CN106047687B - 核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置及其进行dna浓度检测的方法 - Google Patents

核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置及其进行dna浓度检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置及其进行DNA浓度检测的方法；该装置设置由超声波振动***驱动的微液滴产生***；微液滴产生***上设置多个加样孔；超声波振动***产生振荡，使微液滴产生***中的PCR样品与油滴混合形成油包裹微液滴后进入聚合反应***；该方案使微液滴的产生、聚合反应以及荧光数据的读取在一台设备上进行，避免了样本的丢失，方便、准确、快捷；能有效满足对DNA进行体外放大的温度梯度的要求，显著提高生物化学反应的速度，节省时间、提高效率，便于批量化、低成本生产；实现PCR扩增循环微流控生物荧光进行实时荧光信息反馈；更加自动化、微型化，缩短了***工作周期；避免了样品信号采集的遗失。

Description

核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置及其进行DNA浓度检测 的方法
技术领域
本发明属于生物工程实验仪器设备的技术领域，涉及属于PCR试剂的扩增、荧光测量检测技术，更具体地说，本发明涉及核糖核酸链式聚合扩增反应的数据处理一体化的检测装置。另外，本发明还公开了该检测装置的检测方法。
背景技术
PCR技术(DNA Polymerase Chain Reaction：DNA聚合酶链式反应)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，最早是Khorana于1971年提出这个设想。美国科学家KaryMullis等在1985年实现了这个设想，发明了具有划时代意义的PCR技术。应用该技术可以在一个试管内将所要研究的目的基因在数小时内扩增至十万乃至百万倍，便于肉眼能直接观察和判断。由于这种体外核酸扩增技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，因此得到了生命科学界的普遍认可，Kary Mullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR是最常用的分子生物学手段之一。除去在基础科研的领域，PCR在医学临床诊断、生命科学、医学工程、遗传科学、农业选种育钟研发，以及刑事检定甄别中都是必不可少的，也是最权威可靠的技术。
DNA聚合酶链式反应(PCR)：是通过热循环反应来扩增DNA的技术。热循环是指在固定的时间间隔内温度变化的循环。采用热稳定的DNA聚合酶，PCR可以用DNA的合成原料，脱氧核苷三磷酸合成大量的DNA拷贝。PCR反应包括三步：变性、退火和延伸。变性是PCR循环的第一步，它将DNA碱基之间的氢键打开来熔解DNA双链而产生单链DNA。退火则是将温度降到足够低，使寡聚核苷酸引物能够结合到DNA模板上。在延伸过程中，DNA聚合酶将合成新的双链DNA。经多次热循环后(每一循环扩增一倍)，微量的DNA将得以扩增到仪器检测的浓度。
通常的PCR检测技术有两种：
第一种是多循环聚合反应后，终产物(end-point analysis)由DNA电泳胶来检测定量。缺点是因受电泳技术灵敏度的限制，这种方法只是“半定量”。
第二种方法是：利用荧光标记的探针(fluorescent probes)，实时监测聚合反应在每一循环的产量变化。起始要扩增模板的数量可由cycle threshold(Ct)值来推算得出。Ct值就是当荧光值明显高于背景本底时的循环数。
目前市场上销售的real-time PCR试剂主要是基于荧光探针的TaqMan和基于SYBRGreen染料嵌合来测DNA双链总量的两种技术。该方法的局限在于：1、需要外源标准样品或者内源基因来标准化以绘定标准曲线。2、非特异反应引起的扩增将影响Ct值的可信度。
研究人员发现以下三因子与聚合反应成功与否有相关性：1、样品的有限稀释度；2、终产物总量；3、产物量与起始DNA浓度的帕松分布(Poisson distribution)关系。
通过调控和测量上述因子就可以推算出起始DNA的样本浓度。
发明内容
本发明提供核糖核酸链式聚合扩增反应的数据处理一体化检测装置，其目的是实现其检测方法的更加方便、快捷和准确。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明的核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置，包括聚合反应***，所述的检测装置设置微液滴产生***，所述的微液滴产生***由超声波振动***驱动；所述的微液滴产生***上设置多个加样孔；所述的超声波振动***产生振荡，使所述的微液滴产生***中的PR样品与油滴混合形成油包裹微液滴后进入所述的聚合反应***。
