CN106119324A - 一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法 - Google Patents

一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法，包括如下步骤：（1）、将银杏果皮投入到NaOH水溶液中，经振荡、沉淀后取上清液，然后将上清液的pH值调节至2‑3，再次沉淀，沉淀物即银杏果皮粗蛋白；（2）、将银杏果皮粗蛋白配制为水溶液；加入蛋白酶，进行水解反应，最后进行灭酶，获得水解液；（3）、将水解液离心沉淀，取上清液真空冷冻干燥后制得肽；（4）、将钙盐与步骤（3）所制得的肽制成水溶液，进行螯合反应，反应结束后，离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入乙醇，静置后离心沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽。本发明所制备的钙螯合肽可以作为抗氧化剂来使用，其对DPPH自由基的清除率较高。

Description

一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法
技术领域
本发明涉及钙螯合肽的制备方法，尤其涉及一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法。
背景技术
钙是人体所必须的营养元素，人们必须通过合理的饮食来获得钙元素，并被人体所吸收，以保证人体的健康和增强体质，目前市场上有各种各样的补钙产品，这些补钙产品丰富了钙的来源，但是这些补钙产品仍不能满足人们越来越高的需要。
目前，我国每年的白果总产量超过1.2万吨，银杏叶片产量达到1.5万吨，而银杏果皮的产量更大，可达到1.5-2.0万吨。银杏果皮中含有蛋白质、脂肪、糖类、鞣质、微量元素、氨基酸，以及黄酮类和酚酸类物质：如银杏酚、白果酚、白果酸、氢化白果酸、氢化白果亚酸、白果醇、莽草酸、D－糖质酸、橙如酸等物质。
在目前，国内外对银杏的研究主要集中在银杏叶，而银杏果皮主要还是以废弃物的形式被扔掉，没有得到有效的利用，既浪费大量资源，又污染了环境。如果能将银杏果皮进行综合利用，利用其中的蛋白质来制备钙螯合肽，不但可解决银杏果皮污染环境的问题，还能提供一种高效的钙离子补充剂，以满足人们日益增长的需要。
发明内容
本申请的目的在于提供一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法，具体包括如下步骤：
（1）、将经过干燥、粉碎的银杏果皮投入到NaOH水溶液中，经振荡、沉淀后取上清液，然后将上清液的pH值调节至2-3，再次沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；在目前，调节pH值的物质很多，例如常用的盐酸就可满足本申请的需要；
（2）、将银杏果皮粗蛋白配制为质量浓度为1-10%，pH值为9-10的水溶液；然后加入蛋白酶，调节水溶液的温度为50-60℃，进行水解反应0.5-5小时后，再将水溶液在95-100℃下保持5-20min ，进行灭酶，获得水解液；
（3）、将上述水解液离心沉淀，取上清液真空冷冻干燥后制得肽；
（4）、将钙盐与步骤（3）所制得的肽用蒸馏水溶解后，制成水溶液，并调整水溶液的pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应0.5-10h，反应结束后，离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入乙醇，静置1-3小时，然后离心沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽；所述钙盐优选为氯化钙；
水溶液中肽与钙离子的质量比为10:1-50:1。
进一步，在上述步骤（1）中，所述NaOH水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L，进一步优选为0.08-0.1 mol/L；银杏果皮与NaOH水溶液的质量比为1:10-1:100，进一步优选为1:50-1:90。
NaOH的主要作用是将银杏果皮中的蛋白质溶解出来，以利于提取，当NaOH的浓度达到一定浓度后，对于蛋白质的溶解速度已增加有限，将NaOH的浓度控制在0.05-0.1mol/L，在保证蛋白质被溶解出来的前提下，降低NaOH的消耗。适当的固液比可以使银杏果皮中蛋白质能够被提取出来，进入到NaOH水溶液中，为避免NaOH水溶液中蛋白质的浓度过高，而影响银杏果皮中蛋白质的提取率，NaOH水溶液相对于银杏果皮的量不能太少，当然在超过一定的比例后，过多的NaOH水溶液也不能提取到更多的蛋白质，将银杏果皮与NaOH溶液的质量比控制在1:10-1:100之间，即可保证银杏果皮中的蛋白质能够被尽可能地提取出来。
进一步，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。经过筛选，碱性蛋白酶是最佳的用于分解蛋白质的蛋白酶。
进一步，蛋白酶的添加量为银杏果皮粗蛋白质量的0.1-2%，进一步优选为0.8-1.6%。该范围内的蛋白酶的用量已能较好地完成蛋白质的分解，无需过多地添加。
适宜的温度可提高蛋白质的提取速度，在步骤（1）中，NaOH水溶液的温度优选为50-60℃。
进一步，水溶液中肽的浓度为10-100g/L。
进一步，所述乙醇为无水乙醇，无水乙醇在上清液中的加入量为上清液体积的1-10倍。
具体地，本发明的最佳实施步骤为：
（1）、将经过干燥、粉碎的银杏果皮投入到60℃的NaOH水溶液中，经振荡1-5小时后，沉淀取上清液，然后将上清液的pH值调节至2.6，再次沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的浓度为0.08-0.1mol/L，银杏果皮与NaOH溶液的质量比为1:50-1:90；
（2）、将银杏果皮粗蛋白配制为质量浓度为1-10%，pH值为9 的水溶液；然后加入碱性蛋白酶，调节水溶液的温度为50℃，进行水解反应0.5-5小时后，再将水溶液在95-100℃下保持10min，进行灭酶，然后冷却，获得水解液；碱性蛋白酶的加入量为银杏果皮粗蛋白质量的0.8-1.6%。
（3）、将上述水解液离心沉淀，取上清液真空冷冻干燥后制得肽；
（4）、将氯化钙盐与步骤（3）所制得的肽用蒸馏水溶解，并调整pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应0.5-10h，反应结束后，离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍体积的无水乙醇，静置2小时，然后离心沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽；其中，肽与钙离子的质量比为10:1-50:1。
在采用本发明制备钙螯合肽的过程中，经过碱性蛋白酶水解后得到的多肽，不但具有钙离子螯合的能力，还具有很强的抗氧化活性，因此本发明所制备的钙螯合肽还可以作为抗氧化剂来使用，其对DPPH自由基的清除率较高，当钙螯合肽在溶剂中的浓度达到0.4g/L以上时，对DPPH自由基的清除率稳定在74%以上。本申请所制作的钙螯合肽对人体具有较高的保健作用。
具体实施方式
实施例1
