CN106029087A - 脂质化肠降血糖素受体配体人免疫球蛋白fc区融合多肽 - Google Patents
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Abstract
本文报告了包含以下的融合多肽：i)1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和ii)1个人免疫球蛋白Fc区，其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个包含与脂质共价缀合的氨基酸，且其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
Description
相关申请的交叉引用
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发明领域
本文报告了脂质化肠降血糖素受体配体人免疫球蛋白Fc区融合多肽及其用途。
发明背景
促胰岛素多肽具有促胰岛素活性，即具有刺激激素胰岛素合成或表达或引起激素胰岛素合成或表达的刺激的能力。促胰岛素肽包括但不限于GLP-1、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4及其前体、衍生物或片段。
胰高血糖素原来源的肽，包括胰高血糖素和胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)，存在于参与不同生理功能的许多代谢途径，例如胰岛素分泌和食物摄取调节。
前胰高血糖素原是158个氨基酸的多肽，其被加工成多种不同的活性化合物。例如GLP-1，相当于前胰高血糖素原的氨基酸残基72-108。除其它功能以外，GLP-1还引起胰岛素合成和分泌的刺激以及食物摄取的抑制。已显示GLP-1减轻糖尿病患者的高血糖症(葡萄糖水平升高)。
葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)是42个氨基酸的胃肠调节肽，其在葡萄糖存在下刺激胰岛素从胰β细胞中分泌。它通过蛋白水解加工来源于133个氨基酸的前体pre-pro-GIP。
在WO 2010/011439中，报告了用于治疗代谢障碍和肥胖症的基于GIP的混合激动剂。据报告，对天然胰高血糖素序列的修饰产生可显示等于或好于天然胰高血糖素的活性的强效胰高血糖素活性、等于或好于天然GIP的活性的强效GIP活性和/或等于或好于天然GLP-1的活性的强效GLP-1活性的胰高血糖素肽。据报告，所提供的数据表明具有GIP活性和GLP-1活性两者的肽对于诱导体重减轻或防止体重增加以及对于治疗高血糖症(包括糖尿病)特别有利，由此GIP激动剂活性与GLP-1激动剂活性的组合比单独GLP-1对体重减轻产生更大的作用。
在例如WO 2010/011439、US 6,329,336和US 7,153,825中假设地概述了促胰岛素多肽与抗体或抗体片段的缀合。
Fortin, J-P.等人(PlosOne 6 (2011) e24693)报告了肠降血糖素受体的双重作用膜锚定调节剂(dual-action membrane-anchored modulator)的发现。Finan，B.等人报告了单分子二重肠降血糖素在啮齿动物、猴和人中使代谢益处达到最大(Sci. Transl.Med. 5 (2013) 209ra151)。
发明概述
本文报告的一方面为包含以下的融合多肽
- 1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个包含与脂质共价缀合的氨基酸，和
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
在一个实施方案中，融合多肽体内与内源多肽缔合。
在一个实施方案中，与脂质的缀合通过氨基酸侧链上的官能团。
在一个实施方案中，与脂质共价缀合的肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸残基是非天然存在的氨基酸残基。
在一个实施方案中，脂质选自脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂质、异戊烯醇脂质(prenol lipid)、糖脂和聚酮化合物。
在一个实施方案中，与脂质的缀合选自豆蔻酰化(14:0)、棕榈酰化(16:0)、异戊二烯化、辛酰化(octaonylation)、archaeolyation、胆甾醇化(cholesterylation)。
在一个优选的实施方案中，与脂质的缀合是棕榈酰化。
在一个实施方案中，
i) 假如肠降血糖素受体配体多肽通过其C端与人免疫球蛋白Fc区缀合，则氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 75)，任选LPETG (SEQ ID NO: 74)在肠降血糖素受体配体多肽的C端和人免疫球蛋白Fc区的N端之间，和
ii)假如肠降血糖素受体配体多肽通过其N端与人免疫球蛋白Fc区缀合，则氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 75)，任选LPETG (SEQ ID NO: 74)在肠降血糖素受体配体多肽的N端和人免疫球蛋白Fc区的C端之间。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是天然存在的肠降血糖素受体配体多肽或合成的肠降血糖素受体配体多肽。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽包含选自SEQ ID NO: 1-39、76、77和120-125的氨基酸序列。
在一个实施方案中，融合多肽包含在肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸序列和人免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列之间的氨基酸序列LPETG (SEQ ID NO: 74)。
在一个实施方案中，融合多肽包含LPETG (SEQ ID NO: 74)的C端或N端的多肽Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 88)、Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 90)之一。
在一个实施方案中，融合多肽包含(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO: 57-60、88和89)，(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)或(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ IDNO: 65-67和92-94)。
在一个实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO: 57-67的任一个。
在一个实施方案中，融合多肽包含LPXTG (SEQ ID NO: 75)的C端或N端的Gly或Gly-Gly。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白Fc区是具有329位的氨基酸残基的突变和选自228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位的氨基酸残基的至少一个氨基酸成为不同残基的至少一个另外的突变的人免疫球蛋白Fc区，其中Fc区的残基按照Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，与包含野生型人免疫球蛋白IgG Fc区的人免疫球蛋白Fc区融合多肽相比，所述人免疫球蛋白Fc区与人FcγRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI的亲和力降低。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白Fc区包含至少一个选自以下的突变：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和P331S。
在一个优选的实施方案中，如果Fc区是人IgG1同种型的，则人免疫球蛋白Fc区包含突变L234A、L235A和P329G，或如果Fc区是人IgG4同种型的，则包含突变S228P、L235E和P329G。
在一个实施方案中，与由野生型人免疫球蛋白Fc区诱导的凝血细胞聚集相比，由所述人免疫球蛋白Fc区诱导的凝血细胞聚集减少。
在一个实施方案中，融合多肽包含1个或2个肠降血糖素受体配体多肽。
在一个优选的实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽的每一个与人免疫球蛋白Fc区的一个多肽链的N端缀合。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽的每一个与人免疫球蛋白Fc区的一个多肽链的C端缀合。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽彼此地独立选自GIP、GLP-1、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4、二重GIP-GLP-1激动剂、三重GIP-GLP-1-胰高血糖素受体激动剂、嵌合GIP/GLP激动剂及其前体、衍生物或功能片段。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白Fc区包含选自SEQ ID NO: 42-56的氨基酸序列。
在一个实施方案中，融合多肽包含在人免疫球蛋白Fc区和肠降血糖素受体配体多肽之间的接头，其中接头包含选自SEQ ID NO: 57-69和82-94的氨基酸序列。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1(7-37)(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，SEQ ID NO: 01)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1(7-36)(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR，SEQ ID NO: 02)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-3(HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS，SEQ ID NO: 03)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS，SEQ ID NO: 04)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于SEQ ID NO: 01-04的任一个，其中相对于SEQ ID NO: 01-04进行了1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(1-31)desGlu(17)Tyr(32) (HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY，SEQ ID NO: 05)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(1-30) Tyr(31) (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY，SEQ ID NO: 06)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(9-39)(DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS，SEQ ID NO: 07)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列SYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 08)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列SSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 09)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列VSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 10)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列DVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 11)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 12)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 13)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 14)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 15)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 16)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 17)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 18)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 19)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HDAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 20)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 21) (杂合GLP-1/毒蜥外泌肽多肽)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK (SEQ ID NO: 22)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK (SEQ ID NO: 23)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 24)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 25)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY (SEQ ID NO: 26)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY (SEQ ID NO: 27)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS (SEQ ID NO: 28)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于天然胰高血糖素(SEQ IDNO: 76)，其相对于SEQ ID NO: 76具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1 (SEQ ID NO: 1或2)，其相对于SEQ ID NO: 1或2具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于GIP (SEQ ID NO: 77)，其相对SEQ ID NO: 77具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-3或-4 (SEQ IDNO: 3或4)，其相对SEQ ID NO: 3或4具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个优选的实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽衍生于胰高血糖素(SEQ IDNO: 76)，其中类似物包含SEQ ID NO: 76，其具有(a)赋予GIP激动剂活性的1位的氨基酸修饰，(b)稳定类似物C端部分(氨基酸12-29)的α螺旋结构的修饰，和(c)任选相对于SEQ IDNO: 76的1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个另外的氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在某些实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰是提供或引入分子内桥(包括例如共价分子内桥)的修饰，例如描述于WO2010/011439中的任一种。在一些实施方案中，共价分子内桥是内酰胺桥。这些实施方案的类似物的内酰胺桥可以是本文所述内酰胺桥。参见例如WO2010/011439中在“α螺旋结构的稳定”部分中的内酰胺桥的教导。例如，内酰胺桥可以是介于在i和i+4位处的氨基酸的侧链之间或介于在j和j+3位处的氨基酸的侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，且其中j为17。在某些实施方案中，内酰胺桥可在16和20位处的氨基酸之间，其中16和20位处的氨基酸之一被Glu取代，16和20位处的氨基酸的另一个被Lys取代。
在备选的实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰是在类似物的16、20、21和24位处引入1、2、3或4个α,α-二取代的氨基酸。在一些实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是AIB。在某些方面，α,α-二取代的氨基酸(例如AIB)在20位处，16位处的氨基酸被带正电荷的氨基酸(例如本文描述的式IV的氨基酸)取代。式IV的氨基酸可以是高Lys、Lys、Orn或2,4-二氨基丁酸(Dab)。
在本发明的具体方面，1位的氨基酸修饰是His被没有咪唑侧链的氨基酸(例如大的芳族氨基酸(例如Tyr))取代。
在某些方面，胰高血糖素的类似物在27、28和29位的1、2或所有上包含氨基酸修饰。例如，27位的Met可被大的脂族氨基酸(任选Leu)取代，28位的Asn可被小的脂族氨基酸(任选Ala)取代，29位的Thr可被小的脂族氨基酸(任选Gly)取代或前述2种或3种的组合。在具体的实施方案中，胰高血糖素的类似物包含27位的Leu、28位的Ala和29位的Gly或Thr。
在本发明的某些实施方案中，胰高血糖素的类似物包含29位氨基酸C端1-21个氨基酸的突出端。突出端可包含例如GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 78)或XGPSSGAPPPS (SEQ IDNO: 79)的氨基酸序列。另外或备选，胰高血糖素的类似物可包含突出端，突出端的1-6个氨基酸是带正电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸可以是下式I的氨基酸，
[式I]，
其中n为1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6，R1和R2各自独立选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，且式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基。在示例性方面，式IV的氨基酸为Lys、高Lys、Orn或Dab。
此外，在一些实施方案中，胰高血糖素(SEQ ID NO: 76)的类似物包含相对于SEQID NO: 76的下列修饰的任一个或组合：
(a) 2位的Ser被D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val或α-氨基-N-丁酸取代；
(b) 10位的Tyr被Trp、Orn、Glu、Phe或Val取代；
(c) 12位的Lys被Arg或Ile取代；
(d) 16位的Ser被Glu、Gln、高谷氨酸、高半胱磺酸、Thr、Gly或AIB取代；
(e) 17位的Arg被Gln取代；
(f) 18位的Arg被Ala、Ser、Thr或Gly取代；
(g) 20位的Gln被Ser、Thr、Ala、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或AIB取代；
(h) 21位的Asp被Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸取代；
(i) 23位的Val被Ile取代；
(j) 24位的Gln被Asn、Ser、Thr、Ala或AIB取代；
(k) 和2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8、19、20、21、24、27、28和29位的任一个的保守取代。
在示例性的实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO: 76)的类似物包含下列修饰：
(a) 赋予GIP激动剂活性的1位的氨基酸修饰，
(b) i和i+4位的氨基酸侧链之间或j和j+3位的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，其中j为17，
(c) 27、28和29位的1、2个或所有的氨基酸修饰，例如27和/或28位的氨基酸修饰，和
(d) 相对于SEQ ID NO: 76，1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个另外的氨基酸修饰，
和用于GIP受体活化的类似物的EC50为约10 nM或更小。在示例性方面，GIP受体上的类似物的EC50与其在GLP-1受体上的EC50不同，小于约50倍。
这些实施方案的类似物的内酰胺桥可以是本文所述的内酰胺桥(参见例如WO2010/011439中在“α螺旋结构的稳定”部分中的内酰胺桥的教导)。例如，内酰胺桥可在16和20位处的氨基酸之间，其中16和20位处的氨基酸之一被Glu取代，16和20位处的氨基酸的另一个被Lys取代。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是具有以下修饰且具有GIP激动剂活性的胰高血糖素的类似物：
(a) 赋予GIP激动剂活性的1位的氨基酸修饰，
(b) 在类似物的16、20、21和24位处的氨基酸的1、2、3个或所有被α,α-二取代的氨基酸取代，
(c) 27、28和29位的1、2个或全部的氨基酸修饰，和
(d) 相对于天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 76)，1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个另外的氨基酸修饰，
其中用于GIP受体活化的类似物的EC50为约10 nM或更小。在示例性方面，GIP受体上的类似物的EC50与其在GLP-1受体上的EC50不同，小于约50倍。
这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以是任何α,α-二取代的氨基酸，包括但不限于氨基异丁酸(AIB)、被选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同的基团二取代的氨基酸或具有环辛烷或环庚烷的氨基酸(例如1-氨基环辛烷-1-甲酸)。在一个实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是氨基异丁酸(aib)。
在另外其它的实例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO:76)的类似物包含下列修饰：
(a) 赋予GIP激动剂活性的1位的氨基酸修饰，
(b) 16位的Ser被式I的氨基酸的氨基酸取代：
[式I]，
其中n为1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6，R1和R2各自独立选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，且式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基，
(c) 20位的Gln被α,α-二取代的氨基酸的氨基酸取代，
(d) 27、28和29位的1、2或全部处的氨基酸修饰，例如27和/或28位的氨基酸修饰，和
(e) 1-9或1-6个另外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个另外的氨基酸修饰，
和用于GIP受体活化的类似物的EC50为约10 nM或更小。在示例性方面，GIP受体上的类似物的EC50与其在GLP-1受体上的EC50不同，小于约50倍。
这些实施方案的类似物的式IV的氨基酸可以是任何氨基酸，例如式IV的氨基酸，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在某些实施方案中，n为2、3、4或5，在这种情况下，氨基酸分别是Dab、Orn、Lys或高Lys。
