CN106047908A - 靶向人jnk1基因的小干扰rna及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种治疗牙髓炎的靶向人JNK1基因的小干扰RNA序列及其应用，所述的小干扰RNA包括正义链和反义链，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明获得的小干扰RNA序列未见于以往公开的报道，能在JNK1基因的转录后进行干扰，降低炎症牙髓干细胞中p‑JNK的表达，特异性降低牙髓干细胞的凋亡，促进牙髓干细胞的成牙本质分化，为牙髓炎提供新的治疗方案。

Description

靶向人JNK1基因的小干扰RNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种治疗牙髓炎的靶向人JNK1基因的小干扰RNA序列及其应用。
背景技术
牙髓炎是最常见的口腔疾病之一，主要症状是疼痛，不及时治疗可引起根尖周炎、颌骨囊肿等，影响患者的口腔功能、美观、发音和心理状态，甚至成为病灶，引起低热、肾炎、心肌炎、虹膜睫状体炎、类风湿关节炎等多种疾病，影响全身健康。龋病是引起牙髓炎的主要病因之一，细菌感染及炎性细胞的浸润造成牙本质破坏，此时机体可形成修复性牙本质避免牙髓受到细菌及其毒素的刺激，以维持牙体结构的完整性，但是由于牙本质的修复速度较牙本质的破坏速度缓慢，从而导致牙体结构破坏，最终导致牙髓炎的发生。根管治疗是目前临床上最常用的治疗方法，但治疗后的牙齿脆性增加、易折裂，限制其广泛使用。因此，充分认识炎症状态下修复性牙本质的形成机理及调节机制，对于防治牙髓炎的发生和发展具有重要意义。
c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)又被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)是MAPK(mitogen-activated proteinkinase，丝裂原活化蛋白激酶)家族主要部分，包括JNK1、JNK2和JNK3三个成员，在组织中广泛表达。在MAPK信号转导过程中JNK可由上游激酶MKK4/SEK1和JNKK2/MKK7激活，活化的JNK可经核转位进入细胞核，通过磷酸化调节转录因子的活性，产生一系列广泛而重要的生物学效应，包括炎症发生、细胞生长、增殖、分化、细胞周期阻滞及细胞凋亡等。先前的研究发现JNK激活与牙髓细胞的成牙本质分化相关。重组人牙本质涎蛋白(Recombinant humandentin sialoprotein，RH-DSP)能增强JNK的磷酸化，进而导致牙髓细胞的成牙本质分化增加。Luo等研究发现，JNK抑制剂SP600125能显著降低牙髓干细胞(dental pulp stemcells，DPSCs)的成牙本质分化能力(Luo Z,Kohli MR,Yu Q,Kim S,Qu T,and He WX,Biodentine induces human dental pulp stem cell differentiation throughmitogen-activated protein kinase and calcium-/calmodulin-dependent proteinkinase II pathways.J Endod.2014；40(7):937-942.)。胸腺素β-4活化的DPSCs中，JNK的磷酸化增强，当加入JNK抑制剂后，成牙本质分化水平降低。上述结果显示JNK活化可以促进DPSCs成牙本质分化。JNK与炎症和细胞凋亡密切相关，在慢性牙周炎的牙龈组织中，JNK表达增加。在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激的牙髓细胞中，茶多酚可通过抑制JNK的活化抑制炎症反应。在镉诱导的H460细胞凋亡的过程中，JNK蛋白磷酸化水平明显增高。临床中洛伐他汀治疗心血管疾病诱导巨噬细胞凋亡是通过Rac/Cdc42/JNK通路完成的。另外JNK活化后可进入线粒体，切割Bid蛋白，促进其向线粒体转移，激活Bax，促进细胞色素C的释放，从而促进细胞凋亡。
RNA干扰(RNA interference，RANi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象，能特异干扰靶基因的表达。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-25nt及3’端突出的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而抑制相应基因表达。目前已成为一门独立的技术，作用靶点特异性高、对细胞毒性小、相对安全，引起生物医学界所有研究领域的广泛兴趣。
发明内容
本发明的目的在于以最新的JNK1基因序列为靶点，提供一种治疗牙髓炎的新的特异性抑制人JNK1基因表达的小干扰RNA序列及其应用。
本发明的第一方面，提供一种靶向人JNK1基因的小干扰RNA的靶标基因，所述的靶标基因的核苷酸序列为5’-GTCGGTTAGTCATTGATAG-3’，如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面，提供一种靶向人JNK1基因的小干扰RNA，由下述正义链和反义链组成：
正义链：5’-GAGUCGGUUAGUCAUUGAUAG-3’(SEQ ID NO:2)；
反义链：5’-CUAUCAAUGACUAACCGACUC-3’(SEQ ID NO:3)。
本发明的第三方面，提供上述靶向人JNK1基因的小干扰RNA的靶标基因在制备治疗牙髓炎药物中的应用。
