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Abstract

本发明公开了一种诱导果实抗性控制病害的制剂，1L制剂中含有1×109～1×1010个罗伦隐球酵母灭活菌体细胞，其余为水。本发明还同时提供了利用上述制剂进行的诱导果实抗性控制病害的方法，在果实装箱贮藏前，先进行如下任意一种方式的预处理：预处理方式一、先将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内于密封状态下放置23～25小时；预处理方式二、果实采摘前，将制剂喷在果实表面，然后放入容器内于密封状态下放置23～25小时；将上述预处理后的果实从容器中取出后再装箱。采用本发明可实现在不使用化学杀菌剂的前提下能有效控制果实采后病害。

Description

诱导果实抗性控制病害的方法和所用制剂
技术领域
本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种通过诱导果实抗性来抑制果实采后病害的生物保鲜技术。
背景技术
水果在采后由于腐烂而导致的损失非常巨大，据资料显示，我国每年果蔬腐烂超过8000万吨，造成的经济损失达千亿元。病原真菌侵染是造成水果果实采后腐烂的主要原因，常见的病原真菌主要有青霉属(Penicillum spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)和链格孢属(Alternaria spp.)等。
目前，化学杀菌剂仍然是控制水果采后病害的主要措施。以柑橘为例，中国发明专利(申请号200910028802.2，柑橘保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括甲基托布津，多菌灵。中国发明专利(申请号200910028804.1，柑橘长效保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的化学杀菌剂，包括2,4-D钠盐，托布津。中国发明专利(申请号201110209305.X，一种柑橘保鲜剂及其制备方法、应用)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括醚菌酯、唑菌胺脂、肟菌酯、烯肟菌酯等。然而，化学杀菌剂的残留容易对人体健康及环境安全造成严重危害，同时会导致病原微生物产生耐药性，影响病害防治效果。因此，寻找新型的、安全有效的病害控制方法来代替杀菌剂日益成为人们关注的焦点。
植物自身存在着一套复杂的防御机制来抵御病原菌的入侵。外源因子可以通过刺激植物组织，使这种防御机制表现出来，从而使植物产生抗病性，这种现象称为诱导抗性。大量研究表明，热处理、紫外线、钙处理、植物激素及天然抑菌物质、生物防腐剂等都能诱导果实产生抗性。诱导抗性作为一种利用植物自身抗病机制的防治方法，和化学杀菌剂相比具有安全、稳定、环境友好等优点，能够有效降低果实采后贮藏过程中的腐烂，被认为是有效的新型病害控制方法之一。中国授权发明专利《在植物中诱导抗性的混合物和方法》，公开号1925748，公开了一种使用两种或者多种化合物，包括水杨酸或其功能类似产品、促进性化合物、调节性化合物，通过刺激植物天然防御***和在植物中诱导抗性来抑制病原菌侵染的方法。中国发明专利(申请号201510015741.1，一种甜瓜病害控制方法)提供了一种安全的甜瓜病害控制方法，即在甜瓜幼果期、果实迅速膨大期、网纹形成期和采前48小时四个时期喷洒乙酰水杨酸，以诱导果实的抗性。中国发明专利(申请号201410314131.7，诱导果实抗性控制病害的方法及所用制剂)提供了一种利用胶体几丁质溶液诱导果实抗性以控制病害的方法。
罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治酵母菌株。中国发明授权专利《一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基》，专利号ZL200510090063.1，公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方；《酵母拮抗菌C.laurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法》(专利号ZL200510090065.0)公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；《一种生物拮抗菌及其应用》(申请号200310115336.4)公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；《一种生物活性果蔬保鲜膜》(申请号200810128441.4)公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；《葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂》(申请号200910078858.9)公开了一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法；《一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法》(申请号200910079774.7)公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种诱导果实抗性控制病害的方法和所用制剂，采用本发明的制剂可实现在不使用化学杀菌剂的前提下能有效控制果实采后病害。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种诱导果实抗性控制病害的制剂，1L制剂中含有1×109～1×1010个罗伦隐球酵母灭活菌体细胞，其余为水(无菌蒸馏水)。