这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以是任何α,α-二取代的氨基酸，包括但不限于氨基异丁酸(AIB)、被选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团二取代的氨基酸或具有环辛烷或环庚烷的氨基酸(例如1-氨基环辛烷-1-甲酸)。在某些实施方案中，α,α-二取代的氨基酸是AIB。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVCWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 29)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 30)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 31)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG (SEQ ID NO: 32)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGG G (SEQ ID NO: 33)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 34)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 35)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 36)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 37)，其X = aib且在(SEQ ID NO: 37的)残基16和20的侧链之间具有内酰胺环，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 38)，其X = aib且在(SEQ ID NO: 38的)残基16和20的侧链之间具有内酰胺环，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVCWLLAG (SEQ ID NO: 39)，其X = aib且在(SEQ ID NO: 39的)残基16和20的侧链之间具有内酰胺环，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
本文报告的一方面为包含Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 120)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含脱氨基-Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 121)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 122)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 123)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 124)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 125)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-LPETGGSGS (SEQ ID NO: 109)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 110)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽脱氨基。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 111)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YAVGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 112)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 113)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 114)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLGGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 115)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSGGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 116)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
本文报告的一方面为包含以下的融合多肽
- 1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中人免疫球蛋白Fc区选自SEQ ID NO: 42-53的人免疫球蛋白Fc区，
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个彼此独立地直接或通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此如果接头肽存在，则选自(GGS)n，其中n=1-4 (SEQID NO: 82-84)；Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO:57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；和(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ ID NO: 65-67和92-94)，和
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
本文报告的一方面为包含以下的融合多肽
- 1个或2个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中人免疫球蛋白Fc区选自SEQ ID NO: 42-53的人免疫球蛋白Fc区，
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽各自彼此独立地直接或通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此如果接头肽存在，则选自(GGS)n，其中n=1-4 (SEQ IDNO: 82-84)；Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO: 57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；和(GGGGGS)o，其中o=1-6(SEQ ID NO: 65-67和92-94)，和
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽各自通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
本文报告的一方面为包含以下的融合多肽
- 1个或2个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中人免疫球蛋白Fc区包含i) SEQ ID NO: 49的2个氨基酸序列或ii) SEQ ID NO:52的1个氨基酸序列和SEQ ID NO: 53的1个氨基酸序列，
其中1个或2个、3个或4个肠降血糖素受体配体多肽各自通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的N端共价连接，由此接头肽选自(GGGS)4 (SEQ ID NO: 58)、(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 62)和(GGGGGS)o，其中o=2-3 (SEQ ID NO: 65-66)，和
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽各自通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
本文报告的一方面为包含本文报告的融合多肽的药物组合物。
本文报告的一方面为本文报告的融合多肽作为药物的用途。
本文报告的一方面为用于制备用于治疗疾病的药物的本文报告的融合多肽的用途，其中有利的是与由包含野生型人IgG Fc区的融合多肽诱导的效应子功能相比，包含野生型人IgG Fc区的变异Fc区的融合多肽的效应子功能降低。
本文报告的一方面为包含野生型人IgG Fc区的变异Fc区的本文报告的融合多肽的用途，其中野生型人IgG Fc区的Pro329被甘氨酸取代，其中残基按照Kabat的EU索引编号，其中融合多肽显示对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力降低用于下调ADCC达由包含野生型人IgG Fc区的融合多肽诱导的ADCC的至少20%，和/或用于下调ADCP。
在一个实施方案中，疾病是2型糖尿病。
在一个实施方案中，疾病是肥胖症。
在一个实施方案中，疾病是胰岛素抵抗。
在一个实施方案中，疾病是1型糖尿病。
在一个实施方案中，疾病是骨质疏松症。
在一个实施方案中，疾病是脂肪性肝炎。
在一个实施方案中，疾病是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
在一个实施方案中，疾病是代谢综合征。
在一个实施方案中，与另外的2型糖尿病药物组合给予本文报告的融合多肽。
在一个实施方案中，另外的2型糖尿病药物是胰岛素。
本文报告的一方面为包含肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸序列和LPXTG (SEQID NO: 75)的多肽，其中X为任何氨基酸。
在一个实施方案中，X为酸性氨基酸。
在一个实施方案中，酸性氨基酸为Glu。
在一个实施方案中，多肽包含LPETG (SEQ ID NO: 74) C端的Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 88)、Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:85)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 90)。
在一个实施方案中，多肽包含(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO: 57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；或(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ IDNO: 65-67和92-94)。
在一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO: 57-67的任一个。
在一个实施方案中，多肽包含LPXTG (SEQ ID NO: 75) N端的Gly或Gly-Gly。
本文报告的一方面为本文报告的多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，药物的制备包括使用分选酶A。
附图描述
图1
分选酶介导的转肽反应的SDS-PAGE分析。
图2
在雄性DIO小鼠中在单次给予化合物长肽24A-G3Fc和短肽24A-G3Fc (20 nmol/kg，s.c.)后体重减轻的进程(a)部分)和5天累积食物摄取(b)部分)。溶媒：三角形/1；人IgG1Fc区对照：圆形/2；短肽24A-G3Fc：倒三角形/3；长肽24A-G3Fc：正方形/4。
图3
在将化合物长肽-G3Fc和短肽24A-G3Fc (20 nmol/kg，s.c.)给予雄性db/db小鼠后在响应腹膜内葡萄糖攻击时葡萄糖波动(glucose excursion)的进程(a：ipGTT；b：AUCipGTT)。溶媒：三角形/1；人IgG1Fc区对照：圆形/2；短肽24A-G3Fc：倒三角形/3；长肽24A-G3Fc：正方形/4。
图4
在将化合物长肽-G3Fc和短肽-G3Fc (20 nmol/kg，s.c.)给予雄性db/db小鼠后在响应腹膜内葡萄糖攻击时葡萄糖波动的剂量依赖性进程(a：ipGTT；b：AUC ipGTT)。人IgG1Fc区对照：圆形/1；1 nmol/kg的长肽24A-G3Fc：倒三角形/2；3 nmol/kg的长肽24A-G3Fc：三角形/3；10 nmol/kg的长肽24A-G3Fc：正方形/4。
图5
有关在20 nmol/kg单次皮下施用于小鼠后受测试的本文报告的融合多肽和聚乙二醇化参比构建体的血浆浓度/时间分布的综述；(1/深色菱形)本文报告的脂质化Fc-融合物；(2/三角形)非脂质化、聚乙二醇化肠降血糖素受体配体多肽参比肽5；(3/正方形)非脂质化肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽参比物1；(4/浅色菱形)非脂质化肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽参比物2；(5/浅色圆形)非脂质化肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽参比物3；(6/深色圆形)非脂质化肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽参比物4。
图6
在施用不同化合物后体重(BW)的变化。空心圆形：溶媒对照(1)；实心大圆形：长肽24C(10 nmol) (2)；实心小圆形：长肽24N-G3Fc (10 nmol) (3)；大实心正方形：Dulaglutide(1 nmol) (4)；小实心正方形：Dulaglutide (10 nmol) (5)；大实心三角形：化合物42 (1nmol) (6)；小实心三角形：化合物42 (10 nmol) (7)；大实心倒三角形：化合物45 (1nmol) (8)；小实心倒三角形：化合物45 (10 nmol) (9)。
图7
在施用不同化合物后在第7天体重(BW)的总体变化(A)和累积食物摄取(FI) (B)。(1)/空心圆形：溶媒对照；(2)/实心圆形：长肽24C (10 nmol)；(3)/菱形：长肽24N-G3Fc (10nmol)；(4)/大实心正方形：Dulaglutide (1 nmol)；(5)/小实心正方形：Dulaglutide (10nmol)；(6)/大实心三角形：化合物42 (1 nmol)；(7)/小实心三角形：化合物42 (10 nmol)；(8)/大实心倒三角形：化合物45 (1 nmol)；(9)/小实心倒三角形：化合物45 (10 nmol)。
图8
第14天体重(BW)的总体变化。(1)对照N端三重G基序LALAPG Fc区；SEQ ID NO: 117(10 nmol)；(2)化合物42 (10 nmol)；(3)长肽-G3Fc (LALAPG) (10 nmol)；(4)化合物74(1 nmol)；(5)化合物74 (10 nmol)；(6)化合物77 (1 nmol)；(7)化合物77 (10 nmol)；(8)化合物80 (1 nmol)；(9)化合物80 (10 nmol)。
图9
不同化合物的体内半寿期。(1)/具有黑色轮廓线的圆形：长肽-人IgG1 Fc区融合多肽；(2)/正方形：长肽G4S3-Fc区融合多肽；(3)/实心菱形：短肽-G4S3-Fc区融合多肽；(4)/三角形：长肽；(5)/实心圆形：化合物42；(6)/空心菱形：长肽-G3Fc (LALAPG)。
本发明实施方案的详述
I. 定义
在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号(Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991),NIH Publication 91-3242, 通过引用明确结合到本文中)。术语“Kabat的EU索引”表示人IgG1 EU抗体的残基编号。
术语“亲和力”表示分子(例如抗体)的单一结合部位与其结合配偶体(例如抗原或Fc受体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体/Fc受体或抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可用解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的通用方法包括本文描述的方法测量。
术语“改变”表示亲本氨基酸序列(例如包含至少Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽的氨基酸序列)中一个或多个氨基酸残基的突变、添加或缺失，以获得变异抗体或融合多肽。
术语“氨基酸突变”表示亲本氨基酸序列的氨基酸序列中的修饰。示例性的修饰包括氨基酸取代、***和/或缺失。在一个实施方案中，氨基酸突变是取代。术语“在……位置处的氨基酸突变”表示指定残基的取代或缺失，或在指定残基附近***至少一个氨基酸残基。术语“在指定残基附近***”表示在其1-2个残基内的***。***可以是指定残基的N端或C端。
术语“氨基酸取代”表示预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基被不同的“置换”氨基酸残基置换。一个或多个置换残基可以是“天然存在的氨基酸残基” (即由遗传密码编码)并选自：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中，置换残基不是半胱氨酸。本文氨基酸取代的定义也包括被一个或多个非天然存在的氨基酸残基取代。“非天然存在的氨基酸残基”表示上列天然存在的氨基酸残基以外的残基，其能够与多肽链中的邻近氨基酸残基共价结合。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等, Meth. Enzym. 202(1991) 301-336中描述的氨基酸残基类似物。为了产生所述非天然存在的氨基酸残基，可采用Noren等(Science 244 (1989) 182)和/或Ellman等(同上)的方法。简单地说，这些方法包括用非天然存在的氨基酸残基化学激活阻抑型tRNA，接着RNA体外转录和翻译。非天然存在的氨基酸还可通过化学肽合成掺入肽中，随后这些肽与重组产生的多肽(例如抗体或抗体片段)融合。
术语“氨基酸***”表示至少一个另外的氨基酸残基掺入预先确定的亲本氨基酸序列。虽然***一般由***一个或两个氨基酸残基组成，但本申请考虑较大的“肽***”，例如***约3-约5个或甚至多达约10个氨基酸残基。***的残基可以是上文定义的天然存在的或非天然存在的。
术语“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中的预先确定的位置处脱去至少一个氨基酸残基。
术语“抗体变体”表示亲本抗体(例如野生型抗体)的变体，其特征在于氨基酸序列中相对于亲本氨基酸序列的至少一个改变存在于抗体变体氨基酸序列中，例如将一个或多个氨基酸残基的突变引入亲本抗体中。
在本申请内，每当提及氨基酸改变时，它是有意的氨基酸改变，而不是任意的氨基酸修饰。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”，简称“ADCC”，表示这样的细胞介导的反应，其中表达FcR的非抗原特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤细胞(NK细胞)、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)通过与免疫球蛋白Fc区结合识别靶细胞，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞中的FcR表达概述于Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492的第464页的表3中。
术语“依赖抗体的细胞吞噬”，简称“ADCP”，表示抗体包覆的细胞全部或部分被与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞)内化的过程。
术语“与Fc受体结合”表示在例如BIAcore(R)测定法(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)中与Fc受体的Fc区结合。
在BIAcore(R)测定法中，Fc受体与表面结合，且分析物(例如包含Fc区的融合多肽或抗体)的结合通过表面等离子体共振(SPR)测量。结合的亲和力通过术语ka (缔合常数：Fc区融合多肽缔合形成Fc区/Fc受体复合物的速率常数)、kd (解离常数；Fc区融合多肽或缀合物从Fc区/Fc受体复合物中解离的速率常数)和KD (kd/ka)定义。或者，就共振信号高度和解离行为而言，可将SPR传感图的结合信号与参比的反应信号直接比较。
术语“C1q”表示包括免疫球蛋白的Fc区的结合部位的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1，C1是依赖补体的细胞毒性(CDC)途径的第一组分。人C1q可市售购自例如Quidel，San Diego，Calif。
术语“肠降血糖素受体配体多肽”表示与胰高血糖素受体(GCGR)或/和胰高血糖素样肽-I (GLP-1)受体(GLP-1R)或/和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)受体(GIPR)结合的天然存在的或合成的多肽，即对这些受体的至少一种具有激动剂活性的分子。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽与葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体结合。在一个优选的实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽与葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体并与胰高血糖素样肽-I受体结合。在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽与葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体、与胰高血糖素样肽-I受体结合并与胰高血糖素受体结合。
当血糖开始下降时，胰高血糖素，一种由胰腺产生的激素，向肝发出分解糖原和释放葡萄糖的信号，引起血糖水平升到正常水平。与胰高血糖素相比，GLP-I具有不同的生物活性。其作用包括刺激胰岛素合成和分泌，抑制胰高血糖素分泌，并抑制食物摄取。已表明GLP-I降低糖尿病患者的高血糖症(葡萄糖水平升高)。毒蜥外泌肽-4，一种来自蜥蜴毒液的与GLP-I有约50%氨基酸序列同一性的肽，激活GLP-I受体，且同样显示降低糖尿病患者的高血糖症。葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)是42个氨基酸的胃肠调节肽，在葡萄糖存在下刺激胰岛素从胰β细胞中分泌。其通过蛋白水解加工来自于133个氨基酸前体preproGIP。
本文报告的融合多肽包含具有对天然胰高血糖素序列的修饰、显示等于或好于天然胰高血糖素的活性的强效胰高血糖素活性、等于或好于天然GIP的活性的强效GIP活性和/或等于或好于天然GLP-I的活性的强效GLP-I活性的肠降血糖素受体配体。
本文报告的融合多肽的作用包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空、肠生长、食物摄取的调节。具有GIP活性和GLP-I活性两者的肽对于诱导体重减轻或防止体重增加以及对于治疗高血糖症(包括糖尿病)特别有利。
肠降血糖素受体配体多肽包括但不限于GLP-1、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4及其前体、衍生物或片段。US 5,574,008、US 5,424,286、US 6,514,500、US 6,821,949、US 6,887,849、US 6,849,714、US 6,329,336、US 6,924,264、WO 2003/103572、US 6,593,295、WO2011/109784、WO 2010/011439、US 6,329,336和US 7,153,825中报告了示例性的肠降血糖素受体配体多肽。
术语“CH2结构域”表示大致从EU 231位延伸到EU 340位(按照Kabat的EU编号***)的抗体重链多肽的部分。在一个实施方案中，CH2结构域具有APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 40)的氨基酸序列。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域严密配对。更确切地说，两个N联支链糖链***完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，所述糖可提供结构域-结构域配对的替换，并有助于稳定CH2结构域。Burton, Mol.Immunol. 22 (1985) 161-206。