本发明的第四方面，提供上述靶向人JNK1基因的小干扰RNA在制备治疗牙髓炎药物中的应用。
所述的靶向人JNK1基因的小干扰RNA特异性降低牙髓干细胞的凋亡，促进牙髓干细胞成牙本质分化。
本发明的第五方面，提供一种治疗牙髓炎的药物组合物，所述的药物组合物包括上述靶向人JNK1基因的小干扰RNA和药学上可接受的载体。
所述的药学上可接受的载体为药学上可接受的赋形剂，悬浮剂，填充剂和/或稀释剂。
本发明优点在于：
本发明获得的小干扰RNA序列未见于以往公开的报道，能在JNK1基因的转录后进行干扰，降低炎症牙髓干细胞中p-JNK的表达，特异性降低牙髓干细胞的凋亡，促进牙髓干细胞的成牙本质分化，可为治疗牙髓炎提供新的方案。
附图说明
图1是siRNA对牙髓干细胞JNK1蛋白的下调作用。(图示为Western blot检测JNK1蛋白表达量，依次为空白组，对照组和siRNA组；GAPDH为内参。提示该siRNA能显著降低JNK1蛋白的表达。)
图2是western blot检测siRNA对牙髓干细胞在重度炎症下成牙本质分化的影响。结果表明：A为在不同浓度炎症因子TNF-a作用下，牙髓干细胞的成牙本质能力以浓度依赖方式降低，成牙本质标记物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dental matrix protein-1,DMP1)的表达以浓度依赖的方式降低。B为siRNA作用后能明显恢复牙髓干细胞在炎症刺激下的成牙本质分化能力，特别是在100ng/mlTNF-a刺激下。提示该siRNA具有促成牙本质分化能力。
图3是ALP染色检测siRNA对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响。结果显示为A为牙髓干细胞在不同浓度TNF-a刺激下成牙本质分化培养14天后ALP染色结果明显降低。B高浓度炎症100ng/ml TNF-a作用下，与对照组相比，给与siRNA后能更明显恢复牙髓干细胞的成牙本质分化能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明所有方法中未注明具体条件的实验方法，所用试剂如无特殊说明均购自Invitrogen，干扰序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。实施例中的实验方法通常按照常规条件，参考分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1：靶向人JNK1基因特异性干扰序列的获得
根据NCBI公开的人JNK1基因序列(GenBank:JN257262.1)设计siRNA序列，具体设计参考美国Invitrogen公司网站(其网站http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/sort.do)提供的RNAi在线设计软件，经过比对筛选获得含19个碱基的靶基因序列：5’-GTCGGTTAGTCATTGATAG-3’(SEQID NO:1)，对应的siRNA干扰序列由上海吉玛制药技术有限公司合成，具体如下：
正义链：5’-GAGUCGGUUAGUCAUUGAUAG-3’(SEQ ID NO:2)
反义链：5’-CUAUCAAUGACUAACCGACUC-3’(SEQ ID NO:3)
实施例2：牙髓干细胞培养及Western blot检测siRNA对JNK1蛋白表达的效果
1)实验过程中的牙髓细胞来源于临床上正常以及龋病的第三磨牙和因正畸需要拔除的第二前磨牙，患者年龄15-25岁，患者全身情况良好。取得入组人员知情同意，并经南通大学附属医院医学伦理委员会批准。将拔除的牙齿立即放入冰袋预冷的基础DMEM培养液中(含100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素)。在超净台上用碘伏冲洗牙齿表面后，用无菌生理盐水冲洗牙齿的表面至无血迹，用消毒后的咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，剪去根部的牙髓组织。用3mg/mLⅠ型胶原酶与4mg/mL的分散酶以1:1比例混合，两种酶以1:10的体积与剪碎的牙髓混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中离心，1000rpm/min离心5分钟，弃去上清液，加完全培养基，混匀、吹打，经70μm的细胞金属网过滤，获得的细胞悬浮液接种于10cm培养皿中，加入完全培养液(10％胎牛血清、DMEM、1％谷氨酸、1％青霉素/链霉素)。培养条件：相对湿度100％，5％CO2，37℃。3-4天半量换液，细胞融合达到70％-80％后，室温条件下，0.25％胰蛋白酶消化3分钟，1000r/m离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次。选3代的细胞进行实验。
2)siRNA转染。实验分为空白组(不含转染试剂的正常细胞培养液)、对照组(阴性对照购买自Santa Cruz，sc-37007)、siRNA组(合成的小干扰RNA序列)。以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于6孔板，培养至细胞融合度大于40％。用250ul无血清培养液(Opti-MEM)稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM)，轻轻吹吸混匀。用250ul Opti-MEM稀释5ul Lipofectamine TM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置10min。混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸混匀，室温下静置20min。500ul转染复合物与1.5ml无血清DMEM混合后加入到24孔细胞板(100ul/孔)，轻摇细胞板混合均匀。置于37℃、5％CO2培养箱。转染24h后换培养液，按常规条件继续培养。