所有所述的加样孔的规格一致，且每个所述的加样孔均设有油库、样品库和微液滴库。所述的油库、样品库和微液滴库均为圆筒形，三者之间通过管道连接。
所述的检测装置设置智能温控***；所述的智能温控***对所述的聚合反应***的温度进行实时控制。
所述的智能温控***包括温度采集器、温度传感器、单片机、多路模拟开关、A/D转换器、D/A转换器和显示器。所述的温度采集器、温度传感器集成为一个芯片固定装置；所述的单片机通过信号线路与A/D转换器、D/A转换器和显示器连接；所述的A/D转换器与多路模拟开关通过信号线路连接；所述的D/A转换器与驱动电路通过信号线路连接；所述的多路模拟开关和驱动电路均与芯片固定装置连接。
所述的检测装置设置激光发射***；所述的激光发射***包含激光光源以及激发光整形器；所述的激发光整形器使得从所述的激光光源发出的线光源经所述的激发光整形器整形后呈现一个面光源，对所述的聚合反应***的PR样品进行照射。
所述的检测装置设置荧光探测采集***；所述的荧光探测采集***包含和微液滴产生***相同孔数的探测器；所述的探测器探测方向与所述的聚合反应***的微通道一一对应。
所述的检测装置设置信号分析***，所述的荧光探测采集***探测采集到的荧光信号传送给所述的信号分析***
所述的荧光探测采集***包含光学透镜、滤光片以及光电转换器。
所述的检测装置设置废液排出***；所述的废液排出***为管状，将反应结束后的所有废液排除至废液盒。
所述的聚合反应***包括微通道列、加热丝、绝缘塑料；所述的加热丝分别置于不同微通道列的底部；所述的聚合反应***的温度按设定时间控制在不同的温度区间进行PR扩增。
为了实现与上述技术方案相同的发明目的，本发明还提供了以上所述的核糖核酸链式聚合扩增反应的数据处理一体化检测装置的检测方法，其技术方案是：
将油滴和PR样本加入微液滴产生***，开启超声波振动***，微液滴产生***开始振动，使油滴和PR样本形成油包裹液滴并进入聚合反应***；
然后开启智能温控***，智能温控***使聚合反应***的温度按设定时间控制在不同的温区进行PR扩增；同时开启激光发射***和荧光探测采集***，由信号分析***进行实时数据读取和分析；
实验结束后，开启聚合反应的阀门，使废液从废液排出***流出，进入废液盒。
本发明采用上述技术方案，使微液滴的产生、聚合反应以及荧光数据的读取在一台设备上进行，避免了样本的丢失，方便、准确、快捷；温控装置可以对三个温区进行独立设置，控制和实时显示，能有效满足对DNA进行体外放大的温度梯度的要求；易于快速实现PCR扩增，显著提高生物化学反应的速度，既节省时间、提高了效率，又便于批量化、低成本生产；实现PCR扩增循环微流控生物荧光进行实时荧光信息反馈；减少了***设备，更加自动化、微型化，缩短了***工作周期；避免了样品信号采集的遗失。
附图说明
附图内容及图中标记简要说明如下：
图1为本发明的微液滴流动型高通量核糖核酸链式聚合扩增反应的数据处理一体化检测装置的结构示意图；
图2为图1中的加样孔示意图；
图3为图1中的微通道列示意图；
图4为图1中的激发光整形器示意图；
图5为图1中的激光光源示意图；
图6是本发明中的智能温控***的结构示意图。
图中的标记为：
A、微液滴产生***，B、超声波振动***，C、聚合反应***，D、智能温控***，E、激光发射***，F、荧光探测采集***，G、阀门，H、废液排出***，L、信号分析***，M、废液盒，a、加样孔，b、微通道列，c、激发光整形器，d、激光光源，1、油库，2、样品库，3、微液滴库，4、微管道，5、短焦距透镜，6、长焦距透镜，7、激光电源，8、激光器，9、光纤耦合器。
具体实施方式
下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
如前所述，与聚合反应成功与否有相关性的因素包括：1、样品的有限稀释度；2、终产物总量；3、产物量与起始DNA浓度的帕松分布(Poisson distribution)关系。通过调控和测量上述因子就可以推算出起始DNA的样本浓度。
基于这一原理，本发明提供了如图1所示的结构，为一种微液滴流动型高通量核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置，广泛应用于分子生物学、遗传及医学检测领域。该检测装置包括聚合反应***C。该检测装置涉及微液滴产生***、超声波振动***、聚合反应***、智能温控***、荧光探测采集分析***和废液排出***等方面。该装置包含了生物芯片技术、生物信息技术、计算机软硬件技术以及微流控技术。