将银杏果皮除杂，40℃烘干12小时，用粉碎机研磨成粉，取10kg投入到100kg温度为60℃的NaOH水溶液中，在振荡1小时后，离心沉淀取上清液，然后将上清液用盐酸调节pH值至2.6，然后离心沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的浓度为0.08 mol/L。
将制得的银杏果皮粗蛋白制成质量浓度为1%、pH值为9 的水溶液，然后加入相对于银杏果皮粗蛋白的质量的0.1%的碱性蛋白酶，在50℃进行水解反应0.5小时后，将水溶液在100℃下保持沸腾10 min，进行灭酶，获得水解液。
将水解液离心沉淀，取上清液经真空冷冻干燥后制得肽A。
将适量的肽A与氯化钙制成水溶液，其中肽A的浓度为10 g/L，钙离子的浓度为1g/L， pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应0.5小时，然后冷却、离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍体积的无水乙醇，静置2h后离心取沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽A。
所得的钙螯合肽A中肽A与钙的螯合率为53.17%，螯合钙得率为49.28% ，钙的质量百分比为1.95% 。
实施例2
将银杏果皮除杂，50℃烘干8小时，用粉碎机研磨成粉，取1kg投入到100kg温度为50℃的NaOH水溶液中，在振荡5小时后，离心沉淀取上清液，然后将上清液用盐酸调节pH值至2，然后离心沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的浓度为0.1 mol/L。
将制得的银杏果皮粗蛋白制成质量浓度为10%、pH值为10的水溶液，然后加入相对于银杏果皮粗蛋白质量的2%的碱性蛋白酶，在60℃进行水解反应5小时后，将水溶液在95℃下保持20 min，进行灭酶，获得水解液。
将水解液离心沉淀，取上清液经真空冷冻干燥后制得肽B。
将适量的肽B与氯化钙制成水溶液，其中肽B的浓度为10 0g/L，钙离子的浓度为2g/L， pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应10小时，然后冷却、离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入3倍体积的无水乙醇，静置1h后离心取沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽B。
所得的钙螯合肽B中肽B与钙的螯合率为58.36%，螯合钙得率为52.46% ，钙的质量百分比为2.05% 。
实施例3
将银杏果皮除杂，50℃烘干8小时，用粉碎机研磨成粉，取2kg投入到100kg温度为55℃的NaOH水溶液中，在振荡3小时后，离心沉淀取上清液，然后将上清液用盐酸调节pH值至3，然后离心沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的浓度为0.05 mol/L。
将制得的银杏果皮粗蛋白制成质量浓度为5%、pH值为9.5的水溶液，然后加入相对于银杏果皮粗蛋白质量的0.8%的碱性蛋白酶，在50℃进行水解反应2小时后，将水溶液在98℃下保持5 min，进行灭酶，获得水解液。
将水解液离心沉淀，取上清液经真空冷冻干燥后制得肽C。
将适量的肽C与氯化钙制成水溶液，其中肽C的浓度为30g/L，钙离子的浓度为1 g/L， pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应5小时，然后冷却、离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入7倍体积的无水乙醇，静置3h后离心取沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽C。
所得的钙螯合肽C中肽C与钙的螯合率为55.41%，螯合钙得率为50.31% ，钙的质量百分比为1.92% 。
实施例4
将银杏果皮除杂，40℃烘干12小时，用粉碎机研磨成粉，取1kg投入到90kg温度为60℃的NaOH水溶液中，在振荡4小时后，离心沉淀取上清液，然后将上清液用盐酸调节pH值至2.6，然后离心沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的浓度为0.09 mol/L。
将制得的银杏果皮粗蛋白制成质量浓度为8%、pH值为9.7的水溶液，然后加入相对于银杏果皮粗蛋白质量的1.6%的碱性蛋白酶，在50℃进行水解反应3小时后，将水溶液在97℃下保持10 min，进行灭酶，获得水解液。
将水解液离心沉淀，取上清液经真空冷冻干燥后制得肽D。
将适量的肽D与氯化钙制成水溶液，其中肽D的浓度为80g/L，钙离子的浓度为4 g/L， pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应3小时，然后冷却、离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍体积的无水乙醇，静置3h后离心取沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽D。
所得的钙螯合肽D中肽D与钙的螯合率为57.50%，螯合钙得率为50.20% ，钙的质量百分比为2.15% 。
对实施例中得到的肽和钙螯合肽进行活性检测，采用对DPPH自由基的清除作用来表示，具体操作如下：
将钙螯合肽分别制成不同浓度的样品，然后分别取0.4 mL样品与等体积的40g/L DPPH无水乙醇溶液充分混合，室温下避光静置30 min，于波长517 nm下测定吸光值。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。样品的DPPH自由基清除活力按下列公式（1）计算：
(1)
式中，Ai为加入样品的DPPH无水乙醇溶液的吸光值；Aj为加入样品的无水乙醇溶液的吸光值；A0为用去离子水替代样品的DPPH无水乙醇溶液的吸光值。
检测结果见表1。
表1 钙螯合肽对DPPH自由基的清除效果
样品浓度（ g/L） 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
钙螯合肽A对DPPH自由基的清除（%） 19 48 76 82 82 84
钙螯合肽B对DPPH自由基的清除（%） 21 50 75 81 82 82
钙螯合肽C对DPPH自由基的清除（%） 20 49 76 78 80 82
钙螯合肽D对DPPH自由基的清除（%） 20 49 74 80 82 83
还原型谷胱甘肽对DPPH自由基的清除（%） 69 83 91 92 93 93
本申请公开了一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法，包括如下步骤：（1）、将银杏果皮投入到NaOH水溶液中，经振荡、沉淀后取上清液，然后将上清液的pH值调节至2-3，再次沉淀，沉淀物即银杏果皮粗蛋白；（2）、将银杏果皮粗蛋白配制为水溶液；加入蛋白酶，进行水解反应，最后进行灭酶，获得水解液；（3）、将水解液离心沉淀，取上清液真空冷冻干燥后制得肽；（4）、将钙盐与步骤（3）所制得的肽制成水溶液，进行螯合反应，反应结束后，离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入乙醇，静置后离心沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽。 本发明所制备的钙螯合肽可以作为抗氧化剂来使用，其对DPPH自由基的清除率较高。