3)Western blot检测JNK1蛋白表达。牙髓干细胞转染24h后，吸去培养基，PBS清洗细胞1-2次，向细胞中加100ulRIPA裂解液，收集细胞至1.5ml管中，冰上静置30min，离心12000rpm，30min取上清，制备成蛋白样品供分析。将制备的蛋白加入上样缓冲液RSB，用100℃煮沸5min后，立即移入冰上冷却，作为电泳的上样样品。用5％浓缩胶和10％分离胶电泳分离，上样量为20ug/泳道，电泳电压，浓缩胶为70V，分离胶为100V，电泳时间约2.5h。内参为GAPDH。
结果显示：提示该siRNA能显著降低JNK1蛋白的表达(见图1)。
实施例3：Western blot检测siRNA对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响(DPSS、DMP-1蛋白表达)
1)以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于6孔板，每孔200ul。37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，弃上清，每孔加入400ul血清培养基，转染4h(如前所述实验分为空白组、对照组、siRNA组)。
2)牙髓干细胞转染24h后，吸去培养基，PBS清洗细胞1-2次，向细胞中加100ulRIPA裂解液，收集细胞至1.5ml管中，冰上静置30min，离心12000rpm，30min取上清，制备成蛋白样品供分析。将制备的蛋白加入上样缓冲液RSB，用100℃煮沸5min后，立即移入冰上冷却，作为电泳的上样样品。用5％浓缩胶和10％分离胶电泳分离，上样量为20ug/泳道，电泳电压，浓缩胶为70V，分离胶为100V，电泳时间约2.5h。内参为GAPDH。
结果表明：A为在不同浓度炎症因子TNF-a作用下，牙髓干细胞的成牙本质能力以浓度依赖方式降低，成牙本质标记物DSPP、DMP1的表达以浓度依赖的方式降低。B为siRNA作用后能明显恢复牙髓干细胞在炎症刺激下的成牙本质分化能力，特别是在100ng/mlTNF-a刺激下。提示该siRNA具有促成牙本质分化能力(见图2)。
实施例4：ALP染色法检测siRNA对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响
1)以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于6孔板，每孔200ul。37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，弃上清，每孔加入400ul血清培养基，转染4h(如前所述实验分为空白组、对照组、siRNA组)。
2)染色。弃上清，每孔加入200ulPBS清洗细胞1-2次，避光下用固定A液固定细胞3min，置于37℃烘箱中；吸净固定液，避光下用染色B液染细胞15min，置于37℃烘箱中；吸净B液，再用复染D液染细胞5min，同样置于37℃烘箱中。最后用PBS清洗3-5次。拍照。
结果显示为：A为牙髓干细胞在不同浓度TNF-a刺激下成牙本质分化培养14天后ALP染色结果明显降低。B高浓度炎症100ng/ml TNF-a作用下，与对照组相比，给与siRNA后能更明显恢复牙髓干细胞的成牙本质分化能力(见图3)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种靶向人JNK1基因的小干扰RNA的靶标基因，其特征在于，所述的靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种靶向人JNK1基因的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA包括正义链和反义链，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的反义链的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的靶向人JNK1基因的小干扰RNA的靶标基因在制备治疗牙髓炎药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的靶向人JNK1基因的小干扰RNA在制备治疗牙髓炎药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的靶向人JNK1基因的小干扰RNA在制备治疗牙髓炎药物中的应用，其特征在于，所述的靶向人JNK1基因的小干扰RNA特异性降低牙髓干细胞的凋亡，促进牙髓干细胞成牙本质分化。
6.一种治疗牙髓炎的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求2所述的靶向人JNK1基因的小干扰RNA和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的治疗牙髓炎的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体为药学上可接受的赋形剂，悬浮剂，填充剂和/或稀释剂。
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