为了克服现有技术的缺陷，实现核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置的检测方法的方便、准确、快捷发明目的，本发明采取的技术方案为：
如图1所示，本发明的核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置，所述的检测装置设置微液滴产生***A，所述的微液滴产生***A由超声波振动***B驱动；所述的微液滴产生***A上设置多个加样孔a；所述的超声波振动***B产生振荡，使所述的微液滴产生***A中的PCR样品与油滴混合形成油包裹微液滴后进入所述的聚合反应***C。
加样孔a的结构如图2所示。
超声波振动***B利用超声波的高频声波产生振荡。其实，该装置不限于超声波振动亦包含机械振动等各种振动方式。
微液滴产生***A上设有256个加样孔。***上的加样孔a可以是256个，也可以是96孔等不同数量。
所有所述的加样孔a的规格一致，且每个所述的加样孔a均设有油库1、样品库2和微液滴库3。所述的油库1、样品库2和微液滴库3均为圆筒形，三者之间通过管道连接。
管道为曲线形状，液体在管道振动时，液滴在内部流动，产生微液滴。
加样孔a分为油库和加样槽，呈锥型，当微液滴产生***振动时，PCR样品和油库内的油进行混合，产生油包裹微液滴。
如图6所示，所述的检测装置设置智能温控***D；所述的智能温控***D对所述的聚合反应***C的温度进行实时控制。
所述的智能温控***D包括温度采集器、温度传感器、单片机、多路模拟开关、A/D转换器、D/A转换器和显示器。
所述的温度采集器、温度传感器集成为一个芯片固定装置；所述的单片机通过信号线路与A/D转换器、D/A转换器和显示器连接；所述的A/D转换器与多路模拟开关通过信号线路连接；所述的D/A转换器与驱动电路通过信号线路连接；所述的多路模拟开关和驱动电路均与芯片固定装置连接。
智能温控***D对聚合反应***C的温度进行实时控制。
所述的检测装置设置激光发射***E；所述的激光发射***E包含激光光源d以及激发光整形器c；所述的激发光整形器c使得从所述的激光光源d发出的线光源经所述的激发光整形器c整形后呈现一个面光源，对所述的聚合反应***C的PCR样品进行照射。
激发光整形器c的结构如图4所示。激光光源d的结构如图5所示。
微管道4微通道是毛细血管装液体通道，短焦距透镜5在长焦距透镜6的前面，二者之间的距离是二者的焦距之和；激光器8在短焦距透镜5的前面，光纤耦合器9在短焦距透镜5和激光器8之间。激光器8发出激光后通过光纤耦合器9对激光束进行耦合，然后通过短焦距透镜5和长焦距透镜6进行扩束。
激光电源7为激光器8提供电源。
一个能够发出连续的可见光的点状发光源，如果它的光在空间中只向一个方向成线性传播，那么这个发光点就被称为线光源。
面光源是光束输出后成一个面，而不是一条线。
所述的检测装置设置荧光探测采集***F；所述的荧光探测采集***F包含和微液滴产生***A相同孔数的探测器；所述的探测器探测方向与所述的聚合反应***C的微通道一一对应。
荧光检测仪器是一个由电路、光路组成的多体***，各个***的协调配合实现稳定检测的基础，是比较成熟的光学检测设备。
所述的荧光探测采集***F包含光学透镜、滤光片以及光电转换器。
所述的检测装置设置信号分析***L，所述的荧光探测采集***F探测采集到的荧光信号传送给所述的信号分析***L
所述的检测装置设置废液排出***H；所述的废液排出***H为管状，将反应结束后的所有废液排除至废液盒M。
所述的聚合反应***C包括微通道列b、加热丝、绝缘塑料；所述的加热丝分别置于不同微通道列b的底部；所述的聚合反应***C的温度按设定时间控制在不同的温度区间进行PCR扩增。
微通道列b的结构如图3所示。其中包括多个微管道4。
微通道列是毛细血管装液体通道，加热丝是曲线形金属丝，加热丝在微通道的下面。
综上所述，本发明包括了：微液滴产生***A、超声波振动***B、聚合反应***C、智能温控***D、激光发射***D、荧光探测采集***F、信号分析***L和废液排出***H。
本发明的优点是：
1、微液滴的产生、聚合反应以及荧光数据的读取在一个设备上进行，避免了样本的丢失，方便、准确、快捷；
2、温控装置可以对三个温区进行独立设置，控制和实时显示，能有效满足对DNA进行体外放大的温度梯度的要求；
3、易于快速实现PCR扩增，显著提高生物化学反应的速度，即节省时间又提高了效率，便于批量化、低成本生产；
4、实现了PCR扩增循环微流控生物荧光进行实时荧光信息反馈；
5、减少了***设备，更加自动化、微型化，缩短了***工作周期；
6、避免了样品信号采集的遗失。
