CN113063938B - 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法 - Google Patents

一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条，包括试纸和样品杯；试纸包括支撑层、吸附层和保护层；吸附层依次为样品垫、结合垫、纤维素膜层及吸水材料层；纤维素膜层上设置有检测线T1、检测线T2和质控线；结合垫采用吸附有纳米材料标记抗原的玻璃纤维棉制成；样品杯为稀释样品所用容器，样品杯内预固定有金标蛋白重悬液稀释的靶标物单克隆抗体。该试纸检测方法可以制备两条互不干扰的检测线，实现梯度半定量；且抗体独立干燥于样品杯中，避免了抗体标记过程中的折叠及损伤，并可精确控制抗体用量；以纳米颗粒标记人工抗原作为探针，检测线T2上拦截的每个抗体都能精准结合两个标记抗原，实现了信号自放大，与传统方法相比灵敏度更高。

Description

一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法
技术领域
本发明涉及一种免疫层析方法，具体涉及一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法。
背景技术
免疫层析技术是近些年发展起来的一种快速免疫检测技术，它的基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，以硝酸纤维素膜为载体，标记抗原或抗体作为示踪剂的一种层析检测技术。与传统的免疫分析方法相比，免疫层析技术具有特异性强、检测结果准确、设备操作简单、测量快速、成本低、不需要熟练的技术人员或昂贵的设备等优点，完全符合即时检测要求。目前，免疫层析技术已经被广泛应用在医药、畜牧业、农业及食品安全等领域。
在食品安全领域，基于竞争原理的小分子抗原免疫层析技术应用最为广泛，然而现有检测模式常会遇到抗体灵敏度及亲和力都很好，但建立的免疫层析试纸的灵敏度远不如建立的ELISA检测方法好，或者是试纸检测线显色弱等问题。究其原因主要有以下三个方面：1、抗体在标记过程中出现了折叠，且为了稳定标记材料加入了过量抗体；2、人工抗原拦截抗体效率低，为了提高显色必须加入过量的标记抗体提高显色；3、胶体金标记抗体时无信号放大作用，量子点等荧光材料实现信号放大的同时则需要检测仪器判定结果，让检测复杂化。现有的小分子免疫层析检测模式无法解决这一问题，因此迫切需要一种可行的、灵敏的试纸检测模式，为免疫层析试纸的研发提供更多的方法。
同时，在小分子检测中还存在另一个问题：很多靶标物在不同的样品中需要不同的限量标准，或者需要梯度半定量，传统免疫层析试纸模式裸眼观测下仅提供一条检测线可实现半定量，也有学者利用不同浓度的人工抗原喷涂多条检测线来实现梯度半定量，但检测线间的相互影响很大，梯度半定量实现较难，因此迫切需求制备互不干扰的梯度半定量免疫层析方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法，以胶体金/量子点等标记材料标记人工抗原；硝酸纤维素膜上检测线固定二抗或SPA，选用独立质控(C)线***制备质控线；用抗体保护液稀释单克隆抗体并干燥于样品杯中，该检测方法与传统方法相比灵敏度更高，且可以制备两条互不干扰的检测线，实现梯度半定量。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条，由试纸和样品杯两部分组成；所述试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；所述吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；所述保护层固定在样品垫、结合垫及吸水材料层上；纤维素膜层上依次设置有检测线T1、检测线T2和质控线；所述结合垫采用吸附有纳米材料标记抗原的玻璃纤维棉制成；所述样品杯为稀释样品所用容器，样品杯内预固定有金标蛋白重悬液稀释的靶标物单克隆抗体。
所述纳米材料标记抗原为胶体金、量子点或硅球纳米材料标记的人工抗原。
所述人工抗原由小分子半抗原与载体蛋白偶联制备而成；所述偶联人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
所述样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成；支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
所述检测线T1、检测线T2和质控线为平行排列的“|||”直线式印迹，或为“十十十”字型排列印迹，或为“┬┬┬”字型排列印迹，或为“┴┴┴”字型排列印迹，或为“├├├”字型排列印迹，或为“┤┤┤”字型排列印迹。
所述检测线T1喷涂的为2,4-D单克隆抗体，检测线T2喷涂的为羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG，或SPA，质控线喷涂的为亲和素。
所述人工抗原为2,4-D人工抗原；所述样品杯上预固定有金标蛋白重悬液稀释的2,4-D单克隆抗体；所述金标蛋白重悬液为20mmol/L硼酸缓冲液，含1％(w/v)的BSA、3％的(w/v)海藻糖和0.03％的(w/v)叠氮钠。
