CN106119154B - 一种防治连作花生土传真菌病害的菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治连作花生土壤真菌性病害的细菌菌株及其菌剂，所述菌株为一种假单胞菌(Pseudomonas protegens)，保藏编号为CGMCC No.11539。菌株16s rRNA碱基序列如SEQ ID No：1所示。本发明的菌株产几丁质酶(降解病原菌菌丝细胞壁)活性较高，对镰刀菌、丝核菌、轮枝菌等多种土传真菌性病原菌菌丝体均有显著降解能力。本发明菌剂拌种用量一般仅20‑30公斤/亩，可有效防治旱地连作花生根腐病、立枯病、白绢病等频发的土传真菌性病害，防效达55％以上，具有用量小、抑菌谱广、增产效果显著等优点，有效减轻土传病害对连作地花生产量损失的影响。

Description

一种防治连作花生土传真菌病害的菌株及应用
技术领域
本发明涉及用于连作花生土传真菌性病害的菌株及其菌剂制备方法等，属于农业集约化生产技术领域，专用于克服连作花生土传真菌病害高发问题。
背景技术
花生是我国的重要油料作物，常年播种面积占油料作物总播种面积的35％左右。南方红壤丘陵区是我国的花生主产区之一，相对与华北主产区相比，南方红壤区花生产量较低(平均产量仅为华北产区的60％左右)，这既与花生品种、气候条件、土壤肥力等有关，也与南方红壤区花生连作障碍严重有一定关系。由于红壤旱坡地肥力较低，季节性干旱严重，花生连作现象普遍。花生连作重茬往往导致土传真菌性病害加剧，随连作年限增加，花生根腐病发病率成倍上升，立枯病和白绢病持续增多。因此，有效防治连作地花生土传真菌性病害成为花生可持续生产紧迫的现实需求。
目前常用的治理方法有施用化学杀菌剂和施用含有生防菌的生物有机肥。化学菌剂或高效熏蒸剂可以有效杀灭土壤病原菌基数，暂时减轻病害发生，但同时也抑制了土壤有益菌，从长远角度来看，化学灭菌将会进一步恶化土壤生态功能，不利于农业生产。生防菌的筛选是生物有机肥制备的关键，目前生防菌剂的筛选主要从促生、代谢产物抑菌性的角度开展，并且通常采用与有机肥进行混合发酵后使用。但鉴于生防菌是一种活体生物，不经过强化诱导很难直接在有机肥持续存活等，导致田间防治效果不稳定。此外，目前已有的生物防治有机肥一般用量较大(>200公斤/亩)、应用成本较高。
一般情况下，连作地土传病原真菌丰度相对较高(>30％)，这些病原真菌的细胞壁是由有几丁质构成。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的不足，提供一种用于防治由病原真菌引起的花生土传病害的生防菌剂有效制备方法及其应用，从而有效降低连作花生根际病原真菌基数，达到抑制土传病原菌侵染花生根部的目的，本发明方法专化性强，效果稳定。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种假单胞菌(Pseudomonas protegens)WXX-1，保藏编号为CGMCC No.11539。所述菌株为革兰氏染色阴性细菌，菌株的16s rDNA碱基序列如SEQ ID No：1所示。
本发明还公开了所述的菌株在防治土传真菌性病害中的应用。特别是在防治红壤连作花生土传真菌性病害中的应用。
本发明还提供了菌株在制备防治土传真菌性病害菌剂中的应用。
一种防治土传真菌性病害的菌剂，该菌剂由假单胞菌WXX-1制得。
进一步地，该菌剂中假单胞菌WXX-1经真菌菌丝体诱导强化，有效存活于腐熟的有机粪肥中，WXX-1的含量为1×109cfu/g以上。菌剂田间适用性强，可直接应用于防治南方红壤连作花生土传真菌性病害。
本发明提供假单胞菌WXX1菌剂制备技术为：
1)灭活腐生真菌菌丝诱导体获得：配置PD培养液(马铃薯20％(g/ml)，葡萄糖1.5％(g/ml)，蒸馏水1000ml)，并灭菌处理；然后接种被孢霉(Mortierella sp.)，置于恒温摇床黑暗培养(28℃、120rpm)，7d后，滤纸过滤获得菌丝，蒸馏水洗涤2次，抽滤后高温灭菌(121℃，20min)备用。