术语“CH3结构域”表示大致从EU 341位延伸到EU 446位的抗体重链多肽的部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 41)的氨基酸序列。
术语抗体的“类别”表示其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。在人类中有5种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“依赖补体的细胞毒性”，简称“CDC”，表示诱导细胞死亡的一种机制，其中靶结合的Fc区融合多肽的Fc区激活一系列酶促反应，最终在靶细胞膜上形成孔。通常，抗原-抗体复合物(例如在包覆抗体的靶细胞上的那些)结合并激活补体组分C1q，其进而激活导致靶细胞死亡的补体级联。补体的活化还可导致补体组分在靶细胞表面上沉积，其通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)促进ADCC或ADCP。
术语“效应子功能”表示可归因于随抗体同种型而变化的抗体的Fc区的生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化。例如，可通过Fc区与具有吞噬或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体结合，或通过Fc区与补体***的组分结合，实现所述功能。
术语“效应子功能降低”表示与对照分子(例如具有野生型Fc区的多肽)相比，与分子(像例如ADCC或CDC)有关的特定效应子功能降低达至少20%。术语“效应子功能强降低”表示与对照分子相比，与分子(像例如ADCC或CDC)有关的特定效应子功能降低达至少50%。
术语作用剂(例如药物制剂)的“有效量”，表示以必需的剂量并持续必需的一段时间有效达到所需治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”表示免疫球蛋白的C端区。Fc区是包含二硫键连接的抗体重链片段的二聚分子(Fc区多肽链)，任选包含1、2、3或更多个二硫键。Fc区可通过木瓜蛋白酶消化、或IdeS消化、或胰蛋白酶消化完整(全长)抗体生成或可重组产生。
可获自全长抗体或免疫球蛋白的Fc区包含残基226 (Cys)至全长重链C端，因此，包含铰链区的一部分和2个或3个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和任选CH4结构域。从US 5,648,260和US 5,624,821得知在Fc区中规定氨基酸残基的修饰导致表型效应。
包含两个相同或不同的抗体重链片段的二聚Fc区的形成通过所包含的CH3结构域的非共价二聚化介导(有关所涉及的氨基酸残基参见例如Dall'Acqua, Biochem. 37(1998) 9266-9273)。Fc区通过铰链区中二硫键的形成而被共价稳定(参见例如Huber等,Nature 264 (1976) 415-420；Thies等, J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79)。由于CH3-CH3-结构域二聚化所涉及的残基的位置位于CH3结构域的内表面，而参与Fc区-FcRn相互作用的残基位于CH2-CH3结构域的外面，因此CH3结构域内引入氨基酸残基变化以破坏CH3-CH3结构域相互作用的二聚化不会不利地影响新生儿Fc受体(FcRn)结合。
与Fc区的效应子功能有关的残基位于铰链区、CH2和/或CH3结构域，根据全长抗体分子测定。Fc区相关/介导的功能为：
(i) 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，
(ii) 补体(C1q)结合、活化和依赖补体的细胞毒性(CDC)，
(iii) 吞噬作用/抗原-抗体复合物的清除，
(iv) 在某些情况下的细胞因子释放，和
(v) 抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。
Fc区相关效应子功能由Fc区与效应子功能特异性分子或受体的相互作用启动。IgG1同种型的大多数抗体可实现受体活化，而IgG2和IgG4同种型的抗体不具有效应子功能或具有有限的效应子功能。
效应子功能诱导性受体为Fc受体类型(和亚型) FcγRI、FcγRII和FcγRIII。可通过在参与FcγR和C1q结合的下铰链区引入特定的氨基酸变化(例如L234A和/或L235A)而降低与IgG1同种型有关的效应子功能。此外尤其是位于CH2和/或CH3结构域的某些氨基酸残基，与血流中的抗体分子或Fc区融合多肽的循环半衰期有关。循环半衰期通过Fc区与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来测定。
存在于Fc区糖结构上的唾液酸残基参与Fc区的抗炎介导的活性(参见例如Anthony, R.M.等 Science 320 (2008) 373-376)。
抗体恒定区中氨基酸残基的编号按照Kabat的EU索引进行(Kabat, E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication91 3242)。
术语“人源的Fc区”表示人源的免疫球蛋白重链的C端区，含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从约Cys226或从约Pro230延伸到重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可能存在或不存在。
术语“变异Fc区”表示因至少一个“氨基酸改变/突变”而不同于“天然”或“野生型”Fc区氨基酸序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，变异Fc区与天然Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸突变，例如约1-约10个氨基酸突变，而在一个实施方案中，在天然Fc区或亲本多肽的Fc区中约1-约5个氨基酸突变。在一个实施方案中，(变体) Fc区与野生型Fc区和/或亲本多肽的Fc区有至少约80%同源性，而在一个实施方案中，变异Fc区具有最少约90%同源性，在一个实施方案中，变异Fc区具有至少约95%同源性。
本文报告的变异Fc区由所包含的氨基酸改变限定。因此，例如，术语P329G表示相对于亲本(野生型) Fc区在氨基酸329位处脯氨酸突变为甘氨酸的变异Fc区。可能未具体说明野生型氨基酸的身份，在此情况下，前述变体被称为329G。对于本发明中论述的所有位置，编号按照EU索引。EU索引或按照Kabat的EU索引或EU编号方案是指EU抗体的编号(Edelman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85)。改变可为添加、缺失或突变。术语“突变”表示天然存在的氨基酸的变化以及非天然存在的氨基酸的变化，参见例如US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524；Chin, J.W.等, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027；Chin, J.W.和Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137；Chin, J.W.等, PICAS UnitedStates of America 99 (2002) 11020-11024；以及Wang, L.和Schultz, P.G., Chem.(2002) 1-10。
IgG1同种型的野生型人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 42)。
含突变L234A、L235A的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 43)。
含孔突变(hole mutation)的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 44)。
含结突变(knob mutation)的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 45)。
含L234A、L235A和孔突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 46)。
含L234A、L235A和结突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 47)。
含P329G突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 48)。
含L234A、L235A和P329G突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 49)。
含P329G和孔突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 50)。
含P329G和结突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 51)。
含L234A、L235A、P329G和孔突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 52)。
含L234A、L235A、P329G和结突变的IgG1同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 53)。
IgG4同种型的野生型人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 54)。
含S228P和L235E突变的IgG4同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 55)。
含S228P、L235E和P329G突变的IgG4同种型的变异人Fc区的多肽链具有下列氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 56)。
术语“Fc受体”，简称“FcR”，表示与Fc区结合的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。而且，在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR (Fcγ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体及其备选剪接形式。FcγRII受体包括具有主要在其胞质结构域中不同的类似氨基酸序列的FcγRIIA (“激活性受体”)和FcγRIIB (“抑制性受体”)。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM) (参见例如Daëron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234)。有关FcR的综述见Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492；Capel等,Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341。本文术语“FcR”包括其它FcR，包括未来鉴定的FcR。术语还包括新生儿受体FcRn，它负责将母体IgG转移到胎儿中(参见例如Guyer等, J. Immunol. 117 (1976) 587；Kim等, J.Immunol. 24 (1994) 249)。
术语“IgG Fc配体”表示与IgG抗体的Fc区结合形成Fc区/Fc配体复合物的来自任何生物的分子，在一个实施方案中为多肽。Fc配体包括但不限于FcγR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体也包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγR同源的Fc受体的家族(参见例如Davis等，ImmunologicalReviews 190 (2002) 123-136)。Fc配体可包括未发现的结合Fc的分子。在一个实施方案中，IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。
术语“Fcγ受体”，简称“FcγR”，表示结合IgG抗体Fc区且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，该家族包括但不限于FcγRI (CD64)，包括同种型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII (CD32)，包括同种型FcγRIIA (包括同种异型H131和R131)、FcγRIIB (包括FcγRIIB-1和FcγRIIB-2)和FcγRIIC；以及FcγRIII (CD16)，包括同种型FcγRIIIA (包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIB (包括同种异型FcγRIIB-NA1和FcγRIIB-NA2) (参见例如Jefferis等, Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)和FcγRIII-2 (CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。Fc区-FcγR相互作用所涉及的氨基酸残基为234-239 (下铰链区)、265-269 (B/C环)、297-299 (D/E环)和327-332 (F/G)环(Sondermann等，Nature 406 (2000) 267-273)。导致对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合/亲和力降低的氨基酸突变包括N297A (同时具有免疫原性降低且半衰期延长的结合/亲和力) (Routledge等, Transplantation 60(1995) 847；Friend等, Transplantation 68 (1999) 1632；Shields等, J. Biol. Chem.276 (1995) 6591-6604)、残基233-236 (Ward和Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77；Armour等, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。一些示例性的氨基酸取代描述于US 7,355,008和US 7,381,408。
术语“新生儿Fc受体”，简称“FcRn”，表示结合IgG抗体Fc区且至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知，功能性FcRn蛋白包含两种多肽，常常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。Fc区与FcRn的相互作用性氨基酸残基接近CH2和CH3结构域的连接处。Fc区-FcRn接触残基全在单个IgG重链内。所涉及的氨基酸残基为248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314 (全部在CH2结构域中)和氨基酸残基385-387、428和433-436 (全部在CH3结构域中)。导致对FcRn的结合/亲和力提高的氨基酸突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
术语“野生型多肽”或“亲本多肽”表示起始多肽，或为未修饰的(野生型多肽)或已含有将其与野生型(亲本多肽)区分开来的至少一个改变，其随后改变以产生变体。术语“野生型多肽”表示多肽本身、包含多肽的组合物或其编码核酸序列。因此，术语“野生型Fc区多肽或缀合物”表示包含天然存在的Fc区(其被改变以产生变体)的Fc区融合多肽。
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本相同的结构和氨基酸序列以及包含本文报告的Fc区的多肽的抗体。
术语“铰链区”表示连接CH1结构域和CH2结构域的抗体重链多肽的部分，例如按照Kabat的EU编号***自约216位到约230位。其它IgG同种型的铰链区可通过与IgG1同种型序列的铰链区半胱氨酸残基对齐来确定。
铰链区通常是由具有相同氨基酸序列的两个多肽组成的二聚分子。铰链区一般包含约25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许抗原结合区独立移动。铰链区可再分成3个结构域：上、中和下铰链结构域(参见例如Roux等, J. Immunol. 161 (1998) 4083)。
术语Fc区的“下铰链区”表示紧接铰链区C端的氨基酸残基的序列段，即按照Kabat的EU编号的Fc区的残基233-239。
术语“野生型Fc区”表示与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc区包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。
相对于参比多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列且引入空位(必要时)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术内的各种方式实现，例如，应用可公开获取的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在待比较的序列的全长内达到最大比对需要的任何算法。然而，对于本文的目的，应用序列比较计算机程序ALIGN-2产生%氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.制作，源码与用户文件一起提交到U.S. Copyright Office，Washington D.C.，20559，以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可公开获取自Genentech，Inc.，South San Francisco，California，或可从源码编制。ALIGN-2程序应在UNIX操作***中编制使用，包括数码UNIX V4.0D。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设置，且不作改变。
在将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，如下计算指定氨基酸序列A的相对于、与或针对指定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述为相对于、与或针对指定氨基酸序列B具有或包含某一%氨基酸序列同一性的指定氨基酸序列A)：
100乘以分数X/Y
其中X是在该程序的A和B比对中通过序列比对程序ALIGN-2被评为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应认识到，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A相对于B的%氨基酸序列同一性不会等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，否则应用ALIGN-2计算机程序，按照紧接的前一段中所述得到本文所用的所有%氨基酸序列同一性值。
术语“药物制剂”是指呈这样的形式使得允许包含在其中的活性成分的生物活性是有效的，且不含对将被给予制剂的受试者有不可接受的毒性的其它组分的配制剂。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“位置”表示多肽的氨基酸序列中氨基酸残基的位置。可按顺序或按照已确立的方式(例如用于抗体编号的Kabat的EU索引)对位置编号。
术语“治疗”(及其语法的变化例如“treat”或“treating”)表示以期改变受治疗的个体的自然进程的临床干预，且对于预防或在临床病理学期间可进行临床干预。合乎需要的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接的病理结果、防止转移、减缓疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，使用本发明的抗体延缓疾病发展或减慢疾病的进展。
术语“变体”表示具有不同于亲本多肽的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽。通常这类分子具有一个或多个改变、***或缺失。在一个实施方案中，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列具有小于100%序列同一性。在一个实施方案中，变体氨基酸序列具有与亲本多肽的氨基酸序列约75%-小于100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，变体氨基酸序列与亲本多肽的氨基酸序列有约80%-小于100%氨基酸序列同一性，在一个实施方案中，约85%-小于100%，在一个实施方案中，约90%-小于100%，而在一个实施方案中，约95%-小于100%氨基酸序列同一性。
术语“改变的” FcR结合亲和力或ADCC活性表示与亲本多肽(例如包含野生型Fc区的多肽)相比FcR结合活性和/或ADCC活性提高或降低的多肽。与亲本或野生型多肽相比，与FcR “结合增加”的变体多肽以更低的解离常数(即更好/更高的亲和力)结合至少一个FcR。与亲本或野生型多肽相比，与FcR “结合降低”的多肽变体以更高的解离常数(即更差/更低的亲和力)结合至少一个FcR。显示与FcR结合降低的所述变体可能几乎不与FcR结合或与FcR无可观的结合，例如与野生型或亲本IgG Fc区相比，与FcR的0-20%结合，例如按照本文所述实施例中所测定的。
在与亲本或野生型多肽比较时，当在结合测定法中多肽变体和亲本多肽的量大致(基本上)相同时，以“降低的亲和力”结合FcR的多肽是与亲本多肽相比时以(显著)降低的结合亲和力结合上述鉴定的FcR的任何一个或多个的多肽。例如，具有降低的FcR结合亲和力的多肽变体与亲本多肽相比时可显示FcR结合亲和力降低约1.15倍-约100倍，例如约1.2倍-约50倍，其中FcR结合亲和力例如按照本文公开的实施例中公开的测定。
当用于该测定法中的变体多肽和亲本多肽的量(基本上)大致相同时，包含与亲本多肽相比“在人效应细胞存在下不太有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”的变异Fc区的多肽是体外或体内在介导ADCC时(显著)不太有效的多肽。一般可采用本文公开的体外ADCC测定法鉴定这类变体，但是考虑了用于测定ADCC活性的其它测定法或方法，例如在动物模型等中。在一个实施方案中，例如在本文公开的体外测定法中，与亲本相比，变体在介导ADCC时不太有效，变体为亲本的约1/1.5-约1/100，例如约1/2-约1/50。
术语“受体”表示能够结合至少一种配体的多肽。在一个实施方案中，受体是具有胞外配体-结合结构域和任选其它结构域(例如跨膜结构域、胞内结构域和/或膜锚着点)的细胞表面受体。待在本文所述测定法中评价的受体可以是完整受体或其片段或衍生物(例如包含与一个或多个异源多肽融合的受体结合结构域的融合蛋白)。而且，待评价其结合性质的受体可存在于细胞中或可以是分离的，任选包被在测定板或一些其它固相中。
术语“受体结合结构域”表示受体的任何天然配体，包括细胞粘附分子，或至少保持相应天然配体的定性受体结合能力的所述天然配体的任何区域或衍生物。这个定义尤其明确包括来自上述受体的配体的结合序列。
II. 肠降血糖素受体配体多肽和含有所述多肽的FC区融合多肽
本文报告了包含1-4个肠降血糖素受体配体多肽和变异Fc区的Fc区融合多肽。
已发现，脂质化可提高肠降血糖素受体配体多肽的生物活性。因此，这些肽是本发明的方面。下表显示不同化合物的脂质化对受体结合的作用。
表1
可见通过脂质化(独立于与Fc区的缀合)，可改进生物活性(例如EC50值)。脂质化肠降血糖素受体配体多肽具有类似于天然存在的受体配体GLP和GIP-1分别对于人GLP受体和人GIP-1受体的生物活性。
因此，进一步发现，脂质化和Fc区融合的组合不赋予肠降血糖素受体配体多肽的生物活性。比较结果见下表。
虽不受该理论的束缚，但假设在体内(或如果存在各自的结合配偶体则同样体外)施用后，脂质化肠降血糖素受体多肽被内源多肽(例如人血清白蛋白)络合。因为与络合性内源多肽的大小相比，肠降血糖素受体配体多肽小，所以预期在其可及性将被降低时，络合降低肠降血糖素受体配体多肽的生物活性。另外如果肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区(或其变体)进一步融合，则这变得甚至更有问题。
但是现已发现，尽管肠降血糖素受体配体多肽被脂质化(因此与大的多肽络合)且与人免疫球蛋白Fc区融合，但生物活性与非脂质化无Fc区融合的肠降血糖素受体配体多肽至少相当或甚至提高。另外与非脂质化肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽和与聚乙二醇化肠降血糖素受体配体多肽相比，暴露和体内半衰期延长。各数据见下表。
