CN106075416A

CN106075416A - 一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗的设计、制备方法和应用

Info

Publication number: CN106075416A
Application number: CN201610417912.8A
Authority: CN
Inventors: 樊海宁; 格日力; 阳旦才让; 汤锋; 周虎; 李润乐
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2016-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明提供一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由多房棘球蚴的表面抗原Emy162以及黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基(CTB)构成。本发明主要通过基因合成技术合成多房棘球蚴表面抗原Emy162基因序列，然后将该基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌原核表达***表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得多房棘球蚴亚单位疫苗。该多房棘球蚴亚单位疫苗能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。

Description

一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗的设计、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗的设计制备方法和应用。

背景技术

多房棘球蚴（Alveolar Echinococcosis）导致泡型棘球蚴病，多房棘球蚴在中间宿主肝内以出芽的方式生长或浸润式增殖，产生新囊泡，长入肝组织，囊壁外角皮层很薄且常不完整，囊体与周围组织间无明显界限，囊液持续渗漏可与肝组织接触，引起局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死,，晚期似肝癌样转移能转移至肺、脑、乳腺等脏器，素有“虫癌”之称，预后极差。世界范围内北半球高海拔地区为泡型棘球蚴病的高发区域。我国三江源地区是多房棘球蚴病的世界罕见高发地区。多房棘球蚴病具有发病范围广、恶性程度高、早期诊断难、预后效果差、术后易复发等特点。目前针对多房棘球蚴病尚无令人满意的治疗策略。大多数牧区患者出现症状时才就医，而病情往往已至晚期，丧失手术机会，即使进行肝部分或半叶切除，术后复发率也很高。甲苯达唑、阿苯达唑等抗生素疗法有一定的治疗效果，但是由于需长期连续治疗导致耐药性的出现及治疗后复发率高等缺限。

表面抗原是刺激机体产生免疫应答的基本功能单位，很多表面抗原可以用作疫苗的研发。而亚单位疫苗基于表面抗原而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。亚单位疫苗具有以下优点：（1）亚单位疫苗减少或消除了常规活疫苗或灭活疫苗难以去除的热原、变应原及其它有害的反应原；且由于亚单位疫苗不能在体内复制, 对宿主没有致病风险, 是最具安全性和稳定性的一种基因工程疫苗。（2）亚单位疫苗只含有病原体的一种或几种只产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，而不含有病原体其他遗传信息，故不含有感染性组分，因而无须灭活，也无致病性，具有很好的稳定性。（3）亚单位疫苗可采用大肠杆菌、酵母菌等原核表达***进行表达。故亚单位疫苗产量很高，易纯化，便于工业化生产。在多房棘球蚴疫苗研究领域，亚单位疫苗与其他疫苗相比，同样具有很大优势，既可激发更高特异性的抗多房棘球蚴抗体，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫针对性和安全性。

对于多房棘球蚴抗原的寻找一直是当前研究的热点之一，现阶段包虫病研究主要集中在包虫病诊断抗原，对预防、抑制多房棘球蚴感染的抗原研究还较少；加之多房棘球蚴感染宿主的免疫逃逸机制复杂，目前还未形成对多房棘球蚴的免疫治疗方式。研究发现Emy162具有很强的免疫作用，并稳定表达于棘球蚴生命周期的各阶段（原头节、培养的棘球蚴、未成熟成虫与成熟成虫），在棘球蚴的粘附及运动生理学中发挥重要的作用。

本课题拟将多房棘球蚴的表面抗原Emy162与黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基进行基因融合，经原核***表达纯化得到亚单位疫苗CTB-Emy162，免疫BALB/C小鼠，使用脾淋巴细胞增殖、特异性ELISA等方法确证亚单位疫苗的免疫原性及免疫特异性。

本发明的思路如下：根据机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制，筛选出具有良好免疫原性的多房棘球蚴表面抗原Emy-162，利用分子生物学技术与黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基（CTB）相偶联，设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162。利用小鼠脾淋巴细胞增殖、ELISA等多种免疫学方法检测多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162的免疫原性和免疫特异性。研究表明多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162能够激发BALB/c小鼠产生的T细胞、B细胞免疫应答和有效抑制多房棘球蚴活性的高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗。

本发明的第二个方面是提供了多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法。

本发明的第三个方面是公布了多房棘球蚴亚单位疫苗的用途。

本发明的第一个方面是提供了一种针对多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162。该多房棘球蚴亚单位疫苗主要由Emy162和霍乱毒素B亚基构成，多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162的整体氨基酸序列如（序列1）所示，表面抗原Emy162的氨基酸序列如（序列3）所示。