所述样品杯的制备方法为：用金标蛋白重悬液将2,4-D单克隆抗体稀释为10μg/mL，加入到样品杯中，冷冻干燥密封，4℃保存备用。
所述结合垫的制备方法为：
(1)将人工抗原2,4-D-BSA用超纯水稀释到1mg/mL，按9μL2,4-D-BSA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的2,4-D-BSA溶液逐滴加入到100mL胶体金溶液中，室温反应30min，5％(v/v)的酪蛋白至终浓度为0.5％，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用25mL金标蛋白重悬液重悬，得到金标2,4-D-BSA；采用同样的方法制备金标生物素-BSA溶液，4℃保存备用；
(2)喷金时，将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA按质量比为1:1混合后，用喷涂仪按8μL/cm将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA混合液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫。
所述的免疫层析试纸条的检测方法，包括以下步骤：取80-150μL待检样品加入到样品杯中混合均匀，然后将检测试纸条的测试端***样品杯，5-10min读取结果，当检测线T1及检测线T2均显色时，说明样品中不含待检物或含有的浓度低于T2检测限；当检测线T1显色、检测线T2不显色时，说明样品中含有待检物的浓度大于T2检测限小于T1检测限；当检测线T1及检测线T2均不显色时，说明样品中含有待检物的浓度大于T1检测限；质控线始终显色，当质控线不显色时说明操作有误或者试纸失效。
本发明有益效果：
本发明试纸条以竞争模式为基础制备而成，与传统模式相比有如下优势：
1、灵敏度高。
(1)抗体独立干燥于样品杯中，检测时抗体首先与样品中抗原结合，而且该措施避免了标记抗体过程中抗体的折叠并可精确控制抗体的用量，从而增加试纸灵敏度。
(2)纳米材料标记抗体改为纳米材料标记人工抗原，控制纳米材料标记抗原的量充足，即可以保证检测线T2上被拦截的每个单抗可以结合2个标记抗原，从而实现信号的放大，增加试纸灵敏度；又可以保证剩余的标记抗原被检测线T1上的单抗拦截显色，而且过量的标记抗原不干扰检测线T2检测，从而可以实现梯度半定量检测。
2、本发明试纸条可以提供两条互不干扰的检测线，设定梯度检测范围，提供更准确的检测结果，使免疫层析试纸的应用更为广泛。
3、简便、快速。使用本发明试纸条，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。将100μL样品溶液滴加到试纸条样品垫上或将试纸条的测试端警示线以下***待测样品溶液中，5分钟左右即可判定检测结果。
4、结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示“︱”(或“十”、“┬”、“┴”、“├”、“┤”)印迹作为检测结果阳性和阴性标记。当检测线T1及检测线T2均显色时，说明样品中不含靶标物或含有靶标物的浓度低于T2检测限；当检测线T1显色、检测线T2不显色时，说明样品中含有靶标物的浓度大于T2检测限小于T1检测限；当检测线T1及检测线T2均不显色时，说明样品中含有靶标物的浓度大于T1检测限；质控线始终显色，当质控线不显色时说明操作有误或者试纸失效。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
5、节省费用。使用快速检测试纸条，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。
本发明的检测原理为：
免疫层析试验的原理是采用标记材料与靶标物人工抗原结合形成标记抗原，将标记抗原吸附于玻璃纤维棉上，一端与固定有靶标物单克隆抗体(检测线T1)、二抗或SPA(检测线T2)及独立质控线(C线，如生物素亲和素***)的硝酸纤维素(NC)膜相连，另一端与样品垫相连。而后连同其它所需的吸水纤维、支撑材料、覆盖材料等按照设计工艺进行制作和组装，制成快速检测试纸，同时在样品杯中固定靶标物单克隆抗体。检测样品中不含靶标物或靶标物浓度小于检测线T2的检测限时，样品杯中游离的抗体就会与标记人工抗原反应形成复合物，流经检测线T2时而被固定的二抗或SPA截获，标记材料富积而出现明显直观的条带即为检测线T2，过量的标记人工抗原流经检测线T1时被固定的靶标物单克隆抗体截获出现明显直观的条带即为检测线T1，若检测样品中含有靶标物且靶标物浓度大于检测线T2的检测限时，靶标物与样品杯中游离的靶标物单克隆抗体结合，由于单克隆抗体结合位点被封闭将不再与标记人工抗原反应，靶标物抗体将不带标记，当流经检测线T2时被固定的二抗或SPA截获，将不再显示条带。样品中剩余的靶标物流经检测线T1时与固定的靶标物抗体结合，当靶标物浓度小于检测线T1的检测限时，检测线T1上固定的靶标物抗体没有被抗原完全封闭，将拦截标记人工抗原显示条带；当靶标物浓度大于检测线T1的检测限时，检测线T1上固定的靶标物抗体被抗原完全封闭，不再拦截标记人工抗原，而不显示条带；独立质控线：如复合的金标记生物素-BSA会被膜上固定的亲和素拦截显示条带为质控线。
附图说明
图1为本发明试纸条检测原理示意图。