2)配置抑菌性强化培养基：牛肉膏3％(g/ml)，蛋白胨8％(g/ml)，灭活腐生真菌菌丝体3％(g/ml)；
3)菌株稳定性强化：将所述菌株加入上述培养基中，发酵通气量10L/m，搅拌转速200r/min，用盐酸调节pH值5.5-6.5，发酵温度为26℃，发酵时间72h，测得菌液OD值为1.0左右；
4)所述菌剂制备：以腐熟的猪粪堆肥为基质，将上述WXX1抑菌性强化发酵液按5％比例接种到上述基质，放置恒温箱(28℃)培养5d；经过第二步对所述菌株对真菌菌丝寄生的强化，所述菌剂可高效定殖于含有大量腐生真菌的有机基质中，所述菌量达到1×109cfu/g。最后获得WXX1抑菌性能强化的固体混合菌剂。
本发明所述菌剂的施用方法，是按1:2比例(重量比)将花生种子与菌剂混拌，菌剂用量20-30公斤/亩；田块开沟后，将与菌剂拌匀后的花生种子一起播于预先开好的播种沟中，然后覆土。这样一方面所述菌株可有效定殖于花生根际，另一方面可有效在花生根圈附近形成防护墙，达到抑制土传病原菌侵染花生根部的目的。本发明可有效防治连作地花生根腐病、立枯病、茎基腐病、白绢病，防效达55％以上，具有田间防治效果稳定、抑菌谱广。
本发明的优点是：菌株WXX1产几丁质酶(降解病原菌菌丝细胞壁)活性较高，对镰刀菌、丝核菌、轮枝菌等多种土传真菌性病原菌菌丝体均有显著降解能力，经过强化诱导可以有效在有机肥中腐生类微生物上寄生生存；接种到腐熟有机粪肥中制备成固体菌剂；是用于防治连作花生土传真菌性病害的生防细菌，菌剂用量少、成本低、增产效果显著。土传真菌病害是农业集约化生产中出现的主要病害，可引起作物枯萎死亡，减产严重。如果把按上述方法制备的菌剂施入连作花生根际，就可在花生生长期内稳定生存，从而有效形成抑制病原菌侵染的防护墙，并有效降低花生根围病原菌基数，最终以微生物之间的“竞争”达到有效防治连作花生土传真菌病害的目的。
附图说明
图1为假单胞菌WXX1在培养基(含2％的几丁质)上的生长及透明圈。
图2为假单胞菌WXX1对尖孢镰刀菌的实验效果图。
注：图中1为尖孢镰刀菌，2为假单胞菌WXX1
图3为假单胞菌WXX1对茄腐镰刀菌的实验效果图。
注：图中1为茄腐镰刀菌，2为假单胞菌WXX1
图4为假单胞菌WXX1对立枯丝核菌的实验效果图。
注：图中1为立枯丝核菌，2为假单胞菌WXX1
图5为假单胞菌WXX1对轮枝菌的实验效果图。
注：图中1为轮枝菌，2为假单胞菌WXX1
图6为假单胞菌WXX1对病原菌真菌菌丝破坏的电镜图。
图7为假单胞菌WXX1菌剂田间应用效果图。
本发明中的菌株WXX-1，所述菌株的分类命名为：假单胞菌(Pseudomonasprotegens)，保藏编号为CGMCC No.11539，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年10月26日。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
采集红壤地区一块连作花生地的花生根际土壤进行相关的试验，其具体步骤为：
(1)土样处理：准备灭菌的富集培养基(成份：细粉几丁质2.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000ml)，分装20ml于无菌三角瓶中，并取1.0g新鲜土样加入三角瓶中，混匀，室温下150r/min培养48h，得到富集的培养液。
(2)涂布分离：吸取1mL滤液加入9.0mL无菌水，连续稀释3次获得稀释度为10-4的样品液，进行梯度稀释，土壤稀释液0.02mL涂布于平板分离培养基上，28℃培养4-7d，观察、挑取产透明圈的细菌菌株。
(3)培养与纯化：挑取单个菌落在平板分离培养基上画线纯化培养，纯化培养后得到的菌株作为供试菌株，接种到牛肉膏蛋白胨斜面暂时保藏。