本发明的新型多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162具有以下优点：（1）Emy162是多房棘球蚴表面抗原，被公认为是多房棘球蚴疫苗的理想候选抗原能够取得良好的保护作用。多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162能够引起 T细胞及B细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答。（3）Emy162抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本发明的多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162采取“偶联分子内免疫佐剂”的设计思路来增强表面抗原Emy162的免疫原性，从而诱发高滴度的特异性抗体产生。

本发明的第二个方面是提供多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：

（1）新型多房棘球蚴亚单位疫苗抗原分子的结构设计

根据机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制，合理选择具有良好免疫原性的多房棘球蚴表面抗原Emy-162，并与黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基（CTB）相偶联，设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162。

（2）重组表达质粒pET28a-CTB-Emy162（含有融合基因CTB-Emy162）的构建

首先构建一个含有霍乱毒素B亚基（CTB）基因的重组表达载体pET-CTB；然后通过基因合成技术合成一个多房棘球蚴表面抗原Emy162的核苷酸序列，并将其***重组表达载体pET-CTB中，构建重组表达载体pET28a-CTB-Emy162。

（3）融合蛋白CTB-Emy162的原核表达及纯化

将重组表达载体pET28a-CTB-Emy162转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株BL21(DE3)/ pET28a-CTB-Emy162。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTA镍离子亲和层析能够获得高纯度融合蛋白CTB-Emy162，即为多房棘球蚴亚单位疫苗。

本发明的第三个方面是提供了多房棘球蚴亚单位疫苗的用途。多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。

附图说明

图1：新型多房棘球蚴亚单位疫苗的分子结构设计特点。

图2：Emy162基因PCR结果图。

泳道1：DNA Marker；泳道2为Emy162 DNA片段经PCR后的结果

图3：重组表达载体pET28a-CTB-Emy162的双酶切鉴定。

泳道1：DNA Marker；泳道2：pET28a-CTB-Emy162质粒经Nco I和 Xho I双酶切后

图4：重组表达载体pET28a-CTB-Emy162质粒图谱。

Nco I和Xho I之间为***的融合基因CTB-Emy162

图5：多房棘球蚴融合蛋白CTB-Emy162的原核表达。

泳道1：BL21(DE3)/ pET-28a全菌蛋白；泳道2：蛋白质Marker；泳道3：BL21(DE3)/pET-28a-CTB-Emy162全菌蛋白；泳道4：BL21(DE3)/ pET-28a- CTB-Emy162可溶蛋白；泳道5：BL21(DE3)/CTB-Emy162包涵体蛋白。

图6:多房棘球蚴融合蛋白CTB-Emy162的Ni-NTA亲和层析纯化。

泳道1：纯化前的CTB- Emy162蛋白样品；泳道2：经Ni-NTA纯化后的CTB- Emy162蛋白样品。

图7：多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162诱发抗CTB-Emy162及Emy162抗原表位E_7-13、E_129-129抗体的检测。

多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162能够诱发较高滴度的针对CTB-Emy162及Emy162抗原表位E_7-13、E_129-129的抗体。

图8: 多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162抗体效价检测。

图9：多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。

图10：多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162诱发抗多房棘球蚴抗体分型的检测。

具体实施方式

材料

1. IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml 无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2. 卡那青霉素（Kana）贮液（1g/mL）：称取1g 卡那青霉素（Kana）溶于1mL无菌水，制得浓度为1g/mL 的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3. 培养基：（1）LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。（2）LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4. DNA电泳缓冲液（50 x TAE）：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5. SDS-PAGE电泳缓冲液（5X）：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸 94g、SDS 5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6.考马斯亮蓝R-250染液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解在100ml脱色液中。（3）固定液：500ml乙醇、100ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。（4）脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。（5）保存液：25ml 87%甘油溶于225ml脱色液中。

9. 实验动物：（2）BALB/c小鼠：为SPF级，雄性，6～7周龄，购自北京，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

12. 淋巴细胞增殖实验主要试剂（1）小鼠脾脏淋巴细胞分离液（天津灏洋生物技术有限公司）（2）RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10% 胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

实例1：多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162的分子结构设计

在获取Emy162氨基酸序列的基础上，在此基础上添加分子内粘膜免疫佐剂CTB，设计出具有科学合理结构的多房棘球蚴融合蛋白，以达到有效提高体内粘膜免疫反应。

结果：多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162的分子结构设计特点和思路如（图1）所示。

实例2：重组表达载体（含有融合基因CTB-Emy162）的构建

（1）多房棘球蚴表面抗原Emy162核苷酸序列的基因合成

将前期获取的Emy162的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司进行基因合成。合成后的Emy162进行PCR，反应体系如下：