本文报告的脂质化肠降血糖素受体配体多肽(分离的或作为Fc区融合多肽)用作二重GLP/GIP激动剂，并显示与其它非脂质化肠降血糖素受体配体多肽或衍生物(聚乙二醇化或Fc区融合多肽)相比，体内生物活性改进(参见图6-8)。另外暴露和体内半寿期改进(图9)。
所需用途是拮抗细胞结合的靶标(=受体)，因此，应选择非效应子功能诱导性Fc区同种型或Fc区变体。
因此，将导致Fc区相关效应子功能完全降低的包含Fc区的融合多肽的Fc区中规定位置处的突变引入融合多肽的人免疫球蛋白Fc区中。
可通过调节Fc区-FcRn相互作用，影响Fc区融合多肽的循环半衰期。这可通过改变Fc区中特定的氨基酸残基来实现(Dall'Acqua, W.F.等, J. Biol. Chem. 281 (2006)23514-23524；Petkova, S.B.等, Internat. Immunol. 18 (2006) 1759-1769；Vaccaro,C.等 Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (2007) 18709-18714)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)的最小化或甚至除去可通过所谓的铰链区氨基酸变化/取代实现。选用于取代的氨基酸残基是预期参与Fc区与人Fc受体(而非FcRn)结合的氨基酸残基。这个/这些氨基酸残基变化导致与包含野生型IgG Fc区的Fc区融合多肽相比安全性概况改进。
通过抗原/IgG免疫复合物引起的C1q结合和活化，启动经典补体级联。这种活化导致炎症反应和/或免疫调节反应。经典补体级联活化的最小化或甚至去除可通过所谓的铰链区氨基酸变化/取代实现。选用于取代的氨基酸残基是预期参与Fc区与组分C1q结合的氨基酸残基。C1q结合降低甚至消除的一个示例性Fc区变体是包含突变L234A和L235A (LALA)的Fc区变体。
Fc区融合多肽与新生儿受体(FcRn)的结合导致多肽跨胎盘转运，并影响Fc区融合多肽的循环半衰期。Fc区融合多肽或缀合物的循环半衰期延长导致功能改进、给药剂量或给药频率降低或靶定位改进。Fc区融合多肽的循环半衰期缩短导致全身暴露减少或靶/非靶结合比提高。
在物种间是保守的且FcRn结合所必需的氨基酸残基是Fc区中的310和435位的组氨酸残基。这些残基负责Fc区FcRn相互作用的pH依赖性(参见例如Victor, G.等, NatureBiotechnol. 15 (1997) 637-640)；Dall'Acqua, W.F.等 J. Immunol. 169 (2002)5171-5180)。减少与FcRn相互作用的Fc区突变可缩短抗体半衰期。
总的来讲，本文报告的融合多肽包含变异Fc区。然而，融合多肽的人免疫球蛋白Fc区与野生型Fc区相比可能已具有一个或多个氨基酸序列改变。例如，亲本Fc区的C1q或FcγR结合活性可被改变(下面更详细地描述了Fc区修饰的其它类型)。
在一个实施方案中，改变编码融合多肽的亲本Fc区的核酸以产生编码融合多肽的变异Fc区的变体核酸序列。
编码融合多肽的变异Fc区的氨基酸序列的核酸可通过本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于通过较早制备的编码融合多肽Fc区的DNA的位点定向(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变制备，或可通过DNA合成以化学方法产生。
位点定向诱变是制备取代变体的合适方法。该技术是本领域众所周知的(参见例如Carter等, Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4431-4443, Kunkel等, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 (1985) 488)。简单地说，在进行DNA的位点定向诱变时，起始DNA首先通过使编码所需突变的寡核苷酸与所述起始DNA的单链杂交来改变。在杂交后，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并使用起始DNA的单链作为模板，使用DNA聚合酶合成完整的第二链。因此，编码所需突变的寡核苷酸被掺入所得双链DNA中。
PCR诱变也适用于制备起始多肽的氨基酸序列变体(参见例如Higuchi，载于PCRProtocols，Academic Press (1990) 第177-183页；Vallette等, Nucl. Acids Res. 17(1989) 723-733)。简单地说，当少量的模板DNA用作PCR中的起始原料时，在序列上略不同于模板DNA相应区的引物可用来产生相对大量的仅在其中引物不同于模板的位置上不同于模板序列的特定DNA片段。
用于制备变体的另一种方法盒式诱变，基于Wells等，载于Gene 34 (1985) 315-323中描述的技术。
本文报告的一方面为包含人免疫球蛋白Fc区和1-4个肠降血糖素受体配体多肽的融合多肽，其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个包含与脂质共价缀合的氨基酸残基，且其中人免疫球蛋白Fc区中的至少一个氨基酸残基通过添加、突变或缺失而改变，导致与包含亲本或野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比，融合多肽对至少一个Fc受体的亲和力降低或消除。
Fc区与多种受体或配体包括但不限于Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白质C1q和其它分子(例如蛋白A或蛋白G)相互作用。这些相互作用是各种效应子功能和下游信号转导事件所必需的，包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的细胞吞噬作用(ADCP)和依赖补体的细胞毒性(CDC)。
在一个实施方案中，与包含亲本或野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比，本文报告的融合多肽包含对Fc受体的亲和力降低或消除、可诱导效应子功能的人免疫球蛋白Fc区，其中变异人免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列通过至少一个氨基酸残基的至少一个添加、突变或缺失而不同于亲本人免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文报告的融合多肽具有下列性质的至少一种或多种：效应子功能(ADCC和/或CDC和/或ADCP)降低或消除、与Fc受体的结合降低或消除、与C1q的结合降低或消除或者毒性降低或消除。
在一个实施方案中，本文报告的融合多肽包含具有在329位(按照Kabat的EU索引)处的脯氨酸氨基酸残基的至少一个突变或缺失的变异人免疫球蛋白Fc区。
如果一个氨基酸残基从氨基酸序列中缺失，则其余氨基酸残基仍保持其EU索引编号(尽管氨基酸序列中的实际位置改变)以允许在多重突变的Fc区中确切鉴定出特定的氨基酸残基。
在一个实施方案中，融合多肽包含具有329位(按照Kabat的EU索引)处的氨基酸突变的野生型人Fc区。在一个实施方案中，在一个实施方案中，使Fc区中的氨基酸329位处的脯氨酸残基突变成比脯氨酸小或大的氨基酸残基。在一个实施方案中，使该氨基酸残基突变成甘氨酸、丙氨酸或精氨酸。在一个优选的实施方案中，使Fc区中的329位(按照Kabat的EU索引)处的氨基酸残基脯氨酸突变成甘氨酸。
在一个实施方案中，融合多肽在人免疫球蛋白Fc区中包含至少一个另外的氨基酸突变。
在一个实施方案中，本文报告的融合多肽包含具有至少3个氨基酸突变、添加或缺失的野生型人免疫球蛋白Fc区。
在一个实施方案中，本文报告的融合多肽在人免疫球蛋白Fc区中包含选自S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D和P331S的至少一个氨基酸取代。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白Fc区是人IgG1 Fc区或人IgG4 Fc区。
在一个实施方案中，如果Fc区是IgG4同种型的，则人免疫球蛋白Fc区中氨基酸残基另外的添加、突变或缺失位于Fc区的228和/或235位。在一个实施方案中，228位的氨基酸残基丝氨酸被脯氨酸残基取代，235位的氨基酸残基亮氨酸被谷氨酸残基取代。
在一个实施方案中，融合多肽在人免疫球蛋白Fc区包含3个氨基酸突变。在一个实施方案中，3个氨基酸突变是P329G、S228P和L235E (SPLEPG)。
在一个实施方案中，如果Fc区是IgG1同种型的，则本文报告的Fc区融合多肽中氨基酸残基的另外的添加、突变或缺失位于Fc区的234和/或235位。在一个实施方案中，234位的氨基酸残基亮氨酸被丙氨酸残基取代，且235位的氨基酸残基亮氨酸被丙氨酸残基取代。
虽然在一个实施方案中与FcγR的结合改变，但对新生儿受体(FcRn)的结合亲和力改变的融合多肽也是本文报告的方面的实施方案。
对FcRn的亲和力提高的Fc区变体具有较长的血清半寿期，而且这类分子在治疗哺乳动物的方法中将具有有益的应用，其中需要所给予的融合多肽的长半衰期，以治疗例如慢性疾病或病症。
FcRn结合亲和力降低的Fc区变体具有较短的血清半寿期，并且这类分子在治疗哺乳动物的方法中将具有有益的应用，其中需要所给予的融合多肽的较短半衰期，例如以避免有毒副作用或用于体内诊断成像应用。FcRn结合亲和力降低的Fc区不太可能跨过胎盘，因此可用于治疗孕妇的疾病或病症。
在一个实施方案中，对FcRn的结合亲和力改变的Fc区包含含有以下氨基酸位置的一个或多个处具有氨基酸改变的Fc区的那些：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447。
在一个实施方案中，与FcRn结合降低的Fc区包含在以下氨基酸位置具有一个或多个氨基酸改变的Fc区：252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439和/或447。
在一个实施方案中，显示与FcRn结合增强的Fc区包含在以下氨基酸位置具有一个或多个氨基酸改变的Fc区：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424和/或434。
融合多肽可包含任何类别(例如但不限于IgG、IgM和IgE)的人免疫球蛋白Fc区。在一个实施方案中，融合多肽包含IgG类别的人免疫球蛋白Fc区。在一个实施方案中，融合多肽包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的人免疫球蛋白Fc区。
在一个实施方案中，融合多肽包含IgG1亚类的人免疫球蛋白Fc区并在Fc区包含氨基酸突变P329G和/或L234A和L235A。
在一个实施方案中，融合多肽包含IgG4亚类的人免疫球蛋白Fc区。在一个实施方案中，融合多肽包含IgG4亚类的人免疫球蛋白Fc区并在Fc区包含氨基酸突变P329G和/或S228P和L235E。
在一个实施方案中，本文报告的融合多肽通过使生物活性多肽与本文报告的一个或多个氨基酸突变的人免疫球蛋白Fc区缀合来产生。在一个实施方案中，本文报告的融合多肽通过引入本文报告的一个或多个氨基酸突变经修饰亲本Fc区融合多肽来产生。
使用分选酶A的酶缀合
可通过使用分选酶A这种酶，获得包含Fc区和一个或多个脂质化肠降血糖素受体配体多肽的缀合物。
分选酶A (SrtA)是使蛋白质与细菌细胞壁共价连接的膜结合酶。SrtA底物上的特异性识别基序是LPXTG (SEQ ID NO: 75)，在此该酶在残基苏氨酸和甘氨酸之间切割。肽聚糖上的识别基序是五甘氨酸基序。已表明，N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy，K.W.等，Peptide science 94 (2010) 385-396)。该反应通过硫酯酰基-酶中间体进行，所述中间体通过来自寡甘氨酸的胺亲核体攻击而分解，使肽聚糖与蛋白质底物共价连接，并再生SrtA。SrtA可用来将化学合成的肽与重组表达的蛋白质共价缀合。
对于脂质化肠降血糖素受体配体多肽(例如具有GIP受体和GLP-1受体双重激动性活性)与亚类IgG1的人免疫球蛋白Fc区的酶缀合，可使用可溶性SrtA (金黄色葡萄球菌(Staph. aureus) SrtAr氨基酸残基60-206)。可在大肠杆菌(E. coli)中产生该酶。在待缀合的重链各N端处被三元G基序修饰的人免疫球蛋白Fc区和在待缀合的重链各C端处的SrtA识别基序可在真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)中表达。将相应的三元G基序或SrtA识别基序引入脂质化肠降血糖素受体配体多肽各自的N端或C端。
本文报告的一方面为通过使用酶分选酶A使脂质化肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区缀合而获得的脂质化肠降血糖素受体配体Fc区融合多肽，其中分选酶识别序列位于脂质化肠降血糖素受体配体多肽的C端和/或一个或两个Fc区重链片段的C端，且其中三元甘氨酸基序位于脂质化肠降血糖素受体配体多肽的N端和/或一个或两个Fc区重链片段的N端。
因此，本发明提供包含脂质化肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸序列和分选酶识别序列的氨基酸序列的多肽。在示例性方面，本发明提供包含脂质化肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸序列和LPXTG (SEQ ID NO: 75)的多肽，其中X为任何氨基酸。在示例性方面，X为酸性氨基酸，例如Asp、Glu。在示例性方面，X为Glu。在示例性方面，多肽包含LPXTG (SEQID NO: 75) N端的一个或多个Gly残基，其中X为任何氨基酸。在备选或另外的实施方案中，多肽包含LPXTG (SEQ ID NO: 73) C端的Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly (SEQ IDNO: 99)、Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 79)、Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 80)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 81)。在示例性方面，多肽包含(GGS)n，其中n=1-4 (SEQ IDNO: 82-84)，或Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO: 57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91，或(GGGGGS)o，其中o=1-6(SEQ ID NO: 65-67和92-94)。
在一个实施方案中，Fc区重链片段的一个或两个包含位于三元G基序的C端和Fc区重链的N端之间和/或位于Fc区重链的C端和SrtA识别基序的N端之间的接头多肽。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽包含位于SrtA识别序列的N端和肠降血糖素受体配体多肽的C端之间的接头多肽。
在一个实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽包含位于三元G识别序列的C端和肠降血糖素受体配体多肽的N端之间的接头多肽。
在一个实施方案中，接头多肽具有9-25个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中，接头多肽选自(GGGS)3 (SEQ ID NO: 57)、(GGGS)4 (SEQ ID NO: 58)、(GGGS)5 (SEQ ID NO:59)、(GGGS)6 (SEQ ID NO: 60)、(GGGGS)2 (SEQ ID NO: 61)、(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 62)、(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 63)、(GGGGS)5 (SEQ ID NO: 64)、(GGGGGS)2 (SEQ ID NO: 65)、(GGGGGS)3 (SEQ ID NO: 66)和(GGGGGS)4 (SEQ ID NO: 67)。
在示例性方面，本发明提供包含脂质化肠降血糖素受体配体多肽和接头的氨基酸序列的多肽，例如接头包含SEQ ID NO: 57-67的任一个的氨基酸序列。
在一个实施方案中，融合多肽包含1个脂质化肠降血糖素受体配体多肽。在该实施方案中，肠降血糖素受体配体多肽与Fc区的单个N端或C端缀合。同样在该实施方案中，Fc区是2个抗体重链Fc区片段的异二聚体，其中仅1个包含肠降血糖素受体配体多肽(在缀合后)或寡甘氨酸/SrtA识别基序(在缀合前)。
包含与因激活GIP受体和GLP-1受体而具有双重激动性性质的脂质化肠降血糖素受体配体多肽缀合的人IgG1 Fc区的缀合物可用于控制血糖水平和用于稳固的脂肪质量丢失。
已表明，在腹膜内葡萄糖攻击后，所述缀合物在糖尿病db/db小鼠中导致血糖波动降低。另外，在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中观察到，在单剂量后，给予所述脂质化肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽能够诱导食物摄取减少和稳固的体重减轻。
肠降血糖素受体(例如GLP-1-和GIP-受体)的活化，导致葡萄糖依赖性胰岛素分泌、胰β细胞增殖、保护胰β细胞免遭脂肪毒性，并防止由PKA和/或EPAC活化的下游途径介导的细胞凋亡(Dzhura, I.等, Islets 3 (2011) 121-128；Ehses, J.A.等, Endocrin. 144(2003) 4433-4445；Kang, G.等, J. Biol. Chem. 278 (2003) 8279-8285；Miura, Y.和Matsui, H., Tox. Appl. Pharmacol. 216 (2006) 363-372；Mukai, E.等, Diabetes 60(2011) 218-226；Natalicchio, A.等, Endocrin. 151 (2010) 2019-2029；Quoyer, J.等, J. Biol. Chem. 285 (2010) 1989-2002；Uhles, S.等, Diabetes Obes. Metabol.13 (2010) 326-336)。
此外，在分泌胰高血糖素的胰α细胞中检测到肠降血糖素受体例如GLP-1和GIP受体。
已报告了迷走神经中肠降血糖素受体(例如GLP-1受体)的存在以及CNS中的广泛分布。据报告，门静脉GLP-1受体的活化在葡萄糖稳态中起关键作用(Burcelin, R.等,Diabetes 50 (2001) 1720-1728；Vahl, T.P.等, Endocrin. 148(2007) 4965-4973)。另外，在弓状核中表达的GLP-1受体涉及调节葡萄糖水平(Sandoval, D.A.等, Diabetes 57(2008) 2046-2054)。
后脑和下丘脑中GLP-1受体的活化在限制摄食量和预防肥胖症中起重要作用(Hayes, M.R.等, Endocrinol. 150 (2009) 2654-2659；McMahon, L.R.和Wellman,P.J., Am. J. Physiol. 274 (1998) R23-29；Turton, M.D.等, Nature 379 (1996) 69-72)。
GIP和GIP-受体存在于CNS中。CNS中的GIP被认为在神经发生和记忆中起作用(Figueiredo, C.P.等, Behav. Pharmacol. 21 (2010) 394-408；Nyberg, J.等, J.Neurosci. 25 (2005) 1816-1825)。
肠降血糖素受体(例如GIP受体)存在于脂肪细胞中，并诱导脂解作用和脂肪酸的再酯化(Getty-Kushik, L.等, Obesity 14 (2006) 1124-1131)。另外，GIP受体活化导致人脂肪细胞上的LPL表达增加(Kim, S.J.等, J. Biol. Chem. 282 (2007) 8557-8567；Kim, S.J.等, J. Lipid Res. 51 (2010) 3145-3157)。
III. 重组方法
本文报告的融合多肽的部分可采用重组方法和组合物产生，参见例如US 4,816,567。
一方面，提供编码本文报告的融合多肽的部分的分离的核酸。
一方面，提供包含所述核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。
一方面，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码包含融合多肽的第一重链Fc区的氨基酸序列和包含融合多肽的第二重链Fc区的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含融合多肽的第一重链Fc区的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含融合多肽的第二重链Fc区的氨基酸序列的核酸的第二载体。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如人胚肾(HEK)细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
一方面，提供制备本文报告的融合多肽的方法，其中所述方法包括在适于多肽的Fc区部分表达的条件下培养包含编码上文提供的融合多肽的Fc区部分的核酸的宿主细胞，并任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收融合多肽的Fc区部分，并用化学方法或酶促方法使融合多肽的重组产生的Fc区部分与融合多肽的相应的其它脂质化肠降血糖素受体配体部分缀合。融合多肽的脂质化肠降血糖素受体配体多肽部分可重组产生并在随后修饰或可完全合成产生。
为了重组产生融合多肽的部分，分离编码例如上述融合多肽的部分的核酸，***用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一种或多种载体中。可采用常规程序容易地分离和/或产生所述核酸。
用于编码多肽的载体克隆或表达的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，多肽可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时(参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523、Charlton, Methods in Molecular Biology 248(2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (编辑), Humana Press, Totowa, NJ)，描述了大肠杆菌中抗体片段的表达)。在表达后，多肽可以可溶性组分从细菌细胞糊浆(cell paste)中分离，并可进一步纯化。
除原核生物以外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径被“人源化”的真菌和酵母菌株，使得产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽(参见例如Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414和Li等, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)。
用于糖基化多肽表达的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞连用的多个杆状病毒毒株，特别用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可用作宿主(参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429 (描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系将是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例为用SV40转染的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather, Biol. Reprod. 23 (1980)243-251)的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；描述于例如Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68的TRI细胞；MRC 5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR阴性CHO细胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980)4216)和骨髓瘤细胞系例如Y0、NS0和Sp2/0。有关适于多肽产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268(B.K.C. Lo, (编辑), Humana Press, Totowa, NJ)。
IV. 药物制剂
