CN106093417A - 一种测定纤维结合蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定纤维结合蛋白的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分：试剂R1：缓冲液、无机盐离子、加速剂、防腐剂、抗人类风湿因子抗体，试剂R2：缓冲液、助悬剂、防腐剂、稳定剂、胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的纤维结合蛋白的浓度。本发明具有测定准确度高、检测方便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定纤维结合蛋白的试剂盒及其制备方法。
背景技术
纤维结合蛋白（Fn）是由二个亚基组成的一种高分子糖蛋白，可分CFn和PFn两种形式。由体内成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞等合成分泌，存在于人体的血液、组织液和脑脊液中，并存在于细胞表面,血液中的Fn绝大部分由肝细胞合成分泌，参与血凝过程，并对单核一巨噬细胞的吞噬起调理素作用,主要功能之一是作为巨噬细胞及网状内皮细胞吞噬作用的一种递质，促进网状内皮细胞对纤维蛋白、纤维蛋白原-纤维蛋白复合物、胶原碎片、受损细胞碎征、细菌及非细菌性毒性物质的调理与清除,CFn为***的基质蛋白质，在肝脏中和胶原纤维分布一起，肝纤维化时水平升高。
早期肝硬化患者血浆的纤维结合蛋白（Fn）浓度明显上升，失代偿期肝炎后肝硬化减低，尤以伴有腹水者更明显,肝硬化病人的纤维结合蛋白（Fn）减低的可能原因是：①肝细胞产生Fn减少；②Fn于纤维蛋白原精密结合，使大量血浆Fn沉积于肝脏纤维组织中。
目前临床上使用较为广泛的纤维结合蛋白的检测方法主要为单向免疫扩散法、化学发光，单向免疫扩散法操作过程复杂，耗时长，对操作人员具有一定的专业技能要求，化学发光检测成本较高，临床大规模标本检测普及有一定的限度，而市场上的其它检测方法，又普遍存在测定准确度低的缺陷，需要进行进一步的改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺陷，而提供一种测定纤维结合蛋白的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~450 mmol/L
加速剂 5~25 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
助悬剂 5~35 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
稳定剂 4~18 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 300 mmol/L
加速剂 15 g/L
防腐剂 0.7g/L
抗人类风湿因子抗体 0.5 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 100 mmol/L
助悬剂 20 mmol/L
防腐剂 0.7 g/L
稳定剂 11 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 5g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钾、硫酸钾、氯化钠中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合，所述的抗人类风湿因子抗体采用兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、羊抗人单克隆抗体中的一种。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用乙二醇、丙三醇、麦芽糖中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合，所述的稳定剂为牛血清白蛋白。
作为优选，所述的胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体的制备方法为：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20℃-37℃的条件下反应1小时，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，超声分散，边分散边加入抗人纤维结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0%时为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为25g/L为止，4℃条件下封闭8-12小时，即可制备得到胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体。
作为优选，本发明还公开了上述测定纤维结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~450 mmol/L
加速剂 5~25 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
助悬剂 5~35 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
稳定剂 4~18 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的纤维结合蛋白的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为4：1；
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：10到1：200之间。
本发明的检测原理是：本发明主要利用抗原抗体反应原理，抗原（FN）和特异性抗体相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，其浊度高低反映血清样品中FN 的浓度，可由校准品所作的剂量。
样本中纤维结合蛋白（Fn）的活性（ug/mL）= CS ×（ug/mL）
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中Fn的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明首先于试剂R1中添加了抗人类风湿因子抗体，在试剂R1和样本孵育的时候，和样本中的类风湿因子发生特异性结合，去除了类风湿因子对检测的干扰，有效的提高了检测的准确性，试剂R2中添加的助悬剂使得胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体均匀分散于试剂中，在试剂R1中加速剂的作用下，与样本中的纤维结合蛋白可迅速发生反应，灵敏度高，易于检测，检测准确度高，而且检测比较方便，无任何放射性污染。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
MES缓冲液 100 mmol/L
氯化钾 300 mmol/L
聚乙二醇-8000 15 g/L
山梨酸钠 0.7g/L
兔抗人多克隆抗体 0.5 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 100 mmol/L
乙二醇 20 mmol/L
山梨酸钠 0.7 g/L
牛血清白蛋白 11 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 5g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 15 mmol/L
氯化钾 150 mmol/L
聚乙二醇-2000 25 g/L
山梨酸钠 0.9 g/L
羊抗人多克隆抗体 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 50 mmol/L
乙二醇 5 mmol/L
山梨酸钠 0.9 g/L
牛血清白蛋白 18 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 1 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，超声分散，边分散边加入抗人纤维结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%时为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为25g/L为止，4℃条件下封闭10小时，即可制备得到胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
MES缓冲液 100 mmol/L
氯化钾 300 mmol/L
聚乙二醇-8000 15 g/L
山梨酸钠 0.7g/L
兔抗人多克隆抗体 0.5 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 100 mmol/L
乙二醇 20 mmol/L
山梨酸钠 0.7 g/L