Emy162（0.5mg /mL）	1 µL
		Emy162引物	1 µL
Mix（0.1 mg /mL）	10µL
		ddH₂O(无RNA酶)	8 µL
Total	20 µL

PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30 sec，72℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30 个循环；最后72℃延伸10 min。然后用1%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果（图2）。利用DNA片段凝胶回收纯化试剂盒（北京天根生物技术有限公司）回收纯化PCR扩增的Emy162基因，以备后续实验使用。

（2）重组表达载体pET28a-CTB（含有霍乱素素B亚基基因）的构建

通过质粒小量提取试剂盒（天根）提取重组质粒pET-CTB-UE（由郭乐教授惠赠），用KpnI/Xho I分别进行双酶切，双酶切反应体系如下：

pET-CTB-UE	24 µL
		0.1% BSA	4 µL
KpnI（15U/µL）	2µL
		Xho I（15U/µL）	2µL
K Buffer	4µL
		L Buffe	4µL
Total	40 µL

37℃ 酶切反应2 h，然后用1% 琼脂糖凝胶电泳。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒回收多表位肽UE基因和pET28a-CTB表达载体双酶切产物，pET28a-CTB以备后续实验使用。

（3）多房棘球蚴表面抗原Emy162基因与pET28a-CTB表达载体的连接

将回收的pET28a-CTB线性化质粒载体和PCR后回收的Emy162基因通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下（4℃过夜）连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒pET28a-CTB-Emy162。T4 DNA 连接酶连接体系如下：

pET28a-CTB线性化载体	2 µL
		Emy162基因	14 µL
10×T4 DNA 连接酶 Buffer	2 µL
		T4-DNA 连接酶(3U/µL)	2 µL
Total	20 µL

结果：利用Nco I/Xho I双酶切待检重组质粒pET28a-CTB-Emy162， 37℃反应2h，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段约790bp，与融合基因CTB-Emy162的理论大小一致（图3所示）。

将pET28a-CTB-Emy162送交南京金斯瑞生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pET28a-CTB-Emy162中融合基因CTB-Emy162的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体pET28a-CTB-Emy162的质粒图谱如（图4）所示。

实例3多房棘球蚴融合蛋白CTB-Emy162的原核表达

将测序100%成功的重组表达质粒pET28a-CTB-Emy162转化进E.coli BL21(DE3) 菌株中。在预先制备好的含50ug/mL Kana的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pET28a-CTB-Emy162/BL21(DE3)，倒置于37℃培养箱，过夜培养12～16h 后，挑取单个菌落，接种于含50µg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，190rpm，培养6-8h。以1%接种量分别接种重组菌于含50µg/mL Kana LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡过夜，次日晨再将该菌液以1%接种量接种于含50µg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，190rpm摇瓶9h后，加入IPTG使终浓度达到1mmol/L，28℃，190rpm诱导表达，以空载体菌pET28a/BL21(DE3)作为阴性对照。

结果：将基因工程重组菌株pET28a-CTB-Emy162/BL21(DE3)在PH值为7、IPTG浓度为1mmol/L、诱导温度28℃、诱导时间为9h的情况下进行诱导表达。与对照菌株对比，基因工程重组菌株pET28a-CTB-Emy162/BL21(DE3)在约33KD处出现目的蛋白条带，与多房棘球蚴重组融合蛋白CTB-Emy162的理论大小相符合（图5）。多房棘球蚴重组融合蛋白CTB-Emy162在包涵体蛋白中存在。

实例4：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白CTB-EMY162的纯化

（1）Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化

将Ni-NTA填料充分混匀后加入层析柱中，溶液可通过重力作用缓慢流出，待完全加入后，将上层筛板平放入柱中；向装填好的柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后，加入8倍柱体积的Binding buffer平衡，平衡结束后即可上样；收集菌体后，每100mg菌体加入1-5ml Binding Buffer，冰浴超声裂解菌体；12000rpm离心，弃上清，将沉淀重悬于BindingBuffer中, 进行超声波处理，直至包涵体清洗干净（呈较洁净的乳白色状）；将沉淀重悬于含8M尿素的Binding Buffer中，冰浴1h，使包涵体溶解；将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；使用15倍柱体积的Wash buffer冲洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱体积的Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰；依次使用3倍柱体积的Binding Buffer 和5 倍柱体积的去离子水洗涤后，用3倍柱体积的20%乙醇平衡，4℃保存。