通过将具有所需纯度的所述融合多肽与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Osol, A., (编辑), Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, (1980))混合来制备本文报告的融合多肽的呈冻干制剂或水性溶液剂形式的药物制剂。药学上可接受的载体一般在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括但不限于：缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20 (HYLENEX®，Baxter International，Inc.)。某些示例性的sHASEGP及其使用方法，包括rHuPH20，描述于US 2005/0260186和US 2006/0104968。一方面，sHASEGP与一种或多种其它的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于US 6,267,958。水性抗体制剂包括描述于US 6,171,586和WO 2006/044908的那些，后一制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
需要时，本文制剂还可含有一种以上活性成分用于被治疗的具体适应症，尤其是具有不会彼此不利影响的补充活性的活性成分。所述活性成分适宜以有效用于预期目的的量组合存在。
可将活性成分包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊)、胶态药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒和纳米胶囊)或粗乳状液中。所述技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A., (编辑), (1980)。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品的形式，例如膜剂或微胶囊剂。
待用于体内给药的制剂一般是无菌的。无菌性可容易地通过例如无菌滤膜过滤来实现。
V. 治疗方法和组合物
在治疗方法中可使用本文报告的任何融合多肽。
本发明的一方面，使用本文报告的融合多肽用于治疗疾病。在一个实施方案中，疾病如此，使得有利的是与包含野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比，融合多肽的效应子功能强降低至少50%；在一个优选的实施方案中，与包含野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比降低超过95%。
一方面，本文报告的融合多肽用于制备用于治疗疾病的药物，其中有利的是与包含野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比，融合多肽的效应子功能强降低；在一个优选的实施方案中，与包含野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比，效应子功能降低超过95%。
本文报告的一个方面是治疗患有疾病的个体的方法，其中有利的是与包含野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽相比，本文报告的融合多肽或缀合物的效应子功能强降低，所述方法包含给予个体有效量的本文报告的融合多肽或缀合物。
效应子功能的强降低是效应子功能的降低达包含野生型人免疫球蛋白Fc区的融合多肽所诱导的效应子功能的至少50%。
所述疾病为例如其中靶定的细胞不应被例如ADCC、ADCP或CDC破坏的所有疾病。
可用本文报告的融合多肽治疗的病况有许多，包括代谢障碍。
本文报告的融合多肽通过任何合适的方法给予，包括肠内(口服或直肠)、胃肠、舌下、唇下、胃肠外、皮下、静脉内、皮内、腹膜内、肺内和鼻内。在一个实施方案中，通过片剂、胶囊剂或小滴剂给予剂量。
为了预防或治疗疾病，融合多肽的合适剂量将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和进程、融合多肽是针对预防性还是针对治疗性目的给予、既往治疗、患者的临床史和对融合多肽的反应以及主治医师的判断。融合多肽适宜一次性或在一系列治疗中给予患者。
根据疾病的类型和严重程度，不论例如通过一次或多次单独的给药还是通过连续输注，约1 μg/kg-15 mg/kg (例如0.1-20 mg/kg)的融合多肽是用于给予患者的初始候选剂量。典型的每日剂量的范围可为约1 μg/kg-100 mg/kg或更高，这取决于上述因素。对于在几天或更长时间内(取决于病况)重复给药，保持治疗直到出现所需的疾病症状受抑制。然而，其它剂量方案将是有用的。通过常规技术和测定法容易监测这种治疗的进展。
代谢综合征，亦称代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征或Reaven氏综合征，是一种累及超过5千万美国人的病症。代谢综合征的特征通常在于一组下列危险因素的至少3种或更多种：(1)腹部肥胖(腹部和腹部周围脂肪组织过量)，(2)致动脉粥样化血脂异常(atherogenic dyslipidemia) (血脂障碍包括提高斑块在动脉壁中蓄积的高甘油三酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇)，(3)血压升高，(4)胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受，(5)血栓前状态(例如血液中高的血纤蛋白原或纤溶酶原激活物抑制物-1)，和(6)促炎状态(例如血液中C-反应性蛋白升高)。其它危险因素可包括衰老、激素失衡和遗传倾向性。
代谢综合征与冠心病和与血管斑蓄积有关的其它病症(例如中风和外周血管疾病，称为动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD))的风险增加相关。患代谢综合征的患者可从其早期阶段的胰岛素抵抗状态发展到充分发展的II型糖尿病，其ASCVD的危险进一步增加。虽不受任何特定理论的束缚，但胰岛素抵抗、代谢综合征和血管疾病间的关系可包括一个或多个同时存在的致病机制，包括胰岛素刺激的血管扩张受损、因氧化应激提高所致胰岛素抵抗相关的NO可得性降低和脂肪细胞来源的激素(例如脂连蛋白)异常(Lteif和Mather,Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B) (2004) 66B-76B)。
按照2001全国胆固醇教育计划成人治疗组(National Cholesterol EducationProgram Adult Treatment Panel, ATP III)，同一个体中下列性状的任何3个符合代谢综合征的标准：(a)腹部肥胖(男性腰围超过102 cm，女性超过88 cm)；(b)血清甘油三酯(150mg/dl或以上)；(c) HDL胆固醇(男性40 mg/dl或更低，女性50 mg/dl或更低)；(d)血压(130/85或更高)；和(e)空腹血糖(110 mg/dl或以上)。按照世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)，有高胰岛素水平的个体(空腹血糖升高或仅餐后葡萄糖升高)且有以下标准的至少两个且符合代谢综合征的标准：(a)腹部肥胖(腰臀围比大于0.9，体重指数为至少30 kg/m2，或腰围尺寸超过37英尺)；(b)显示至少150 mg/dl的甘油三酯水平或低于35mg/dl的HDL胆固醇的胆固醇组；(c)血压为140/90或更高或在高血压治疗中)。(Mathur,Ruchi, “Metabolic Syndrome,” 编辑 Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com,2009年5月11日)。
出于本文的目的，如果个体符合2001国家胆固醇教育计划成人治疗组或WHO设定的标准的任何一个或两个标准，则该个体被视为患有代谢综合征。
虽不受任何特定理论的束缚，但本文所述融合多肽可用于治疗代谢综合征。因此，本发明提供预防或治疗受试者的代谢综合征或减少其1、2、3个或更多个危险因素的方法，所述方法包括以有效预防或治疗代谢综合征或其危险因素的量给予受试者本文所述融合多肽或Fc区多肽缀合物。
本文报告的一个方面是本文报告的融合多肽用于治疗患有糖尿病或肥胖症的个体的方法，所述方法包括给予个体有效量的本文报告的融合多肽。在一个实施方案中，所述方法另包括给予个体有效量的至少一种其它治疗剂。
一方面，提供本文报告的融合多肽用于在个体中刺激胰岛素合成和/或分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食物摄取或/和减轻高血糖症，其包括给予个体有效剂量的本文报告的融合多肽以在个体中刺激胰岛素合成和/或分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食物摄取或/和减轻高血糖症。在一个实施方案中，个体为人。
一方面，本文提供用于诱导体重减轻或防止体重增加的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的对GIP受体和GLP-I受体两者显示活性和任选还对胰高血糖素受体显示活性的本文报告的融合多肽。所述化合物包括本文所述的GIP/GLP-1共同激动剂和胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激动剂。
本文报告的一个方面是本文报告的融合多肽在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗糖尿病或肥胖症。在又一个实施方案中，药物用于治疗糖尿病或肥胖症的方法，所述方法包括给予患有糖尿病或肥胖症的个体有效量的药物。在一个实施方案中，所述方法另包括给予个体有效量的至少一种其它治疗剂。在又一个实施方案中，药物用于刺激胰岛素合成和/或分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食物摄取或/和减轻高血糖症。
在又一个实施方案中，药物用于在个体中刺激胰岛素合成和/或分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食物摄取或/和减轻高血糖症的方法，所述方法包括给予个体有效量的药物以刺激胰岛素合成和/或分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食物摄取或/和减轻高血糖症。按照上述实施方案中任一个的“个体”可以是人。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指从单纯性脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化(不可逆的晚期肝瘢痕形成)的各种肝疾病。NAFLD的所有阶段在肝细胞(hepatocyte)中有着共同的脂肪蓄积(脂肪浸润)。单纯性脂肪肝是在肝细胞中某种脂肪类型甘油三酯异常蓄积而无炎症或瘢痕形成。在NASH中，脂肪蓄积与肝脏的炎症(肝炎)和瘢痕形成(纤维变性)的不同程度有关。炎性细胞可破坏肝细胞(肝细胞坏死)。在术语“脂肪性肝炎”和“脂肪坏死”中，脂肪(steato)是指脂肪浸润，肝炎是指肝脏的炎症，坏死是指被毁的肝细胞。NASH最终可导致肝的瘢痕形成(纤维变性)和随后不可逆的晚期瘢痕形成(肝硬化)。由NASH引起的肝硬化是NAFLD范围中最后和最严重的阶段。Mendler, Michel, “FattyLiver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and NonalcoholicSteatohepatitis (NASH),” 编辑, Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, 2005年8月29日))。
酒精性肝病或酒精诱导的肝疾病包括3种过量消耗酒精相关的或过量消耗酒精引起的病理学上不同的肝脏疾病：脂肪肝(脂肪变性)、慢性或急性肝炎和肝硬化。酒精性肝炎的范围可从以异常实验室试验为疾病的唯一指征的轻度肝炎，到具有以下并发症的重度肝功能障碍：例如黄疸(由胆红素潴留引起的黄色皮肤)、肝性脑病(由肝衰竭引起的神经功能障碍)、腹水(腹部的积液)、出血性食管静脉曲张(食管中的静脉曲张)、异常血凝和昏迷。在组织学上，酒精性肝炎具有肝细胞气球样变性、嗜中性粒细胞和有时马洛里小体(细胞中间丝蛋白异常聚集)的炎症的特征性表现。肝硬化在解剖学上的特征在于伴发纤维变性的广泛性肝中小结。(Worman, Howard J., “Alcoholic Liver Disease”, ColumbiaUniversity Medical Center网站)。
虽不受任何特定理论的束缚，但是本文所述融合多肽可用于治疗酒精性肝病、NAFLD或其任何病期，包括例如脂肪变性、脂肪性肝炎、肝炎、肝脏炎症、NASH、肝硬化或其并发症。因此，本发明提供预防或治疗受试者的酒精性肝病、NAFLD或其任何病期的方法，所述方法包括以有效预防或治疗酒精性肝病、NAFLD或其病期的量给予受试者本文所述融合多肽。所述治疗方法包括以下1、2、3种或更多种的降低：肝脂肪含量、肝硬化的发病率或进展、肝细胞癌的发病率、炎症体征，例如异常肝酶水平(例如天冬氨酸氨基转移酶AST和/或丙氨酸氨基转移酶ALT或LDH)、血清铁蛋白升高、血清胆红素升高和/或纤维变性体征，例如TGF-β水平升高。在优选的实施方案中，使用融合多肽治疗已发展到超过单纯性脂肪肝(脂肪变性)并显示炎症体征或肝炎的患者。所述方法可例如导致AST和/或ALT水平降低。
一方面，本文提供包含本文报告的任何融合多肽的药物制剂例如用于上述治疗方法的任一种。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的融合多肽的任一种和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的融合多肽的任一种和至少一种其它治疗剂。
本文报告的融合多肽在治疗中可单独使用或与其它药剂组合使用。例如，本文报告的融合多肽可与至少一种其它治疗剂共同给予。
上述这类联合疗法包括联合给药(其中在相同或不同的制剂中包括两种或更多种治疗剂)和分别给药，在此情况下，给予本发明的抗体可在给予其它治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。
本文报告的融合多肽可以与良好医疗实践一致的方式配制、确定剂量或给予。在这种情况下供考虑的因素包括被治疗的具体病症、被治疗的具体哺乳动物、各个患者的临床情况、病因、药剂递送的部位、给药方法、给药安排和医师已知的其它因素。融合多肽不必但任选与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。这类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的融合多肽的量、病症或治疗的类型和上述其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量并用本文所述给药途径使用，或按本文所述剂量的约1-99%，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文报告的融合多肽的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、融合多肽的类型、疾病的严重程度和进程、融合多肽是针对预防性还是针对治疗性目的给予、既往治疗、患者的临床史和对融合多肽的反应和主治医师的判断。融合多肽适宜一次性或在一系列治疗中给予患者。融合多肽或缀合物的一个示例性剂量的范围可为约0.05 mg/kg-约10 mg/kg。因此，可将约0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何组合)的一个或多个剂量给予患者。所述剂量可间歇给予，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2-约20剂，或例如约6剂的融合多肽)。可给予最初较高的负荷剂量，接着一个或多个较低剂量。然而，其它剂量方案将是有用的。该治疗的进展可容易地通过常规技术和测定法监测。
VI. 制品
本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗和/或预防上述病症的物质的制品。制品包括容器和在容器上或随容器一起的标签或包装说明书(package insert)。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料例如玻璃或塑料制成。容器容纳组合物本身或与有效用于治疗和/或预防病况的另一种组合物组合的组合物，并且可具有无菌接口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有用皮下注射针可穿透的瓶塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本文报告的融合多肽。标签或包装说明书标明组合物可用于治疗所选的病况。而且，制品可包含(a)组合物包装在其中的第一容器，其中该组合物包含本文报告的融合多肽；和(b)组合物包装在其中的第二容器，其中该组合物包含其它治疗剂。在这个实施方案中，本发明的制品可另包括标明组合物可用于治疗具体病况的包装说明书。备选或另外，制品可另包括装有药学上可接受的缓冲剂的第二(或第三)容器，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。可另包括从商业和用户角度看是需要的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。
本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过引用以其整体予以明确结合。
具体的实施方案：
1. 一种融合多肽，其包含
- 1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个包含与脂质共价缀合的氨基酸，和
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
2. 第1项的融合多肽，其特征在于融合多肽体内与内源多肽缔合。
3. 第1-2项中任一项的融合多肽，其特征在于与脂质的缀合通过氨基酸侧链上的官能团。
4. 第1-3项中任一项的融合多肽，其特征在于与脂质共价缀合的肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸残基是非天然存在的氨基酸残基。
5. 第1-4项中任一项的融合多肽，其特征在于脂质选自脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂质、异戊烯醇脂质、糖脂和聚酮化合物。
6. 第1-5项中任一项的融合多肽，其特征在于与脂质的缀合选自豆蔻酰化(14:0)、棕榈酰化(16:0)、异戊二烯化、辛酰化、archaeolyation、胆甾醇化。
7. 第6项的融合多肽，其特征在于与脂质的缀合是棕榈酰化。
8. 第1-7项中任一项的融合多肽，其特征在于
i) 假如肠降血糖素受体配体多肽通过其C端与人免疫球蛋白Fc区缀合，则氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 75)，任选LPETG (SEQ ID NO: 74)在肠降血糖素受体配体多肽的C端和人免疫球蛋白Fc区的N端之间，和
ii) 假如肠降血糖素受体配体多肽通过其N端与人免疫球蛋白Fc区缀合，则氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 75)，任选LPETG (SEQ ID NO: 74)在肠降血糖素受体配体多肽的N端和人免疫球蛋白Fc区的C端之间。
9. 第1-8项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是天然存在的肠降血糖素受体配体多肽或合成的肠降血糖素受体配体多肽。
10. 第1-9项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽包含选自SEQ ID NO: 1-39、76、77和120-125的氨基酸序列。
11. 第1-10项中任一项的融合多肽，其特征在于包含在肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸序列和人免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列之间的氨基酸序列LPETG (SEQ ID NO:74)。
12. 第8-11项中任一项的融合多肽，其特征在于包含LPETG (SEQ ID NO: 74) C端或N端的多肽Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:88)、Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 90)之一。
13. 第8-12项的融合多肽，其特征在于包含(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO:57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)，或(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ ID NO: 65-67和92-94)。
14. 第8-12项中任一项的融合多肽，其包含SEQ ID NO: 57-67的任一个。
15. 第8-14项中任一项的融合多肽，其包含LPXTG (SEQ ID NO: 75)的C端或N端的Gly或Gly-Gly。
16. 第1-15项中任一项的融合多肽，其特征在于人免疫球蛋白Fc区是具有329位的氨基酸残基的突变和选自228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位的氨基酸残基的至少一个氨基酸成为不同残基的至少一个另外的突变的人免疫球蛋白Fc区，其中Fc区的残基按照Kabat的EU索引编号。
17. 第1-16项中任一项的融合多肽，其特征在于与包含野生型人免疫球蛋白IgGFc区的人免疫球蛋白Fc区融合多肽相比，所述人免疫球蛋白Fc区与人FcγRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI的亲和力降低。
18. 第1-17项中任一项的融合多肽，其特征在于人免疫球蛋白Fc区包含至少一个选自以下的突变：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和P331S。
19. 第1-18项中任一项的融合多肽，其特征在于如果Fc区是人IgG1同种型的，则人免疫球蛋白Fc区包含突变L234A、L235A和P329G，或如果Fc区是人IgG4同种型的，则包含突变S228P、L235E和P329G。
20. 第1-19项中任一项的融合多肽，其特征在于与由野生型人免疫球蛋白Fc区诱导的凝血细胞聚集相比，由所述人免疫球蛋白Fc区诱导的凝血细胞聚集减少。
21. 第1-20项中任一项的融合多肽，其特征在于包含1个或2个肠降血糖素受体配体多肽。
22. 第21项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽的每一个与人免疫球蛋白Fc区的一个多肽链的N端缀合。
23. 第21项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽的每一个与人免疫球蛋白Fc区的一个多肽链的C端缀合。
24. 第1-23项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽彼此地独立选自GIP、GLP-1、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4、二重GIP-GLP-1激动剂、三重GIP-GLP-1-胰高血糖素受体激动剂、嵌合GIP/GLP激动剂及其前体、衍生物或功能片段。
25. 第1-24项中任一项的融合多肽，其特征在于人免疫球蛋白Fc区包含选自SEQID NO: 42-56的氨基酸序列。
26. 第1-25项中任一项的融合多肽，其特征在于融合多肽包含在人免疫球蛋白Fc区和肠降血糖素受体配体多肽之间的接头，其中接头包含选自SEQ ID NO: 57-69和82-94的氨基酸序列。
27. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1(7-37) (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，SEQ ID NO: 01)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
28. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1(7-36) (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR，SEQ ID NO: 02)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
29. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-3 (HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS，SEQ ID NO: 03)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
30. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS，SEQ ID NO: 04)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
31. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于SEQ ID NO: 01-04的任一个，其中相对于SEQ ID NO: 01-04，进行了1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
32. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(1-31) desGlu(17) Tyr(32) (HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY，SEQ IDNO: 05)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
33. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(1-30) Tyr(31) (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY，SEQ ID NO: 06)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
34. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-4(9-39) (DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS，SEQ ID NO: 07)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
35. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列SYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 08)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
36. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列SSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 09)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
37. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列VSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 10)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
38. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列DVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 11)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
39. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 12)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
40. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 13)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
41. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 14)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
42. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 15)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
43. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 16)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
44. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 17)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
45. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 18)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
46. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 19)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
47. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HDAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR (SEQ ID NO: 20)，其X = K或R，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
48. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 21) (杂合GLP-1/毒蜥外泌肽多肽)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
49. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK (SEQ ID NO: 22)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
50. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK (SEQ ID NO: 23)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
51. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 24)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
52. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 25)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
53. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY (SEQ ID NO: 26)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
54. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY (SEQ ID NO: 27)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
55. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于氨基酸序列DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS (SEQ ID NO: 28)，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
56. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 76)，其相对于SEQ ID NO: 76具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
57. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1 (SEQ ID NO: 1或2)，其相对于SEQ ID NO: 1或2具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
58. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于GIP (SEQ ID NO: 77)，其相对SEQ ID NO: 77具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
59. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-3或-4 (SEQ ID NO: 3或4)，其相对SEQ ID NO: 3或4具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
60. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于胰高血糖素(SEQ ID NO: 76)，其中类似物包含SEQ ID NO: 76，其具有(a)赋予GIP激动剂活性的1位的氨基酸修饰，(b)稳定类似物C端部分(氨基酸12-29)的α螺旋结构的修饰，和(c)任选相对于SEQ ID NO: 76的1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个另外的氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
61. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVCWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 29)，其X =aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
62. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 30)，其X =aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
63. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 31)，其X =aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
64. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG (SEQ ID NO: 32)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
65. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGG G (SEQ ID NO: 33)，其X = aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
66. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 34)，其X =aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
67. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 35)，其X =aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
68. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 36)，其X =aib，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
69. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 37)，其X =aib并具有残基16和20的侧链间的内酰胺环，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
70. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 38)，其X =aib并具有残基16和20的侧链间的内酰胺环，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
71. 第1-26项中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽是或包含氨基酸序列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVCWLLAG (SEQ ID NO: 39)，其X = aib并具有残基16和20的侧链间的内酰胺环，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
72. 包含Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO: 120)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
73. 包含脱氨基-Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO: 121)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
74.包含Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQID NO: 122)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
75. 包含Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQID NO: 123)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
76. 包含Ac-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQID NO: 124)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
77. 包含Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQID NO: 125)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
78. 包含Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-LPETGGSGS (SEQ ID NO: 109)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
79. 包含脱氨基Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 110)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
80. 包含Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 111)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
81. 包含Ac-d-YAVGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 112)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
82. 包含Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 113)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
83. 包含Ac-d-YAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 114)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
84. 包含Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLGGGLPETGGSGS (SEQ IDNO: 115)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
85. 包含Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSGGGLPETGGSGS (SEQ ID NO: 116)的氨基酸序列的脂质化肠降血糖素受体配体多肽。
86. 一种融合多肽，其包含
- 1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中人免疫球蛋白Fc区选自SEQ ID NO: 42-53的人免疫球蛋白Fc区，
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个彼此独立地直接或通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此如果接头肽存在，则选自(GGS)n，其中n=1-4 (SEQID NO: 82-84)；Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO:57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；和(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ ID NO: 65-67和92-94)，和
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
87. 一种融合多肽，其包含
- 1个或2个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中人免疫球蛋白Fc区选自SEQ ID NO: 42-53的人免疫球蛋白Fc区，
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽各自彼此独立地直接或通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此如果接头肽存在，则选自(GGS)n，其中n=1-4 (SEQ IDNO: 82-84)；Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO: 57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；和(GGGGGS)o，其中o=1-6(SEQ ID NO: 65-67和92-94)，和
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽各自通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
88. 一种融合多肽，其包含
- 1个或2个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中人免疫球蛋白Fc区包含i) SEQ ID NO: 49的2个氨基酸序列或ii) SEQ ID NO:52的1个氨基酸序列和SEQ ID NO: 53的1个氨基酸序列，
其中1个或2个、3个或4个肠降血糖素受体配体多肽各自通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的N端共价连接，由此接头肽选自(GGGS)4 (SEQ ID NO: 58)、(GGGGS)3 (SEQ ID NO:62)和(GGGGGS)o，其中o=2-3 (SEQ ID NO: 65-66)，和
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽各自通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
89. 一种药物组合物，其包含第1-88项中任一项的融合多肽。
90. 第1-88项中任一项的融合多肽作为药物的用途。
91. 第1-88项中任一项的融合多肽用于制备用于治疗疾病的药物的用途，其中有利的是与由包含野生型人IgG Fc区的融合多肽诱导的效应子功能相比，包含野生型人IgGFc区的变异Fc区的融合多肽的效应子功能降低。
92. 包含野生型人IgG Fc区的变异Fc区的第1-88项中任一项的融合多肽缀合物的用途，其中野生型人IgG Fc区的Pro329被甘氨酸取代，其中残基按照Kabat的EU索引编号，其中融合多肽显示对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力降低用于下调ADCC达由包含野生型人IgG Fc区的融合多肽诱导的ADCC的至少20%，和/或用于下调ADCP。
93. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是2型糖尿病。
94. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是肥胖症。
95. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是胰岛素抵抗。
96. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是1型糖尿病。
97. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是骨质疏松症。
98. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是脂肪性肝炎。
99. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
100. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于疾病是代谢综合征。
101. 第90-92项中任一项的用途，其特征在于与另外的2型糖尿病药物组合给予第1-88项中任一项的融合多肽。
102. 第101项的用途，其特征在于另外的2型糖尿病药物是胰岛素。
103. 一种多肽，其包含脂质化肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸序列和LPXTG(SEQ ID NO: 75)，其中X为任何氨基酸。
104. 第103项的多肽，其中X为酸性氨基酸。
105. 第103-104项中任一项的多肽，其中酸性氨基酸为Glu。
106. 第103-105项中任一项的多肽，其特征在于包含LPETG (SEQ ID NO: 74) C端的Gly-Gly或Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 88)、Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 90)。
107. 第103-106项中任一项的多肽，其特征在于包含(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQID NO: 57-60、88和89)、(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)或(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ ID NO: 65-67和92-94)。
108. 第103-107项中任一项的多肽，其特征在于包含SEQ ID NO: 57-67的任一个。
109. 第103-107项中任一项的多肽，其特征在于包含LPXTG (SEQ ID NO: 75) N端的Gly或Gly-Gly。
110. 第102-109项中任一项的多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
111. 第110项的用途，其特征在于药物的制备包括使用分选酶A。
实施例
下列实施例是本发明方法和组合物的实施例。要了解，鉴于上文提供的一般说明，可以实施各种其它的实施方案。
虽然为了清楚理解的目的，通过说明和实例以某种细节描述了前述发明，但是描述和实例不应解释为限制本发明的范围。
实施例1
Fc区和肠降血糖素受体配体多肽的分选酶A缀合
G3-Fc:
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 68)。
G4S3-Fc：
GGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 69)。
长肽24A：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGSGS-酰胺(SEQ ID NO:70)
短肽24A：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGGLPETGGSGS-酰胺(SEQ ID NO: 71)
长肽24N：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGSGS-酰胺(SEQ ID NO:118)
短肽24N：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGGLPETGGSGS-酰胺(SEQ ID NO: 119)
对于分选酶介导的转肽反应，使用N端截短的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分选酶A (Δ1-59)。反应在含有50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl，pH 7.5的缓冲液(分选酶缓冲液)中进行。在反应中，将在其C端携带分选酶基序的化学合成的肽(LPETGGSGS，SEQ ID NO: 72)和在其N端携带寡甘氨酸基序的Fc区连接，产生连接性序列肽-LPETGGG-重链Fc区。为了进行反应，所有试剂都被引入分选酶缓冲液的溶液中。在第一步中，将GGG-Fc和肽混合，在加入分选酶A后开始反应。通过吸取或涡旋将各组分混合，在37℃下孵育1小时和24小时，这取决于肽。随后，在转肽反应后直接纯化连接产物，或通过冷冻反应混合物终止反应，在-20℃下保存直到纯化。
摩尔比率肽:Fc:分选酶= 8:1:0.8
结果
长和短合成肽两者通过分选酶介导的转肽分别与在N端携带短的三甘氨酸基序或较长的GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 62)序列的IgG-Fc区片段偶联。组合见表1。
表1：Fc区与肽的缀合
对于长肽-G3-Fc、短肽-G3-Fc、长肽G4S3-Fc和短肽G4S3-Fc，Fc区-肠降血糖素受体配体多肽缀合物分别具有SEQ ID NO: 95-98的氨基酸序列。
分选酶介导的转肽分析
通过SDS-PAGE分析了转肽反应的等分试样。实例见图1，显示了长肽或短肽与G3-Fc缀合的结果。从凝胶来看，连接的效率通过光密度测定法估算。如表2所示，通过分析型反相HPLC估算，在最终的纯化产物中，约5%的Fc区不与肽缀合，而约90%的Fc区与2个肽部分缀合。
表2： 在纯化含G3-Fc的肽的分选酶介导的转肽后的最终收率
| 长肽 | 短肽 | |
| 2x肽+ G3-Fc [%] | 87.00 | 90.75 |
| 1x肽+ G3-Fc [%] | 6.91 | 6.51 |
| 未连接的G3-Fc [%] | 6.09 | 2.73 |
不同缀合物的生物活性见表3。
表3：通过分选酶介导的转肽产生的肽-Fc区融合分子的体外功效
实施例2
环AMP测定法
使用下列材料：cAMP HunterTM CHO-K1 GLP-1或GIP细胞系(DiscoveRxCorporation)、Ham's F-12 (Gibco目录号21765)、10%热灭活FBS (Gibco目录号16000)、青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Gibco目录号10378)和800 µg/ml G418 (遗传霉素，Gibco目录号10131)。
将表达GLP-1或GIP受体的CHO-K1细胞以100,000个细胞/ml的细胞密度悬浮于含有0.5 mM IBMX (Sigma-Aldrich目录号17018)和0.1% BSA (Sigma-Aldrich目录号A-2153))的10 ml测定缓冲液(Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(Sigma-Aldrich目录号K4002)中。随后将细胞悬液(25 µl)转移到half-area板(Costar目录号3694)中，将药物溶液(25 µl)以合适的浓度加入孔中。将细胞在板振荡器上在室温下孵育30分钟。按照生产商的说明书，使用Cisbio “cAMP动态试剂盒”测定cAMP含量(Cisbio Bioassays，France)。所有实验以一式两份进行，药物测试至少两次(N ≥ 2)。
实施例3
急性DIO小鼠研究
将雄性C57Bl/6小鼠(年龄约7个月；Jackson实验室(Bar Harbor，ME，USA))关养在具有12小时光:12小时暗周期的温度和湿度受控制的环境中。小鼠随意获得水，在8周龄时开始高脂肪饲料饮食(HFD；58%的膳食kcal为含蔗糖的脂肪，Research Diets D12331)和水，该条件在整个研究中保持。在开始治疗期之前通过体重和食物摄取分选小鼠，并且每笼关养4只动物。使用前，使小鼠适应至少6天。在开始暗周期前，给予小鼠溶媒(s.c.)、对照(人IgG1-Fc；s.c.)或化合物(20 nmol/kg，s.c.长肽-G3Fc或短肽-G3Fc)一次。之后每天监测体重和食物摄取持续5天(N = 8只小鼠/组)。
数据分析：
所显示的所有数据为均值±标准误差(s.e.m.)。数据的统计评价应用单因素ANOVA进行，接着Dunnett检验以确定溶媒和药物处理组之间存在的统计显著性差异。在P<0.05时差异被认为有统计显著性。数据分析应用GraphPad软件(GraphPad Prism)进行。
结果：
在雄性DIO小鼠中单次给予化合物长肽-G3Fc和短肽-G3Fc (20 nmol/kg，s.c.)诱导相对于溶媒处理动物的体重增加显著降低，并减少累积食物摄取(图2)。
实施例4
急性db/db小鼠研究
将10周龄雄性db/db小鼠(C57BLKS；BKS. Cg-m +/+ Lepr (000642)；JacksonLaboratories，USA)关养在具有12小时光:12小时暗周期的温度和湿度受控制的环境中，可以随意得到正常饲料和水(饲料，5% kcal为脂肪，Harlan 7912)。根据随意饮食的血糖水平，将小鼠(约42 g)随机分到不同的治疗组。在开始暗周期前给予小鼠溶媒(s.c.)、对照(s.c.)或化合物(20 nmol/kg，s.c.)。次日，在腹膜内葡萄糖攻击试验前，使小鼠禁食6小时(N = 8只小鼠/组)。在6小时禁食后，从尾夹收集血样用于测定基线值(t = 0分钟)，使用手持FreeStyle Freedom Lite血糖仪(Abbott)。然后给小鼠腹膜内推注葡萄糖(1 g/kg；25%葡萄糖溶液)，按定期间隔(t = 15、30、60和120分钟)收集其它血样用于葡萄糖测量。为了分析化合物对腹膜内葡萄糖耐受性的作用，采用梯形试样法(trapezoid method)，测定血糖波动的曲线下面积(AUC0-120分钟)。
数据分析：
所显示的所有数据为均值±标准误差(s.e.m.)。数据的统计评价应用单因素ANOVA进行，接着Dunnett检验以确定溶媒和药物处理组之间存在的统计显著性差异。在P<0.05时差异被认为有统计显著性。数据分析应用GraphPad软件(GraphPad Prism)进行。
结果：
将化合物长肽-G3Fc和短肽-G3Fc (20 nmol/kg，s.c.)快速给予雄性db/db小鼠，使响应腹膜内葡萄糖攻击时的葡萄糖波动显著降低(ipGTT；AUC ipGTT) (图3)。该作用是剂量依赖性的(图4)。
实施例5
含分选酶标签的重组抗体Fc-片段的组合物、表达和纯化
重组DNA技术
按Sambrook, J.等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述，采用标准方法操作DNA。按照生产商说明书使用分子生物学试剂。
基因和寡核苷酸合成
在Geneart GmbH (Regensburg，Germany)通过化学合成制备所需基因区段。将合成的基因片段克隆至大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。或者，通过使以化学法合成的寡核苷酸退火或通过PCR使短的合成DNA片段装配。通过metabion GmbH (Planegg-Martinsried，Germany)制备各自的寡核苷酸。
试剂
如非另有说明，则按照生产商方案使用所提供的所有商品化化学品、抗体和试剂盒。
表达质粒
通过使编码各元件的DNA片段融合，来装配包含人IgG1 Fc区(铰链、CH2、CH3)和各三元G基序或SrtA识别基序(含或不含间插接头肽)的Fc区部分编码基因。
人IgG1 Fc区的氨基酸序列：
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
(SEQ ID NO: 42)。
含突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区的氨基酸序列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALGA PIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
(SEQ ID NO: 49)。
含突变L234A、L235A、P329G和孔突变的人IgG1 Fc区的氨基酸序列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALGA PIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
(SEQ ID NO: 52)。
含突变L234A、L235A、P329G和结突变的人IgG1 Fc区的氨基酸序列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALGA PIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
(SEQ ID NO: 53)。
三元G基序：
GGG
(SEQ ID NO: 99)
分选酶识别基序：
LPETGGSGS
(SEQ ID NO: 72)
接头肽：
GGGGSGGGGSGGGGS
(SEQ ID NO: 62)。
含N端三元G基序和突变L234A、L235A和P329G的人IgG1 Fc区的氨基酸序列：
GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 117)。
表达载体还包含载体pUC18的复制起点(这允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄西林抗性的β-内酰胺酶基因。
转录单位包含从5’到3’方向的下列功能元件：
- 包括内含子A的来自人巨细胞病毒(P-CMV)的即时早期增强子和启动子，
- 人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，
- 鼠免疫球蛋白重链信号序列，
- 编码Fc区部分的核酸，和
- 牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
含分选酶标签的抗体Fc-片段和衍生物的表达
在培养在F17培养基(Invitrogen Corp.)中的瞬时转染的HEK293细胞(人胚肾细胞系293衍生的)中产生抗体。有关各载体的转染按实施例6所述。使用"293-Free"Transfection Reagent (Novagen)。从各表达质粒中表达抗体和抗体-血脑屏障穿梭-融合物。按生产商说明书的规定进行转染。转染后7天，收获含重组抗体的细胞培养上清液。将上清液保存在低温(例如-80℃)下直到纯化。
有关在例如HEK293细胞中人免疫球蛋白重组表达的全面信息见：Meissner, P.等, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203。
含分选酶标签的抗体Fc区的纯化
通过采用蛋白A-SepharoseTM亲和色谱法(GE Healthcare，Sweden)的亲和色谱法和Superdex200大小排阻色谱法，在两个步骤中，从上清液中纯化重组人免疫球蛋白Fc区(或衍生物)。简单地说，将含有人免疫球蛋白Fc区(或衍生物)的澄清的培养上清液加到用PBS缓冲液(10 mM Na2HPO4、1 mM KH2PO4、137 mM NaCl和2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe蛋白A (5-50 ml)柱上。用平衡缓冲液冲掉未结合的蛋白质。将Fc区(或衍生物)用25-50 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.2)洗脱。含有蛋白质的部分用0.1 ml 2 M Tris 缓冲液(pH 9.0)中和。然后，合并洗脱的蛋白质流分，用Ultra离心过滤器装置(MWCO：10 K，Millipore)浓缩，加载到用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200HiLoad 26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)。按照Pace等, Protein Science 4(1995) 2411-2423，使用以氨基酸序列为基础计算的摩尔消光系数，以320 nm处的OD作为背景校正，通过测定280 nm处的光密度(OD)，测定纯化的Fc区(或-衍生物)的蛋白质浓度。合并单体Fc区流分，速冻并保存在-80℃下。提供样品的部分用于后续蛋白质分析和表征。
通过在还原剂(5 mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在时通过SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色，证实人免疫球蛋白Fc区(或衍生物)的同质性。按照生产商说明书使用NuPAGE®Pre-Cast凝胶***(Invitrogen，USA) (4-20% Tris-甘氨酸凝胶)。
在还原条件下，在SDS-PAGE之后，鉴定出与人免疫球蛋白Fc区有关的多肽链位于类似于计算的分子量的表观分子大小处。通过蛋白A分析所有构建体的表达水平。在所述非最优化的瞬时表达实验中，平均蛋白质产量介于32 mg和174 mg纯化的蛋白质/升细胞培养上清液之间。
实施例6
脂质化肠降血糖素受体配体多肽的合成
缩略语：
Ac： 乙酰基
Aib： 氨基异丁酸
Aloc： 烯丙氧基羰基
C16： 棕榈酸(palmitoic acid)
DBU： 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCM： 二氯甲烷
DDE： N-(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基)
脱氨基Tyr：3-(4-羟苯基)丙酸
d-y： D-酪氨酸
d-h： D-组氨酸
DIPEA： N,N-二异丙胺
DMF： N,N-二甲基甲酰胺
Fmoc： 9-芴基甲氧羰基
gE： γ-谷氨酸
HBTU： 六氟磷酸O-苯并***-N,N,N',N'-四甲基
HOTB： N-羟基苯并***
MeCN： 乙腈
NMP： N-甲基吡咯烷酮
肽合成：
肽的合成在CS Bio CS136XT肽合成仪上进行。通过将氨基酸溶液(0.33 mol/L含有0.05 mol/L HOBt的NMP中)相继加入混合容器中，来构建合成肽。具体地讲，采用COMU/DIPEA活化(4 eq氨基酸，4 eq COMU，8 eq DIPEA (eq=反应当量))单一偶联法进行合成。在偶联步骤结束时(标准在室温下30分钟)，肽基-树脂用哌啶溶液(40%在DMF中，1x10分钟+2x 5分钟)处理以除去N端Fmoc保护基。将树脂用二甲基甲酰胺(DMF)重复洗涤，并且对所需的偶联步骤数目，重复该重复循环。用DMF中的过量的18 eq乙酸酐/DIPEA在室温下处理肽基-树脂30分钟，产生N-加帽的肽。为了在分选酶片段肽的N端引入溴酰基，将DIPEA/DCM(30%)和活化溴乙酸的混合物加入树脂中。通过搅拌1.1 eq溴乙酸和1.1 eq DCC/DCM (对于1.5 g树脂10 ml) 10分钟接着过滤，实现活化。将所得的澄清液加入树脂中，在室温下振荡1小时。
在DDE保护基存在下的酰化和Fmoc切割以及DDE切割：
为了连接脂质化单元(例如棕榈酸，C16)，采用上述标准条件，将一个或两个Dde-Lys(Fmoc)-OH引入所需位置。在定量偶联后，通过DBU/DMF 2%处理除去Fmoc (3x 3分钟连续流，用DMF重复洗涤，重复该程序5次)。采用上述偶联条件，实现酰化基团的偶联。在酰化基团定量偶联后，用20%一水合肼(64%)/DMF 2%除去N端Dde保护基(5x 3分钟，连续流，用DMF重复洗涤)。如上所述进行其余偶联步骤。
切割：
在整个合成结束时，使用二氯甲烷(DCM)使肽基-树脂干燥，用试剂K (82.5/5/5/5/2.5的TFA/苯硫基甲烷/水/苯酚/TIS)在室温下2小时将肽从树脂切割，这通常得到约250 mg(~50%收率)的粗制脱保护肽。具体地讲，将肽基-树脂(30 mg-200 mg)装入烧结筒中，然后加入试剂K (对于1.2 g树脂~20 ml)，将树脂在室温下搅拌2小时。在将液体滤出后，将树脂用5 ml试剂K洗涤，并用3 ml DCM洗涤3次。用冷的***(-18℃)使产物沉淀。将悬浮液离心，滤出液体，将粗制肽重新溶于水/ACN中，冷冻干燥以得到约250 mg (~50%收率)粗制肽。
纯化：
采用使用制备型反相柱(Dr. Maisch Reprosil gold 120 C18，5 µm，16x150 mm)的制备型HPLC将粗制肽纯化，并使用与分析***上相同的固定相洗脱(梯度为190分钟内5-100%B，以1.80 ml/分钟的流速)。所得流分的HPLC分析产生纯流分，将其合并，冷冻干燥，得到白色粉末。
与分选酶片段肽缀合：
将纯化的肽(含有C端半胱氨酸)和分选酶片段肽(N端溴酰基化)溶于水/AcCN (70/30，1 ml/10 mg肽)的混合物中。加入水(1 ml/30 mg肽)和1000 eq脲，用缓冲液(7 M脲，0.05 MTris)将溶液的pH设定为8.4-8.5。在室温下搅拌反应混合物，并通过HPLC监测。如上所述通过制备型HPLC分离最终产物。
分析学(HPLC)：
在下列条件下进行了分析型HPLC分析：4.6x150 Mm Poroshell 120 SB-C18，1.0 Ml/分钟，220 nm UV监测。洗脱***：缓冲液A：0.1%三氟乙酸/10%丙烯腈/90%水，缓冲液B：0.1%TFA/10%水/90% ACN，梯度30分钟内5-100% B。
如上所述通过化学连接引入分选酶片段不是强制性的。还可线性地产生肽以得到全酰胺形式，如化合物17所述。这些肽显示与其硫醚连接的类似物相似的功效。
如上所述合成下列所有其它的肽。
化合物1
NH2-Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-NH2(半胱氨酸酰胺)
(SEQ ID NO: 100)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4671.22；实测值1558.3 (1/3 + H)
化合物2
脱氨基-Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2 (半胱氨酸酰胺)
(SEQ ID NO: 101)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、3-(4-羟苯基)丙酸和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4655.3；实测值1552.7 (1/3 + H)，1164.8 (1/4 + H)
化合物3
Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2 (半胱氨酸酰胺)
(SEQ ID NO: 102)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4655.3；实测值1552.7 (1/3 + H)，1164.8 (1/4 + H)
化合物4
Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2 (半胱氨酸酰胺)
(SEQ ID NO: 103)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4683.3；实测值1562.1 (1/3 + H)，1171.8 (1/4 + H)
化合物5
Ac-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2 (半胱氨酸酰胺)
(SEQ ID NO: 104)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dHis(1-Trt)-OH和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4685.3；实测值1562.8 (1/3 + H)，1172.3 (1/4 + H)
化合物6
Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2 (半胱氨酸酰胺)
(SEQ ID NO: 105)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4711.3；实测值1571.4 (1/3 + H)，1178.8 (1/4 + H)
化合物7
BrAc-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 106)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH和溴乙酸。
MS (M+H+)：预期值1095.9；实测值1096.9 (M+H)
化合物8
BrAc-LPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 107)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH和溴乙酸。
MS (M+H+)：预期值924.7；实测值925.7 (M+H)
化合物9-15通过如上所述的片段连接产生。
化合物9
NH2-Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 108)
使用下列片段：化合物1和化合物7。
MS (M+H+)：预期值5686.23；实测值1895.2 (1/3)，1421.6 (1/4)
化合物10
NH2-Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-LPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 109)
使用下列片段：化合物1和化合物8。
MS (M+H+)：预期值5672.17；实测值1417.3 (1/4)，1134.2 (1/5)
化合物11
脱氨基Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 110)
使用下列片段：化合物2和化合物7。
MS (M+H+)：预期值5674.13；实测值1891.4 (1/3)，1418.5 (1/4)
化合物12
Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 111)
使用下列片段：化合物3和化合物7。
MS (M+H+)：预期值5711.8；实测值1428.7 (1/4 + 4H)
化合物13
Ac-d-YAVGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 112)
使用下列片段：化合物4和化合物7。
MS (M+H+)：预期值5700.2；实测值1900.1 (1/3)
化合物14
Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 113)
使用下列片段：化合物5和化合物7。
MS (M+H+)：预期值5703.2；实测值1901.1 (1/3)，1425.8 (1/4)
化合物15
Ac-d-YAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 114)
使用下列片段：化合物6和化合物7。
MS (M+H+)：预期值5729，2；实测值1432.3 (1/4)，1145.8 (1/5)
化合物16和17如上所述以线性方式合成。
化合物16
Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLGGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 115)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dHis(1-Trt)-OH和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值4519.3；实测值4519.3
化合物17
Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSGGGLPETGGSGS-COOH
(SEQ ID NO: 116)
使用下列氨基酸：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH和棕榈酸。