牛血清白蛋白 11 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 5g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长600nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与2μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中的纤维结合蛋白（Fn）的活性（ug/mL）= CS × （ug/mL）计算出样本中的纤维结合蛋白的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，超声分散，边分散边加入抗人纤维结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%时为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为25g/L为止，4℃条件下封闭10小时，即可制备得到胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 15 mmol/L
氯化钾 150 mmol/L
聚乙二醇-2000 25 g/L
山梨酸钠 0.9 g/L
羊抗人多克隆抗体 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 50 mmol/L
乙二醇 5 mmol/L
山梨酸钠 0.9 g/L
牛血清白蛋白 18 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 1 g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长600nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与2μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中的纤维结合蛋白（Fn）的活性（ug/mL）= CS × （ug/mL）计算出样本中的纤维结合蛋白的浓度。
表1为实施例1所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的纤维结合蛋白的浓度为 100 ug/mL，测定结果见表1：
表1
| 第1次（ug/mL） | 第2次（ug/mL） | 第3次（ug/mL） | 均值（ug/mL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 103 | 100 | 100 | 101 | 1.00 |
| 实施例2 | 97 | 100 | 98 | 98.3 | 1.70 |
由表1可知，本发明所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的纤维结合蛋白的浓度为200 ug/mL，测定结果见表2：
表2
| 第1次（ug/mL） | 第2次（ug/mL） | 第3次（ug/mL） | 均值（ug/mL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 200 | 194 | 199 | 197.7 | 1.15 |
| 实施例2 | 206 | 206 | 199 | 203.7 | 1.85 |
由表2可知，本发明所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定纤维结合蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~450 mmol/L
加速剂 5~25 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
助悬剂 5~35 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
稳定剂 4~18 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 300 mmol/L
加速剂 15 g/L
防腐剂 0.7g/L
抗人类风湿因子抗体 0.5 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 100 mmol/L
助悬剂 20 mmol/L
防腐剂 0.7 g/L
稳定剂 11 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 5g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钾、硫酸钾、氯化钠中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合，所述的抗人类风湿因子抗体采用兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、羊抗人单克隆抗体中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用乙二醇、丙三醇、麦芽糖中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合，所述的稳定剂为牛血清白蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体的制备方法为：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20℃-37℃的条件下反应1小时，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，超声分散，边分散边加入抗人纤维结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0%时为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为25g/L为止，4℃条件下封闭8-12小时，即可制备得到胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~450 mmol/L
加速剂 5~25 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
抗人类风湿因子抗体 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
助悬剂 5~35 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
稳定剂 4~18 g/L
胶乳包被抗人纤维结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的纤维结合蛋白的浓度。
7.根据权利要求6所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为4：1。
8.根据权利要求6所述的一种测定纤维结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：10到1：200之间。
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610358108.7A Pending CN106093417A (zh) | 2016-05-26 | 2016-05-26 | 一种测定纤维结合蛋白的试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN106093417A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107365360A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-21 | 吉林大学 | 抗原肽‑微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用 |
| CN112129934A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-25 | 上海捷门生物技术有限公司 | 铁蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004011607A2 (en) * | 2002-07-29 | 2004-02-05 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator |
| CN102628864A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒 |
| CN103123319A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-05-29 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN104483475A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 纤维结合蛋白检测试剂盒 |
-
2016
- 2016-05-26 CN CN201610358108.7A patent/CN106093417A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103123319A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-05-29 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法 |
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