图2为本发明试纸条剖面示意图。
图中，1为覆盖在样品垫2和结合垫4上的保护层，2为样品垫，3为支撑层，4为结合垫，5为纤维素膜层，6为检测线(检测线T1和检测线T2)，7为质控线，8为覆盖在吸水材料层上的保护层，9为吸水材料层。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，这些实施例只是说明而并不表示本发明所有的可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，本领域的技术人员按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明描述的免疫层析技术或制备出检测试纸，这些修改都在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种用于快速检测微量2,4-D的高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条，由试纸和样品杯两部分组成；所述试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；所述吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；所述保护层固定在样品垫、结合垫及吸水材料层上；纤维素膜层上依次设置有检测线T1、检测线T2和质控线；所述结合垫采用吸附有纳米材料标记抗原的玻璃纤维棉制成；所述样品杯为稀释样品所用容器，其上预固定有金标蛋白重悬液稀释的2,4-D单克隆抗体。
所述纳米材料标记抗原为胶体金、量子点或硅球纳米材料标记的2,4-D人工抗原；所述人工抗原由小分子半抗原与载体蛋白偶联制备而成；所述偶联人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
所述样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成；支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
所述检测线T1、检测线T2和质控线为平行排列的“|||”直线式印迹，或为“十十十”字型排列印迹，或为“┬┬┬”字型排列印迹，或为“┴┴┴”字型排列印迹，或为“├├├”字型排列印迹，或为“┤┤┤”字型排列印迹。
所述检测线T1喷涂的为2,4-D单克隆抗体，检测线T2喷涂的为SPA，质控线喷涂的为亲和素。
在样品垫、结合垫和吸水材料层上覆盖有保护膜，在样品垫与结合垫交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧0.3-0.7cm处印制有样品标记线。
实施例2
用于微量2,4-D检测的高灵敏梯度半定量免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1、2,4-D人工抗原(2,4-D-BSA)的制备
称取2,4-D100mg加200μL甲醇溶解，再加入7mL PBS后溶液变浑浊，再逐滴加入1mol/LNaOH溶液至溶液澄清，随后用0.1MHCl调节溶液的pH值至中性，此为A溶液；称取15mgBSA(牛血清白蛋白)溶解在300μLPBS中，充分溶解后，此为B溶液；将A溶液在4℃搅拌状态下缓慢加入B溶液中，再加入100mg碳二亚胺，4℃搅拌状态下反应12h，将反应产物取出后，PBS流动透析72h，-20℃冻存备用。
2、2,4-D单克隆抗体的制备
用制备的2,4-D-BSA，以每次20μg蛋白/200μL/只的用量免疫6～8周龄Balb/C小鼠，背部皮下分4～6点注射，共免4次，免疫间隔时间3周。首免，用无菌PBS稀释制备的2,4-D-BSA，与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫1次，用无菌PBS稀释的2,4-D-BSA，与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，第4次免疫7天后测定血清抗体效价及抑制效价，筛选效价高，抑制效果好的小鼠作为融合小鼠。对融合小鼠进行超强免疫，将2,4-D-BSA用无菌的PBS稀释到50μg蛋白/200μL，不加佐剂直接腹腔注射。3～4天后将免疫的小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75％(v/v)的酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞。将分离的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的50％聚乙二醇4000(v/v)，1min内加完，前30s加0.1～0.3mL，中间15s加0.2～0.4mL，最后15s加完；然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T--Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择培养基中，并加入96孔细胞培养板中(8～10块)，100μL～200μL/孔，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行2次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。