(4)活性筛选：采用摇瓶复筛方法进行活性筛选，将分离的菌株接入培养基上(培养基成分：细粉几丁质10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，ZnSO40.01g，蒸馏水1000ml)，28℃、150r/min振荡培养3-4d，发酵液离心得到粗酶液，测定酶活力，然后选取产酶活力高的菌株进行复筛(图1)。复筛方法同上，测定酶活力，进一步选取产酶活力高的菌株。
(5)活性检验：用分离纯化的高产几丁质酶的细菌，以供试病原菌为标靶，采用平板对峙培养法直接测定菌株对病原真菌的抑制率。方法是首先将待筛选菌株活化，在PDA平板中心先接种病原真菌，用直径5mm的打孔器在病原菌菌落边缘打孔制成菌饼，并接到PDA平板中央，然后在培养皿四周距病原菌2.5cm左右接种待测的细菌菌株，每株细菌三个重复，28℃培养一周，观察是否产生抑菌圈，用十字交叉法测定病原真菌菌落直径，计算抑制率。
(6)分类地位的确定：提取供试菌株的DNA，进行16SrRNA测序确定菌株的分类地位。
(7)通过以上实验筛选出抗菌效果最好的一株菌株(WXX1)，并扩大培养，提取其DNA，通过16SrNA克隆测序确定了分类地位，该菌株隶属于变形菌门-γ变形菌纲-假单胞菌目-假单胞菌科-假单胞菌属。并于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2015年10月26日，保藏编号为CGMCC No.11539。
保藏号为：CGMCC NO.11539的菌株的生物学特征为：该菌为革兰氏阴性细菌，需氧型，杆状，微黄，细菌的大小范围：1.5-3μm；该菌最适合生长温度为28-30℃，pH为5-7。
实施例2：对各种土传真菌型病原菌的抑菌实验
利用保藏编号为CGMCC NO.11539的菌株进行抗菌实验：首先将所述菌株活化，在PDA平板中心先接种病原真菌，用直径5mm的打孔器在病原菌菌落边缘打孔制成菌饼，并接到PDA平板中央，然后在培养皿四周距病原菌2.5cm左右接种待测的细菌菌株，每株细菌三个重复，28℃培养一周，观察是否产生抑菌圈，用十字交叉法测定病原真菌菌落直径，计算抑制率。所选病原菌为：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.diath)、黑白轮枝菌(Verticilliumdahliae Kleb)，如图2—图5，发现所述菌株对上述土传病原真菌均具有很好的抑菌作用(表1)。然后通过扫描电镜对真菌菌丝进行显微观察发现，菌丝细胞原生质收缩，出现空泡；菌丝畸形膨大成球状；菌丝细胞壁破损、消解，原生质外溢(图6)。
表1菌株离体抑菌率的测定
实施例3：温室活体防治实验
在PDA培养基中活化花生根腐病原菌(茄腐镰刀菌)28℃下培养7d，用无菌水分别冲洗培养基上病原菌孢子，菌液用已灭菌的滤纸过滤以除去菌丝，病原菌将滤液加适当蒸馏水稀释成孢子浓度为1×107个/mL的悬浮液，备用。
将供试生防菌株加入不含真菌菌丝诱导体培养液(牛肉膏3％，蛋白胨8％)进行液体发酵(26℃、72h、200rpm)，然后再以按5％比例接种腐熟的猪粪堆肥基质，放置恒温箱(28℃)培养5d，作为菌剂A备用。
同时按上述同样方法，只是在液体培养基中添加灭活真菌菌丝诱导体(3％)进行抑菌强化液体发酵，制备的菌剂B备用。
采集的红壤旱地农田土壤，粉碎过筛后，与121℃，湿热灭菌3h，以制备无菌土。按5％比例添加病原菌孢子液与无菌土拌匀，装盆。然后按1:2比例将花生种子和菌剂A/B进行混匀，待用。
实验共设4个处理：
CK1，灭菌土壤，不含病原菌和菌剂；
CK2，添加病原菌，获得带菌土壤；
A，含有病原菌土壤+菌剂A；
B，含有病原菌土壤+菌剂B。
每处理10盆，栽种后定时浇水观察发病情况。30d后调查花生根部发病程度。花生根腐病病害分级标准：0级，无可见症状；1级，黑腐面积占整个主根面积的5％以下；2级，黑腐面积占整个主根面积5％～25％；3级，黑腐面积占整个主根面积的25％～50％；4级，黑腐面积占整个主根面积的50％～75％；5级，黑腐面积占整个主根面积的75％以上。