Claims (9)

1.一种利用银杏果皮制备钙螯合肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、将经过干燥、粉碎的银杏果皮投入到NaOH水溶液中，经振荡、沉淀后取上清液，然后将上清液的pH值调节至2-3，再次沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；
（2）、将银杏果皮粗蛋白配制为质量浓度为1-10%，pH值为9-10的水溶液；然后加入蛋白酶，调节水溶液的温度为50-60℃，进行水解反应0.5-5小时后，再将水溶液在95-100℃下保持5-20min ，进行灭酶，获得水解液；
（3）、将上述水解液离心沉淀，取上清液真空冷冻干燥后制得肽；
（4）、将钙盐与步骤（3）所制得的肽用蒸馏水溶解后，制成水溶液，并调整水溶液的pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应0.5-10h，反应结束后，离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入乙醇，静置1-3小时，然后离心沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽；
水溶液中肽与钙离子的质量比为10:1-50:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在上述步骤（1）中，所述NaOH水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L，银杏果皮与NaOH水溶液的质量比为1:10-1:100。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白酶的添加量为银杏果皮粗蛋白质量的0.1-2%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，NaOH水溶液的温度为50-60℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中水溶液中肽的浓度为10-100g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钙盐为氯化钙。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇为无水乙醇，无水乙醇在上清液中的加入量为上清液体积的1-10倍。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、将经过干燥、粉碎的银杏果皮投入到60℃的NaOH水溶液中，经振荡1-5小时后，沉淀取上清液，然后将上清液的pH值调节至2.6，再次沉淀，将沉淀物清洗并干燥后制得银杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的浓度为0.08-0.1mol/L，银杏果皮与NaOH溶液的质量比为1:50-1:90；
（2）、将银杏果皮粗蛋白配制为质量浓度为1-10%，pH值为9 的水溶液；然后加入碱性蛋白酶，调节水溶液的温度为50℃，进行水解反应0.5-5小时后，再将水溶液在95-100℃下保持10min，进行灭酶，获得水解液；
碱性蛋白酶的添加量为银杏果皮粗蛋白质量的0.8-1.6%；
（3）、将上述水解液离心沉淀，取上清液真空冷冻干燥后制得肽；
（4）、将氯化钙盐与步骤（3）所制得的肽用蒸馏水溶解，并调整pH值为8.0，在50℃下进行螯合反应0.5-10h，反应结束后，离心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍体积的无水乙醇，静置2小时，然后离心沉淀，将沉淀物干燥后制得钙螯合肽；
其中，肽与钙离子的质量比为10:1-50:1。
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