作为本发明的诱导果实抗性控制病害的制剂的改进：将罗伦隐球酵母菌体细胞于121℃灭菌20min，得罗伦隐球酵母灭活菌体细胞。
作为本发明的诱导果实抗性控制病害的制剂的改进，该1L制剂中含有1×1010个罗伦隐球酵母灭活菌体细胞，其余为水(无菌蒸馏水)。
本发明还同时提供了利用上述制剂进行的诱导果实抗性控制病害的方法，在果实装箱贮藏前，先进行如下任意一种方式的预处理：
预处理方式一、
先将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内于密封状态下放置23～25小时；
预处理方式二、果实采摘前，将制剂喷在果实表面(湿润即可)，然后放入容器内于密封状态下放置23～25小时；
将上述预处理后的果实从容器中取出后再装箱。
作为本发明的诱导果实抗性控制病害的方法的改进：
所述预处理方式一中，浸泡时间为8～12分钟(例如为10分钟)。
作为本发明的诱导果实抗性控制病害的方法的进一步改进：
所述预处理方式一和预处理方式二中的容器均为保鲜薄膜袋。
在本发明中，病害例如为青霉病、黑斑病。
在本发明中，罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii ZJU 10。该菌株已经在申请号为2010101521084的专利中被公开。
在本发明中，
处理方式一：选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用自来水冲洗并在室温(25℃左右)下放干。将清洗后的果实在本发明的制剂中浸泡8～12分钟(较佳为10分钟)后，取出放干(即，沥干水)，再放入保鲜薄膜袋中(扎紧袋口，使其密封)在室温(25℃左右)下保持23～25小时(即，24小时左右)，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。
处理方式二：采用采前喷壶喷洒的方法处理，在果实采摘前，将本发明的制剂喷在果实表面(湿润即可)，待干后(果实表面不再滴液后)取下果实放入保鲜薄膜袋中(扎紧袋口，使其密封)在室温(25℃左右)下保持23～25小时(即，24小时左右)，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。
本发明中的罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液的制备方法为：
保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母菌体ZJU 10在低温(4℃)下保存在NYDA培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min)中，活化时取出，在28℃下于NYDA培养基中培养48小时(培养条件为：200rpm、28℃)，重复传代培养2次后，用接种环将活化好的酵母接到NYDB培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min)中，在200rpm、28℃条件下培养24小时，收集培养液，在4000rpm、4℃条件下离心15min，用无菌蒸馏水洗涤2次，以除去培养介质。用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板确定其浓度(可用无菌蒸馏水调整到所需要的浓度)，最后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，得到罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液。罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液用无菌蒸馏水进行稀释，直至罗伦隐球酵母灭活菌体细胞为1×109～1×1010个/L，得诱导果实抗性控制病害的制剂。
本发明的优点是：(1)本发明中的罗伦隐球酵母资源丰富、成本低廉、性价比高，具有生物可降解性；(2)诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和***的广谱抗性；(3)能显著降低果实的采后病害，对环境和人体健康无任何毒害作用，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点；(4)该制剂在不使用化学杀菌剂的前提下能有效控制果实采后病害。(5)、灭活处理后的菌体细胞更便于保存。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1灭活酵母菌体对梨果实青霉病抗性的诱导作用对比图；
其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母Cryptococcuslaurentii ZJU10。
实施例1、用于控制果实采后病害的制剂
将罗伦隐球酵母的浓度调整到1×108个细胞/mL，121℃灭菌20min后，得罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液。
取1L罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液，加无菌水进行稀释。直至所得的每1L制剂中含有1×109～1×1010个罗伦隐球酵母灭活菌体细胞，其余为水(无菌蒸馏水)；得诱导果实抗性控制病害的制剂。