表2菌株WXX1不同菌剂类型处理对土传病害的防治效果
处理类型 病情指数 防治效果(与CK2相比)
CK1 0 /
CK2 63.5 0
A 34.4 45.8％
B 21.2 66.7％
不同菌剂对花生生长都具有很好的促进作用，株高及根系发达程度均显著高于对照组。防效测定结果表明，制备的2种菌剂针对花生根腐病的活体防效分别为45.8％、66.7％，其中菌剂B对土传病菌的防效最好，显著降低了腐烂褐变，防效非常显著。
实施例4：田间连作花生地实验
将保藏编号为CGMCC NO.11539的菌株转为连作花生田间试验，连续3年在田间自然栽培条件下验证该菌株制备的菌剂对连作花生土传真菌性病害的抑制效果，具体如下：
(1)供试土壤基本情况：试验安排于江西余江县红壤旱地花生种植区的连作障碍土壤，试验区常年根腐发病率在40％－70％，并随连作年限延长发病率不断攀升，有的片区土壤已不能耕种，发病率高达80％以上。2012年试验选用了区域已连作5年的红壤花生田块进行效果验证，2013年选用了已连作7年的花生田块进行效果验证，2014年选用了已连作4年的花生田块进行效果验证，每年分别设置4组对比试验，除试验处理差异外，保持试验区土壤条件及栽培管理技术统一。
(2)试验处理与方法：试验共设12个小区，每个小区长10m，宽5m小区之间设1m沟距，随机区组排列花生株距为18-20cm，行距为45-50cm，每穴播2粒种子。设4组实验，分别：
CK:常规NPK施肥，在播种前基施尿素150kg hm-2、氯化钾225kg hm-2、钙镁磷1125kg hm-2；
A:用不含菌丝诱导体制备的菌剂A与花生种子拌匀(2:1)，常规NPK施肥量同CK处理；
B：用含菌丝诱导体制备的菌剂B与花生种子拌匀(2:1)，常规NPK施肥量同CK处理；
C：50％多菌灵可湿性粉剂800倍，常规NPK施肥量同CK处理。每个处理设3次重复。
(3)试验结果：连续3年对不同连作花生田块的防效试验结果表明(表3)：WXX1生防菌剂对连作花生地中的土传真菌病害均具有较好的防治效果(图7)，其中本发明制备菌剂B的防效最高，对花生立枯病、根腐病和白绢病的防效分别为53.0～60.7％、53.2～58.8％、65.0～66.7％，其效果与50％多菌灵可湿性粉剂防效相当，但增产效果更为显著。因此，本发明以保藏编号为CGMCCNO.11539的菌株制备的菌剂对抑制红壤连作花生土传真菌性病害的发生及蔓延具有较好的作用功效，且防治效果稳定，是南方红壤区花生连作障碍的生物修复产品。
表3WXX1生防菌不同菌剂防治连作土壤花生土传真菌病害的田间防效分析(2012年)
表4WXX1生防菌不同菌剂防治连作土壤花生土传真菌病害的田间防效分析(2013年)
表5WXX1生防菌不同菌剂防治连作土壤花生土传真菌病害的田间防效分析(2014年)

Claims (5)

1.一种假单胞菌(Pseudomonas protegens)WXX-1，保藏编号为CGMCC No.11539；所述的菌株应用于防治连作花生土传真菌性病害。
2.一种防治花生土传真菌性病害的菌剂，其特征在于：由权利要求1所述的假单胞菌WXX-1制得。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，该菌剂中假单胞菌WXX-1经真菌菌丝体诱导强化，有效存活于腐熟的有机粪肥中，WXX-1的含量为1×109cfu/g以上。
4.权利要求1所述的菌株在制备防治花生土传真菌性病害菌剂中的应用。
5.权利要求2或3所述菌剂的施用方法，其特征在于，按重量比1:2比例将花生种子与菌剂混拌，菌剂用量20-30公斤/亩；田块开沟后，将与菌剂拌匀后的花生种子一起播于预先开好的播种沟中，然后覆土。
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CN106119154A (zh) 2016-11-16

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