进一步，步骤2）中加入无机碳源优选下列之一：碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾。

更进一步，碳酸根离子的终浓度为5-20mg/L，更优选浓度为10-15mg/L。

进一步，步骤2）所述碱性水溶液优选为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，更优选摩尔浓度为1-2mol/L的氢氧化钠水溶液或摩尔浓度为1-2mol/L的氢氧化钾水溶液，所述酸性水溶液优选为硫酸水溶液或盐酸水溶液，更优选摩尔浓度为1-2mol/L的硫酸水溶液或摩尔浓度为1-2mol/L的盐酸水溶液。

进一步，在步骤3）中，加入的凝固剂优选琼脂粉，加入量优选为10-20g/L。

进一步，在步骤3）中，于121℃条件下进行高压灭菌20-30min。

进一步，在步骤4）中，固体基质在培养皿中的分装量为培养皿容积的1/3-1/2。

进一步，在步骤5）中，气流采样速度为20-35L/min（优选25-32L/min），采集时间为2-12小时（优选5-8小时）。

进一步，在步骤6）中，优选半透明热塑性自封封口薄膜对培养皿口进行密封。

进一步，在步骤7）中，培养温度优选28-30℃，昼:夜比优选16:8-12:12，光照强度优选7500-8500Lux，培养时间优选10-16天。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1）在藻细胞较长时间的培养过程中，避免了固体培养基中水分的流失，以及由此而导致的基质干裂，使藻细胞能够在固体培养基上生长繁殖；

2）在藻细胞较长时间的培养过程中，为藻细胞生长提供了一个相对湿润且密闭的环境，避免了空气中其他微生物的干扰；

3）在相对密闭生长环境中，固体培养基基质能够提供藻细胞所需的营养元素，包括无机碳源；

4）该方法具有稳定、简便有效、经济实用和在一般实验条件下即可实现的特点，能够采集并培养种类丰富的蓝绿藻和绿藻细胞，所培养藻细胞便于观察和分离。

具体实施方式

实施例 1 ： BG-11 （不含无机碳源）培养液加入27mg/L碳酸钠的培养基

配制不含无机碳源的BG-11培养液，向其中加入Na₂CO₃，使碳酸根终浓度为12mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.13。将培养基放在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为31L/min，采样时间为6小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为15天。在藻细胞培养的第5天，开始有绿色小点长出，在第13天，基本呈现出绿色大团，在第15天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有集胞藻属、束丝藻属和席藻属的藻细胞。

实施例 2 ： BG-11 （不含无机碳源）培养液加入36mg/L碳酸钾的培养基

配制不含无机碳源的BG-11培养液，向其中加入K₂CO₃，使碳酸根终浓度为15mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.12。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为30L/min，采样时间为6小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为16天。在藻细胞培养的第4天，开始有绿色小点长出，在第11天，基本呈现出绿色大团，在第16天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有绿球藻属、球藻和席藻属的藻细胞。

实施例 3 ： BG-11 （不含无机碳源）培养液加入24mg/L碳酸氢钠的培养基

配制不含无机碳源的BG-11培养液，向其中加入NaHCO₃，使碳酸根终浓度为10mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.12。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为30L/min，采样时间为6小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为16天。在藻细胞培养的第6天，开始有绿色小点长出，在第12天，基本呈现出绿色大团，在第16天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有小球藻和集胞藻属的藻细胞。

实施例 4 ： BG-11 （不含无机碳源）培养液加入27mg/L碳酸氢钾的培养基

配制不含无机碳源的BG-11培养液，向其中加入KHCO₃，使碳酸根终浓度为10mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.13。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为29L/min，采样时间为5.5小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为16天。实验结果：在藻细胞培养的第5天，开始有绿色小点长出，在第12天，基本呈现出绿色大团，在第16天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有束丝藻属、葡萄藻属和颤藻属的藻细胞。

实施例 5 ：BB培养液加入28mg/L碳酸钠的培养基

配制BB培养液，向其中加入Na₂CO₃，使碳酸根终浓度为15mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.12。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为30L/min，采样时间为6小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为15天。在藻细胞培养的第4天，开始有绿色小点长出，在第13天，基本呈现出绿色大团，在第15天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有小球藻、束丝藻属和席藻属的藻细胞。

实施例 6 ： BB 培养液加入35mg/L碳酸钾的培养基

配制BB培养液，向其中加入K₂CO₃，使碳酸根终浓度为10mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.11。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为30L/min，采样时间为6小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为16天。在藻细胞培养的第5天，开始有绿色小点长出，在第13天，基本呈现出绿色大团，在第16天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有束丝藻属和席藻属的藻细胞。

实施例 7 ： BB 培养液加入23mg/L碳酸氢钠的培养基

配制BB培养液，向其中加入NaHCO₃，使碳酸根终浓度为10mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.13。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为30L/min，采样时间为6小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为17天。在藻细胞培养的第6天，开始有绿色小点长出，在第12天，基本呈现出绿色大团，在第17天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有葡萄藻属和集胞藻属的藻细胞。

实施例 8 ： BB 培养液加入26mg/L碳酸氢钾的培养基

配制BB培养液，向其中加入KHCO₃，使碳酸根终浓度为14mg/L，然后用HCl溶液将pH值调整为7.11。将培养基在电炉上进行加热，在微沸状态下加入琼脂粉，每L培养基中加入18g，待琼脂粉溶解混匀后，趁热将培养基分装于培养皿中，分装量为培养皿容积的1/2，盖上培养皿盖，于121℃条件下进行高压灭菌30min。待培养皿冷却后，打开培养皿盖，将培养皿放入空气微生物气溶胶采样器进行采样，气流采样速度为29L/min，采样时间为5.5小时。采样后的培养皿盖上培养皿盖，并用半透明热塑性自封封口薄膜将培养皿口进行密封，使空气无法进入培养皿中。将培养皿放入光照培养箱中进行培养，培养温度为30℃，其昼:夜比为16:8，光照强度为8000Lux，培养时间为16天。在藻细胞培养的第5天，开始有绿色小点长出，在第12天，基本呈现出绿色大团，在16第天，将培养皿取出，置于显微镜下观察、记录并拍照，发现有束丝藻属、葡萄藻属和绿球藻属的藻细胞。

Claims

1.一种环境空气中藻细胞采样与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）配制液体培养基；

（2）向步骤（1）液体培养基中加入无机碳源，并调节溶液pH值为7.1-7.2；

（3）对步骤（2）的液体培养基进行加热，在微沸状态下加入凝固剂；

（4）将步骤（3）的培养基进行高压灭菌，然后分装于培养皿中，盖上培养皿盖；

（5）打开步骤（4）培养皿的培养皿盖，进行环境空气藻细胞样品采样；

（6）将步骤（5）的培养皿盖上培养皿盖，并对培养皿口进行密封；

（7）将步骤（6）的培养皿倒置放入光照培养箱中进行培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，液体培养基为下列之一：不含碳酸钠的BG-11培养基、BB培养基。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，加入无机碳源为下列一种或几种：碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，碳酸根离子的终浓度为5-20mg/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所加入凝固剂为琼脂粉，加入量为10-20g/L。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，采用撞击式空气微生物采样装置进行采样，气流采样速度为20-35L/min，采集时间为2-12小时。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（7）中，培养温度为25-30℃，昼:夜比为20:4-8:16，光照强度为6000Lux-9000Lux，培养时间为6-20天。