体内诱生腹水法批量制备抗体，取SPF级BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡400μL/只，7～10天后，把用培养基RMPI-1640稀释成浓度为1×106个细胞/mL的杂交瘤细胞，按500μL/只注射到腹腔中。待小鼠腹腔肿大，皮肤紧绷时，采取腹水，3000r/min离心5min，弃沉淀。然后辛酸硫酸铵法纯化腹水，1mL腹水中加入4mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)稀释腹水，用1M的NaOH溶液将腹水的乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH值调至4.5。然后缓慢搅拌加入130μL辛酸，室温下搅拌反应30min，6000r/min离心30min，去沉淀，上清用滤纸过滤除去杂质，滤液与10倍浓缩的磷酸盐缓冲液(PBS)按体积比9:1混合，即滤液处于1倍PBS离子环境下，然后用1M的NaOH调pH至7.4，放入冰浴中冷却。按0.2778g/mL的浓度加入硫酸铵粉末，4℃下搅拌反应2h，6000r/min离心20min，去上清，1mLPBS溶解沉淀，PBS流动透析3d，6000r/min离心10min弃沉淀，-20℃冻存备用。经检测，所制备的单克隆抗体1F11可特异地与2,4-D反应，可用于制备2,4-D免疫层析试纸。
3、金标蛋白和结合垫的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。99mL超纯水加入到洁净的带刻度的200mL锥形瓶中，锥形瓶置于加热磁力搅拌器上加热并搅拌，加入1mL 1％(w/v)氯金酸溶液，加热至沸腾，然后迅速加入1.6mL 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热溶液颜色经过透明-黑色-深红色-酒红色变化，待颜色不再变化时再加热5min，室温冷却后，用超纯水将胶体金定容至100mL，4℃保存备用。
将2,4-D-BSA用超纯水稀释到1mg/mL浓度，按9μL2,4-D-BSA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的2,4-D-BSA溶液逐滴加入到100mL胶体金溶液中，室温反应30min，5％(v/v)的酪蛋白至终浓度为0.5％，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用25mL金标蛋白重悬液(20mmol/L硼酸缓冲液含1％(w/v)的BSA、3％(w/v)的海藻糖和0.03％(w/v)的叠氮钠)重悬，同法制备金标生物素-BSA溶液，4℃保存备用。
喷金时，将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA按质量比为1:1混合后，得到金标蛋白混合液，用喷涂仪按8μL/cm将金标蛋白混合液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫。
4、试纸条的组装
将亲和素喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)C线位置；2,4-D单克隆抗体喷涂在NC膜T1线位置；SPA喷涂在NC膜的T2线位置，42℃干燥4h，加干燥剂密封，为纤维素膜层，备用。然后将样品垫、结合垫、纤维素膜层、吸水材料层、保护层按照图1所示依次粘贴于支撑层底板上，各组份间重叠1-2mm，用切割机切成试纸条。
5、样品杯的制备
用金标蛋白重悬液将2,4-D单克隆抗体稀释为10μg/mL，加入到样品杯中，冷冻干燥密封，4℃保存备用。
6、免疫层析试纸的检测方法
取80-150μL待检样品加入到样品杯中混合均匀，然后将试纸测试端***样品杯检测，5-10min读取结果，当试纸T1及T2线均显色时说明样品中不含2,4-D或含有的2,4-D的浓度低于T2检测限；当试纸T1线显色T2线不显色时说明样品中含有2,4-D的浓度大于T2检测限小于T1检测限；当试纸T1及T2线均不显色时说明样品中含有2,4-D的浓度大于T1检测限；C线始终显色，当C线不显色时说明操作有误或者试纸失效。
7、灵敏度检测
以浓度为2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL的2,4-D标准品PBS溶液为样品，采用上述制备的2,4-D胶体金免疫层析试纸条进行检测。结果显示，2,4-D浓度大于1000ng/mL时试纸T1及T2线均不显色，和2,4-D浓度大于25ng/mL小于1000ng/mL时试纸条T1线显色T2线不显色，2,4-D浓度大于25ng/mL时试纸条T1及T2线均显色，因此判定本发明2,4-D高灵敏梯度半定量免疫层析试纸条的T2线检测限为25ng/mL，T1线检测限为1000ng/mL。
对比例
采用传统检测模式的2,4-D胶体金免疫层析试纸条，其中硝酸纤维素膜上检测线吸附的为2,4-D人工抗原，质控线吸附的为SPA，胶体金标记的为2,4-D单克隆抗体，作为金标抗体纤维层。