MS (M+H+)：预期值5550.7；实测值5550.7
实施例7
使用分选酶介导的酶促连接产生人免疫球蛋白Fc区和脂质化肠降血糖素受体配
体多肽的共价缀合物
通用方法：
使用分选酶这种酶介导的连接产生人免疫球蛋白Fc区与脂质化肠降血糖素受体配体多肽的缀合物导致具有确定化学计量关系的缀合物，并且可确保这些缀合物中的化合物保持其活性(无苛刻条件和变性危险/副反应)。为了产生脂质化肠降血糖素受体配体多肽与各人免疫球蛋白Fc区多肽的缀合物，将多肽溶于100% DMF中至16 mM的终浓度。使Fc区在50mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2 (pH=7.5)中达到10 mg/ml的浓度。将分选酶在50mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2 (pH=7.5)中达到17.8 mg/ml的浓度。最后加入分选酶，并通过吸入放出，将多肽、Fc区和分选酶以8:1:0.8摩尔比率(多肽:Fc区:分选酶)混合。在反应混合物中DMF的终浓度低于10% (v/v)。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育60-180分钟。
Fc区和化合物9 (=化合物42)
为了产生含有C端分选酶标签的化合物9的缀合物，将46 mg化合物9溶于500 µL DMF至15.6 mM的浓度。由50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2 (pH=7.5)组成的缓冲液中以17.9 mg/mL (约0.35 mM)的浓度使用50 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQ IDNO: 117)。将化合物9和SEQ ID NO: 117的Fc区以8:1摩尔比率(多肽:Fc区)混合。加入浓度为17.8 mg/mL (约0.99 mM)的14.1 mg分选酶和1415 µL缓冲液，得到10 mg/mL人免疫球蛋白Fc区的终浓度。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去过量的肽、分选酶和未偶联的Fc区。
通过质谱法分析所得缀合物(37.5 mg)。总共86%受测物类被鉴定为与2个脂质化肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量61570)，14%为与一个肠降血糖素受体配体多肽偶联的人免疫球蛋白Fc区(平均质量56248)。
Fc区和化合物10 (=化合物45)
为了产生化合物10的缀合物，将9.0 mg化合物10溶于溶液中，所述溶液在由50 mMTris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2 (pH=7.5)组成的缓冲液中含有浓度为12.1 mg/mL(约0.24 mM)的10 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQ ID NO: 117)。混合物相当于8:1摩尔比率(多肽:Fc区)。然后以17.8 mg/mL (约0.99 mM)的浓度加入2.8 mg分选酶。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去分选酶和未偶联的Fc区。
所得缀合物(8.8 mg)通过质谱法分析。总共85%受测物类被鉴定为与2个脂质化肠降血糖素受体多肽偶联的Fc区(平均质量61227)，14%为与1个肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量56075)。
Fc区和化合物11 (=化合物74)
为了产生化合物11的缀合物，将9.2 mg化合物11溶于100 µL DMF中至15.6 mM的浓度。使用在由50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2 (pH=7.5)组成的缓冲液中浓度为20.6 mg/mL (约0.40 mM)的10 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQ ID NO: 117)。将化合物11和Fc区以8:1摩尔比率(多肽:Fc区)混合。加入总共2.8 mg浓度为17.8 mg/mL (约0.99 mM)的分选酶和357 µL缓冲液，得到混合物中10 mg/mL Fc区的终浓度。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去过量的肽、分选酶和未偶联的Fc区。
所得缀合物(2.1 mg)通过质谱法分析。总共55%受测物类被鉴定为与2个肠降血糖素受体配体多肽缀合的Fc区(平均质量61543)，45%为与1个肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区分子(平均质量56233)。
Fc区和化合物12 (=化合物80)
为了产生化合物12的缀合物，将20.0 mg化合物12溶于144 µL DMF中至23.5 mM的浓度。使用在由50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、240 mM蔗糖(pH=7.5)组成的缓冲液中浓度为17.9 mg/mL (约0.35 mM)的总共28.7 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQ ID NO: 117)。将化合物12和Fc区以6:1摩尔比率(多肽:Fc区)混合。然后以17.8 mg/mL(约0.99 mM)的浓度加入8.1 mg分选酶和812 µL缓冲液，得到混合物中10 mg/mL Fc区的终浓度。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去过量的肽、分选酶和未偶联的Fc区。
所得缀合物(24.2 mg)通过质谱法分析。共总84%受测物类被鉴定为与2个肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量61625)，16%为与1个肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量56274)。
Fc区和化合物13 (=化合物77)
为了产生化合物13的缀合物，将9.3 mg化合物13溶于100 µL DMF中至15.6 mM的浓度。使用在由50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2 (pH=7.5)组成的缓冲液中浓度为15.4 mg/mL (约0.30 mM)的总共10 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQ ID NO:117)。将化合物13和Fc区以8:1摩尔比率(多肽:Fc区)混合。然后加入浓度为17.8 mg/mL(约0.99 mM)的2.8 mg分选酶和193 µL缓冲液，得到混合物中10 mg/mL Fc区的终浓度。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去过量的肽、分选酶和未偶联的Fc区。
所得缀合物(7.5 mg)通过质谱法分析。总共90%受测物类被鉴定为与2个脂质化肠降血糖素受体多肽偶联的Fc区(平均质量61597)，10%为与1个脂质化肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量56261)。
Fc区和化合物14 (=化合物808)
为了产生化合物14的缀合物，将4.1 mg化合物14溶于61 µL DMF中至11.7 mM的浓度。使用在由50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、240 mM海藻糖(pH=7.5)组成的缓冲液中浓度为15.4 mg/mL (约0.30 mM)的总共6.1 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQID NO: 117)。将化合物14和Fc区以6:1摩尔比率(多肽:Fc区)混合。然后加入浓度为17.8mg/mL (约0.99 mM)的1.7 mg分选酶和117 µL缓冲液，得到混合物中10 mg/mL Fc区的终浓度。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去过量的肽、分选酶和未偶联的Fc区。
所得缀合物(3.3 mg)通过质谱法分析。总共81%受测物类被鉴定为与2个脂质化肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量61657)，19%为与1个脂质化肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量56288)。
Fc区和化合物15 (=化合物809)
为了产生化合物15的缀合物，将3.3 mg化合物15溶于49 µL DMF至11.7 mM的浓度。使用在由50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、240 mM海藻糖(pH=7.5)组成的缓冲液中浓度为15.4 mg/mL (约0.30 mM)的总共4.9 mg Fc区(N端三元G基序LALAPG Fc区；SEQID NO: 117)。将化合物15和Fc区以6:1摩尔比率(多肽:Fc区)混合。然后加入浓度为7.8mg/mL (约0.99 mM)的1.4 mg分选酶和95 µL缓冲液，得到混合物中10 mg/mL Fc区的终浓度。使反应混合物在37℃和350 rpm下温育3小时。
在用20 mM组氨酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上，通过大小排阻色谱法除去过量的肽、分选酶和未偶联的Fc区。
所得缀合物(1.5 mg)通过质谱法分析。总共78%受测物类被鉴定为与2个脂质化肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量61605)，22%为与1个脂质化肠降血糖素受体配体多肽偶联的Fc区(平均质量56264)。
实施例8
环AMP (cAMP)测定法：用于在CHO细胞中稳定表达人GIP-受体GLP-1-受体和GCG-受体的细胞悬液测定方式。
在基于细胞的cAMP测定法中使用下列材料：
- 板：96孔半区板(Costar # 3694)用于该测定法，96孔未结合表面板(Corning #3600)用于化合物稀释
- 原液用管：Protein LoBind管(Eppendorf # 022431081)
- 移液管头：最大回收管头(Axygen # TF-100-L-R-S)
- 细胞：来自DiscoveRx Corp的cAMP HunterTM CHO-K1 gIP (DiscoveRx # 95-0146C2)、cAMP HunterTM CHO-K1 gLP-1R (DiscoveRx # 95-0062C2)、cAMP HunterTM CHO-K1 gCGR (DiscoveRx # 95-0042C2) Gs细胞系。
- 生长培养基：Ham’s F-12 (Gibco # 21765)、10%胎牛血清(FBS；Gibco 16000)，热灭活；2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素(PSG；Gibco # 10378)；500 µg/mL g418 (遗传霉素，Gibco # 11811-031)
- 测定缓冲液：含有0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma # I7018)和0.1%牛血清白蛋白(Sigma # A2153)、用碳酸氢钠(Sigma # S8761)调节pH (pH = 7.3)的Krebs-Ringer (Sigma-Aldrich # K4002)
- 测定试剂盒：cAMP dynamic 2试剂盒(Cisbio # 62AM4PEC)
- 化合物：在二甲亚砜(DMSO；Sigma # D2650)中制备化合物的原液，并保存在-20℃下；恰在测定前，在室温(RT)下使溶液融化5-10分钟，并预稀释到测定缓冲液(1 µM-60 nM)中；在测定缓冲液中进行连续稀释。
使细胞在T150培养瓶中生长至80%汇合，在实验前24小时更换培养基。在实验当日，除去培养基，将细胞单层用10 ml磷酸缓冲盐水(PBS)/培养瓶洗涤。在除去PBS后，将细胞在37℃下与5 ml细胞解离溶液(Gibco # 13151)一起孵育5分钟以取出细胞。轻叩培养瓶，合并细胞悬液。将细胞悬液以150 × g离心3分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重新悬浮于测定缓冲液中，并测定细胞数。调节细胞浓度至2x105个细胞/mL。使用多路分配器(5000细胞/孔)将25 µL细胞悬液等分液转移到96孔板的各孔中。将25 µL稀释化合物的等分液转移到细胞板中，使细胞悬液在板振荡器(450 rpm)上在室温下孵育30分钟。通过加入溶解缓冲液终止反应，按照生产说明书，使用来自Cisbio的cAMP dynamic 2试剂盒测定所产生的cAMP。使用EnVision (PerkinElmer)测定时间分辨荧光信号。根据每个实验平行运行的标准曲线计算环AMP产生。使用Excel Fit软件分析数据。
实施例9
药代动力学
在生命部分中
重约60 g的成年雄性DIO小鼠从Charles River (Lion，France)获得，并关养在受控环境(温度、湿度和12小时光/12小时暗周期)下，任意接近食物和水。在严格遵守瑞士联邦动物保护规程和国际实验室动物管理评估及认证协会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care International，AAALAC)的情况下经当地兽医专家批准进行啮齿动物研究。以20 nmol/kg的化合物按1 ml/kg注射体积皮下给予小鼠。在给药后2、4、8、24、48、80和168小时(n=3个样品/时间点，合并取样)，在轻微的异氟烷麻醉下通过舌下穿刺，将血液(0.15 ml)收集到K2EDTA包被的聚丙烯管中，放置在冰上。通过以3000 g在4℃下离心5分钟，在30分钟内制备血浆，立即冷冻，并保存在-20℃下。通过一系列酶联免疫吸附测定法(ELISA，参见下文描述)，评价血浆中的试验项目浓度。用软件ToxKin(3.5.3版，Entimo AG，2008)进行了融合多肽的非区室药代动力学分析。图5和表4中报告了药代动力学结果。
ELISA原理
为了定量测定1%小鼠血浆中的融合多肽，使用俘获研究中的多肽的抗体(俘获性mAb<多肽>IgG-Bi)，然后针对缀合的Fc区(mAb<h-Fc-pan>IgG-Dig)的抗体和用于检测的抗洋地黄毒苷(digoxigenin)抗体-POD缀合物，建立一系列酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
将俘获抗体、融合多肽的校准标准物或稀释的血浆样品、mAb<h-Fc-pan>IgG-Dig和抗洋地黄毒苷抗体-POD缀合物相继加入链霉抗生物素包被的微量滴定板(SA-MTP)中，在MTP振荡器中以450 rpm温育各试剂1小时。在各步骤后，洗涤MTP四次，除去残留的流体。最后，通过加入TMB溶液、POD底物(其转化成有色反应产物)，观察所形成的固定化免疫复合物。以光度测定法监测显色(655 nm的吸光度/492 nm参考波长)，当最高校准物达到0.75的OD，通过加入1 M H2SO4终止。最后，颜色强度用光度测定法测定(450 nm处的吸光度/690 nm参考波长)，并且与血浆样品中的分析物浓度成比例。采用具有非线性4参数Wiemer-Rodbard曲线拟合函数的相应的校准曲线，通过吸光度值的倒退测算，进行融合多肽的量化。
药代动力学结果
皮下应用后的血浆暴露：如图5和表4所示，与PEG缀合物和与4种所测的非脂质化融合多肽相比，在小鼠中针对脂质化融合多肽观察到较高的Cmax和AUC。
皮下应用后的血浆半衰期(T1/2)：在小鼠中针对脂质化融合多肽观察到87小时的显著长的血浆T1/2。相比之下，4种所测的非脂质化融合多肽显示约25小时的显著较短的T1/2。T1/2也是之前针对各PEG-40k缀合物所测(41小时)的2倍。
表4：在将20 nmol/kg单次皮下施用于小鼠后血浆中的PK参数。
*由于合并取样研究设计所致，PK参数是指平均血浆浓度/时间分布。各构建体的平均血浆浓度/时间分布获自每个时间点的3个浓度值。
Claims (30)
1. 一种融合多肽，其包含
- 1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个包含与脂质共价缀合的氨基酸，和
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
2.权利要求1的融合多肽，其特征在于融合多肽体内与内源多肽缔合。
3.权利要求1-2中任一项的融合多肽，其特征在于与脂质的缀合通过氨基酸侧链上的官能团。
4. 权利要求1-3中任一项的融合多肽，其特征在于与脂质共价缀合的肠降血糖素受体配体多肽的氨基酸残基是非天然存在的氨基酸残基。
5. 权利要求1-4中任一项的融合多肽，其特征在于
i) 假如肠降血糖素受体配体多肽通过其C端与人免疫球蛋白Fc区缀合，则氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 75)，任选LPETG (SEQ ID NO: 74)在肠降血糖素受体配体多肽的C端和人免疫球蛋白Fc区的N端之间，和
ii) 假如肠降血糖素受体配体多肽通过其N端与人免疫球蛋白Fc区缀合，则氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 75)，任选LPETG (SEQ ID NO: 74)在肠降血糖素受体配体多肽的N端和人免疫球蛋白Fc区的C端之间。
6. 权利要求1-5中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽包含选自SEQ ID NO: 1-39、76、77和120-125的氨基酸序列。
7. 权利要求1-6中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 76)，其相对于SEQ ID NO: 76具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
8. 权利要求1-6中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于GLP-1 (SEQ ID NO: 1或2)，其相对于SEQ ID NO: 1或2具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
9. 权利要求1-6中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于GIP (SEQ ID NO: 77)，其相对SEQ ID NO: 77具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
10. 权利要求1-6中任一项的融合多肽，其特征在于肠降血糖素受体配体多肽衍生于毒蜥外泌肽-3或-4 (SEQ ID NO: 3或4)，其相对SEQ ID NO: 3或4具有1-10 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸修饰，其中至少一个氨基酸残基与脂质缀合或变为与脂质缀合的非天然存在的氨基酸残基，且其中衍生的多肽具有肠降血糖素受体配体活性。
11. 一种脂质化肠降血糖素受体配体多肽，其包含Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 120)的氨基酸序列。
12. 一种脂质化肠降血糖素受体配体多肽，其包含脱氨基-Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 121)的氨基酸序列。
13. 一种脂质化肠降血糖素受体配体多肽，其包含Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 122)的氨基酸序列。
14. 一种脂质化肠降血糖素受体配体多肽，其包含Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 123)的氨基酸序列。
15. 一种脂质化肠降血糖素受体配体多肽，其包含Ac-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 124)的氨基酸序列。
16. 一种脂质化肠降血糖素受体配体多肽，其包含Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 125)的氨基酸序列。
17. 一种融合多肽，其包含
- 1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中所述人免疫球蛋白Fc区选自SEQ ID NO: 42-53的人免疫球蛋白Fc区，
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个彼此独立地直接或通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此如果接头肽存在，则选自(GGS)n，其中n=1-4 (SEQID NO: 82-84)；Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO:57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；和(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ ID NO: 65-67和92-94)，和
其中1、2、3或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
18. 一种融合多肽，其包含
- 1个或2个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中所述人免疫球蛋白Fc区选自SEQ ID NO: 42-53的人免疫球蛋白Fc区，
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽的每一个彼此独立地直接或通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此如果接头肽存在，则选自(GGS)n，其中n=1-4 (SEQID NO: 82-84)；Gn，其中n=2-6 (SEQ ID NO: 85-87)；(GGGS)n，其中n=1-6 (SEQ ID NO:57-60、88和89)；(GGGGS)m，其中m=1-6 (SEQ ID NO: 61-64、90和91)；和(GGGGGS)o，其中o=1-6 (SEQ ID NO: 65-67和92-94)，和
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
19. 一种融合多肽，其包含
- 1个或2个肠降血糖素受体配体多肽，和
- 1个人免疫球蛋白Fc区，
其中肠降血糖素受体配体多肽中的至少1个选自SEQ ID NO: 120-125的脂质化肠降血糖素受体配体多肽，
其中所述人免疫球蛋白Fc区包含i) SEQ ID NO: 49的2个氨基酸序列或ii) SEQ IDNO: 52的1个氨基酸序列和SEQ ID NO: 53的1个氨基酸序列，
其中1个或2个、3个或4个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过接头肽与人免疫球蛋白Fc区的N端共价缀合，由此接头肽选自(GGGS)4 (SEQ ID NO: 58)、(GGGGS)3 (SEQ IDNO: 62)，和(GGGGGS)o，其中o=2-3 (SEQ ID NO: 65-66)，和
其中1个或2个肠降血糖素受体配体多肽的每一个通过肽键与人免疫球蛋白Fc区的末端共价缀合，由此仅单个肠降血糖素受体配体多肽与人免疫球蛋白Fc区的每个末端缀合。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项的融合多肽。
21.权利要求1-19中任一项的融合多肽作为药物的用途。
22.权利要求21的用途，其特征在于所述疾病是2型糖尿病。
23.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是肥胖症。
24.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是胰岛素抵抗。
25.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是1型糖尿病。
26.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是骨质疏松症。
27.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是脂肪性肝炎。
28.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
29.权利要求22的用途，其特征在于所述疾病是代谢综合征。
30.权利要求22-29中任一项的用途，其特征在于与另外的2型糖尿病药物组合给予权利要求1-19中任一项的融合多肽。
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