为了实现与上述技术方案相同的发明目的，本发明还提供了以上所述的核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置的检测方法，其技术方案是：
将油滴和PCR样本加入微液滴产生***A，开启超声波振动***B，微液滴产生***A开始振动，使油滴和PCR样本形成油包裹液滴并进入聚合反应***C；
然后开启智能温控***D，智能温控***D使聚合反应***C的温度按设定时间控制在不同的温区进行PCR扩增；同时开启激光发射***E和荧光探测采集***F，由信号分析***L进行实时数据读取和分析；
实验结束后，开启聚合反应的阀门G，使废液从废液排出***H流出，进入废液盒M。
按照以上所述的方案，本发明的具体实现方式是：所述检测装置中的微液滴产生***上有256个加样孔，利用超声波的高频声波产生振荡，使微液滴产生***中的PCR样品和油滴混合形成油包裹微液滴后进入聚合反应***；通过温控***使聚合反应***的温度按设定时间控制在不同的温区(94℃、55℃、72℃)进行PCR扩增；激光发射***采用的是紫外光激发；荧光探测采集分析***对样品的荧光信号进行收集、分析处理；实验结束后废液从废液排出***流出。
实验结果表明：整个装置可以实现微液滴的产生、聚合反应、荧光数据的读取分析以及废液排出等一系列功能，实验方便、快捷。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置，包括聚合反应***(C)，其特征在于：
所述的检测装置设置微液滴产生***(A)，所述的微液滴产生***(A)由超声波振动***(B)驱动；所述的微液滴产生***(A)上设置多个加样孔(a)；所述的超声波振动***(B)产生振荡，使所述的微液滴产生***(A)中的PCR样品与油滴混合形成油包裹微液滴后进入所述的聚合反应***(C)；
所述的检测装置设置智能温控***(D)；所述的智能温控***(D)对所述的聚合反应***(C)的温度进行实时控制；
所述的智能温控***(D)包括温度采集器、温度传感器、单片机、多路模拟开关、A/D转换器、D/A转换器和显示器；所述的温度采集器、温度传感器集成为一个芯片固定装置；所述的单片机通过信号线路与A/D转换器、D/A转换器和显示器连接；所述的A/D转换器与多路模拟开关通过信号线路连接；所述的D/A转换器与驱动电路通过信号线路连接；所述的多路模拟开关和驱动电路均与芯片固定装置连接；
所述的检测装置设置激光发射***(E)；所述的激光发射***(E)包含激光光源(d)以及激发光整形器(c)；所述的激发光整形器(c)使得从所述的激光光源(d)发出的线光源经所述的激发光整形器(c)整形后呈现一个面光源，对所述的聚合反应***(C)的PCR样品进行照射；
所述的检测装置设置荧光探测采集***(F)；所述的荧光探测采集***(F)包含和微液滴产生***(A)相同孔数的探测器；所述的探测器探测方向与所述的聚合反应***(C)的微通道一一对应；
所述的检测装置设置信号分析***(L)，所述的荧光探测采集***(F)探测采集到的荧光信号传送给所述的信号分析***(L)；
所述的聚合反应***(C)包括微通道列(b)、加热丝；所述的加热丝分别置于不同微通道列(b)的底部；所述的聚合反应***(C)的温度按设定时间控制在不同的温度区间进行PCR扩增。
2.按照权利要求1所述的核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置，其特征在于：每个所述的加样孔(a)均设有油库(1)、样品库(2)和微液滴库(3)；所述的油库(1)、样品库(2)和微液滴库(3)均为圆筒形，三者之间通过管道连接。
3.按照权利要求1所述的核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置，其特征在于：所述的检测装置设置废液排出***(H)；所述的废液排出***(H)为管状，将反应结束后的所有废液排除至废液盒(M)。
4.利用权利要求1至3中任一项所述的核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置进行DNA浓度检测的方法，其特征在于该方法是：
将油滴和PCR样本加入微液滴产生***(A)，开启超声波振动***(B)，微液滴产生***(A)开始振动，使油滴和PCR样本形成油包裹液滴并进入聚合反应***(C)；
然后开启智能温控***(D)，智能温控***(D)使聚合反应***(C)的温度按设定时间控制在不同的温区进行PCR扩增；同时开启激光发射***(E)和荧光探测采集***(F)，由信号分析***(L)进行实时数据读取和分析；
实验结束后，开启聚合反应的阀门(G)，使废液从废液排出***(H)流出，进入废液盒(M)。
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