使用时：将胶体金标记的2,4-D单克隆抗体喷涂在硝酸纤维素膜结合垫上，42℃干燥1h，加干燥剂密封备用。将SPA按0.2mg/mL浓度喷涂在NC膜的C线(质控线)位置，2,4-D人工抗原按0.9mg/mL浓度喷涂在NC膜的T线(检测线)位置，42℃干燥4h，加干燥剂密封备用。然后将NC膜、结合垫、样品垫、吸水层、保护层等依次粘贴于支撑底板上，各组份间重叠1-2mm，用切割机切成试纸条。
经灵敏度检测，2,4-D传统检测模式的胶体金免疫层析试纸条的灵敏度为1000ng/mL。对比可知，本发明的2,4-D新型胶体金免疫层析试纸条比2,4-D传统胶体金免疫层析试纸条的灵敏度提高了40倍，且提供了25ng/mL、1000ng/mL两个梯度检测限，实现梯度检测。

Claims (9)

1.一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条，其特征在于，由试纸和样品杯两部分组成；所述试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；所述吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；所述保护层固定在样品垫、结合垫及吸水材料层上；纤维素膜层上依次设置有检测线T1、检测线T2和质控线；所述结合垫采用吸附有纳米材料标记抗原的玻璃纤维棉制成；所述样品杯为稀释样品所用容器，样品杯内预固定有金标蛋白重悬液稀释的靶标物单克隆抗体；
所述检测线T1喷涂的为靶标物单克隆抗体，检测线T2喷涂的为羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG，或SPA，质控线喷涂的为亲和素；所述纳米材料标记抗原为胶体金、量子点或硅球纳米材料标记的人工抗原。
2.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述人工抗原由小分子半抗原与载体蛋白偶联制备而成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
3.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成；支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
4.如权利要求2所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述检测线T1、检测线T2和质控线为平行排列的“|||”直线式印迹，或为“十十十”字型排列印迹。
5.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述检测线T1喷涂的为2,4-D单克隆抗体。
6. 如权利要求1所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述人工抗原为2,4-D人工抗原；所述样品杯上预固定有金标蛋白重悬液稀释的2,4-D单克隆抗体；所述金标蛋白重悬液为20 mmol/L硼酸缓冲液，含1%（w/v）的BSA、3%（w/v）的海藻糖和0.03%（w/v）的叠氮钠。
7.如权利要求6所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述样品杯的制备方法为：用金标蛋白重悬液将2,4-D单克隆抗体稀释为10µg/mL，加入到样品杯中，冷冻干燥密封，4℃保存备用。
8.如权利要求6所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述结合垫的制备方法为：
（1）将人工抗原2,4-D-BSA用超纯水稀释到1mg/mL，按9μL2,4-D-BSA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的2,4-D-BSA溶液逐滴加入到100 mL胶体金溶液中，室温反应30min，5%（v/v）的酪蛋白至终浓度为0.5%，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用25mL金标蛋白重悬液重悬，得到金标2,4-D-BSA；采用同样的方法制备金标生物素-BSA溶液，4℃保存备用；
（2）喷金时，将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA按质量比为1:1混合后，用喷涂仪按8µL/cm将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA混合液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述免疫层析检测试纸条的检测方法包括以下步骤：取80-150μL待检样品加入到样品杯中混合均匀，然后将检测试纸条的测试端***样品杯，5-10min读取结果，当检测线T1及检测线T2均显色时，说明样品中不含待检物或含有的浓度低于T2检测限；当检测线T1显色、检测线T2不显色时，说明样品中含有待检物的浓度大于T2检测限小于T1检测限；当检测线T1及检测线T2均不显色时，说明样品中含有待检物的浓度大于T1检测限；质控线始终显色，当质控线不显色时说明操作有误或者试纸失效。
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