结果：经Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在50mM 咪唑和250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度均在85%以上（图6）。

实施例5：多房棘球蚴多表位疫苗CTB-EMY162的免疫原性和免疫特异性研究

（1）BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为2组，分别为新型多房棘球蚴多表位融合蛋白CTB-Emy162免疫组、PBS免疫组。每组12只BALB/c小鼠，共24只，详细分组如下图所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

实验组	数目	免疫方式	免疫次数	免疫剂量	免疫佐剂
						CTB-Emy162	12	腹腔注射	4次	100μg/只	弗氏佐剂
PBS	12	腹腔注射	4次	100μg/只	弗氏佐剂

免疫方式：用75% 酒精对小鼠腹部消毒，然后腹腔注射重组蛋白和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2和3周加弗氏不完全佐剂，第4周直接注射重组蛋白溶液加强免疫。

抗血清的采集：在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，－80℃冻存备用。

（2）抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原Emy162、Emy162特异性抗原表位小肽（E_7-13、E_129-139）、PBS用包被液稀释成5μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清（鼠抗CTB-Emy162抗血清、和鼠抗CTB抗血清）和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:2000），100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

结果：Emy162的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，CTB-EMY162亚单位疫苗能够产生针对Emy162抗原的IgG抗体，而PBS免疫组不能产生针对Emy162抗原的IgG抗体；E_7-13及E_129-139包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，CTB-EMY162亚单位疫苗能产生针对Emy162特异性抗原表位肽E_7-13及E_129-139的IgG抗体，而PBS不能产生针对Emy162特异性抗原表位肽E_7-13及E_129-139的IgG抗体（图7，8）。上述结果说明亚单位疫苗CTB-Emy162能够刺激机体产生针对Emy162的高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性。

（3）小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75%酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏（暗红色）。在20 ml的无菌小烧杯中放入4~5 ml EZ-Sep™ Mouse 1X 淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入到淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μl的1640培养基；800 g离心30 min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液（5 x 10⁴/ml）。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入CTB-Emy162、E_7-13、E_129-139、PBS（20μg/ml），终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃ 5% CO₂培养箱中培养48h后，向各孔中加入MTT溶液（5mg/ml）30μl，继续培养4h后，轻轻吸出上清，每孔加入DMSO 100μl振荡混匀后用酶标仪读取 OD₅₇₀值。

结果：多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞，经CTB-Emy162、E_7-13、E_129-139刺激均均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答（图9）。

（4）抗血清中特异性抗体分型的ELISA检测

将抗原Emy162、PBS用包被液稀释成5μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a，抗体稀释液稀释，稀释比例（1:2000），100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。

结果：如（图10）所示，PBS免疫对照组相比，多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-EMY162能够产生抗Emy162的IgG1、IgGA和IgG2a抗体。

Claims

1.一种多房棘球蚴亚单位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基（CTB）和棘球蚴表面抗原Emy162构成，其氨基酸序列如序列1所示。

2.如权利要求1所述，一种多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162，其核苷酸序列如序列2所示。

3.一种多房棘球蚴表面抗原Emy162的氨基酸序列如序列3所示。

4.如权利要求3所述，多房棘球蚴表面抗原Emy162的核苷酸序列如序列4所示。

5.包含权利要求2和4中所述的核苷酸序列的表达载体，转基因细胞系及宿主菌。

6.如权利要求1所述，霍乱毒素B亚基（CTB）和多房棘球蚴表面抗原Emy162之间的间隔序列为DPRVPSS。

7.一种多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法，通过基因合成技术合成多房棘球蚴表面抗原Emy162的核苷酸序列，将其融合在霍乱毒素B亚基（CTB）基因的下游，构建含有融合基因CTB-Emy162的重组表达载体pET28a-CTB-Emy162及其重组基因工程菌BL-21(DE3)，

重组基因工程菌株发酵后，经Ni-NTA镍离子交换层析纯化，获得该疫苗的融合蛋白CTB-Emy162。

8.按照权利要求1和6所述的多房棘球蚴亚单位疫苗，其特征在于能够激发机体产生针对多房棘球蚴T细胞免疫应答和有效抑制多房棘球蚴的高滴度特异性抗体。

9.按照权利要求1和7所述的多房棘球蚴亚单位疫苗，其特征是可以用作预防和治疗多房棘球蚴感染的药物组合。