为了证明本发明制剂的实际使用效果，发明人进行了如下的实验：
实验1、灭活酵母菌体对梨果实青霉病抗性的诱导作用
1、实验材料：
果实为水晶梨。
病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，25℃活化7天备用。
2、处理：
选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(质量％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口加入30μL浓度分别为1×105、1×106、1×107、1×108细胞/mL的罗伦隐球灭活菌体悬浮液，以加入等量的无菌水作为对照；并用PE塑料膜密封。24小时后掀开PE塑料膜在每个伤口处加入30μL病原菌孢子悬浮液(Penicillium expansum，浓度为1×104spores/mL)，在常温(25℃左右)下贮藏，再次用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理重复3次，每个重复9个果实，实验重复两次，以相同结果为准。第3天观察结果。
3、结果：
如图1所示，接入病原菌后第3天，无菌水对照组的发病率已经达到87.2％，而浓度为1×105、1×106、1×107细胞/mL的罗伦隐球灭活菌体悬浮液处理组的发病率分别为85.7％、59.3％、53.7％，显著低于对照组，其中1×107细胞/mL效果最好，比对照组降低了33.5％。在病斑直径上也有类似的结果。然而，1×108细胞/mL处理组在发病率上没有抑制病害的效果，在病斑直径上虽然数值小于对照组，但效果显然不如1×106、1×107细胞/mL处理组。
实验2、灭活酵母菌体对樱桃番茄果实黑斑病抗性的诱导作用
1、实验材料：
果实为樱桃番茄。
病原菌：链格孢(Alternaria alternata)，25℃活化14天备用。
2、处理：
选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。
将樱桃番茄果实浸泡在1×107细胞/mL的罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液中10min，以无菌水作为对照，取出放干(沥干)后用PE塑料薄膜密封。24小时后，用消过毒的打孔器在每个樱桃番茄果实表面形成统一大小和深度的伤口，加入20μL A.alternata孢子悬浮液，浓度为1×104spores/mL。每天定时观察、记录果实伤口处病害发生情况，结果以平均发病率(％)表示。每个处理重复3次，每个重复20个果实，实验重复两次，以相同结果为准。72小时后记录最终结果。
3、结果：
如表1所示，用1×107细胞/mL的罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液对樱桃番茄果实进行整果浸泡处理，24小时之后再接入病原菌，灭活酵母菌体相比对照组发病率下降了17.7％，具有显著差异。
表1、诱导24小时后樱桃番茄果实的发病率(％)
72小时后的发病率(％)
无菌水 90.2±3.0
1×10<sup>7</sup>个/mL灭活菌体 72.5±3.7
对比实验1、将实验2中所述的“24小时后，用消过毒的打孔器在每个樱桃番茄果实表面形成统一大小和深度的伤口”改为“0小时、6小时和48小时后，用消过毒的打孔器在每个樱桃番茄果实表面形成统一大小和深度的伤口”，所用的罗伦隐球酵母灭活菌体悬浮液的浓度仍然为1×107个/mL；其余等同于实验2。
第72小时观察的结果如表2所述：
表2、不同诱导时间下樱桃番茄果实的发病率(％)
Figure BDA0001033404030000061
在没有诱导(0小时)、短时间诱导(6小时)、长时间诱导(48小时)的条件下，罗伦隐球酵母灭活菌体对樱桃番茄果实黑斑病的抑制效果都不如本发明(诱导时间为24小时)。其中在没有诱导、短时间诱导的条件下，灭活酵母菌体没有体现任何抑制作用。
对比例、
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对柑橘青霉病(Penicillium italicum)和绿霉病(Penicillium digitatum)，以及对樱桃、黄桃、油桃等果实的褐腐病(Moniliniafructicola)、板栗采后黑斑病等都有良好的抑制效果。但是将枯草芽孢杆菌灭活后，其不再具备抑制效果，即使如同本发明所述对果实进行诱导(诱导时间设定为1～48小时，浓度设定为1×106/L～1×1012/L)，均不具备抑制效果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.利用制剂进行的诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：在果实装箱贮藏前，先进行如下的预处理：
先将果实放入制剂中浸泡，浸泡时间为8～12分钟；沥干后放入容器内于密封状态下放置23～25小时；
将上述预处理后的果实从容器中取出后再装箱；
1L制剂中含有1×1010个罗伦隐球酵母灭活菌体细胞，其余为水；
将罗伦隐球酵母菌体细胞于121℃灭菌20min，得罗伦隐球酵母灭活菌体细胞；
所述病害为青霉病、黑斑病。
2.根据权利要求1所述的诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：
容器为保鲜薄膜袋。
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