CN106011193A - 一种新化合物球腔烯胺的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新化合物球腔烯胺的制备方法，包括以下步骤：1)获得ZJLQ129发酵液；2)获得球腔菌素；3)获得球腔烯胺。

Description

一种新化合物球腔烯胺的制备方法

技术领域

本发明涉及化学领域，具体地说是一种新化合物球腔烯胺的制备方法，名和氏球腔菌菌株ZJLQ129可产生代谢产物二苯并呋喃类化合物球腔菌素(-)mycousunine，该化合物可衍生获得球腔烯胺(-)mycousunine amide，球腔烯胺(-)mycousunine amide具有免疫抑制活性。

背景技术

植物内生真菌(Plantendophyticfungi)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌，，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状，，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它是植物微生物***中的内生真菌，广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响。它是植物微生物***中的天然组成成分，，在进化过程中与植物寄主建立了和谐的共生关系，其次生代谢产物十分丰富。植物内生真菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多。研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力。在内真生菌-植物宿主-食草动物生态***中，植物内生真菌扮演着前所未知的重要生态学作用。发挥这些作用的物质基础是内生真菌产生的丰富多样的次生代谢产物，它们具有多种生物活性，在农业和(或)医药业中具有重要的应用潜力。近年来，随着美国科学家A.Stierle在太平洋短叶杉上发现了抗肿瘤药物紫杉醇的产生菌，药用植物和濒危植物内生真菌及其活性物质的研究成为了药物开发的重要方向。我国植物资源十分丰富，对其内生真菌的研究将有利于微生物药物的开发和珍稀植物资源的保护。

常用的免疫抑制剂主要有五类：(1)糖皮质激素类，如可的松和强的松；(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；(5)烷化剂类，如环磷酰胺等。其中，微生物酵解作为主要合成方法，已有多种产品，如环孢菌素CsA类、他克莫司Tacrolimus(FK506)、雷帕霉素Rapamycin(RPM)及其衍生物SDZ RAD、Mizoribine(MZ)等。以环孢菌素为例，七十年代后期瑞士的Borel发现了一种从霉菌酵解产物里提取的一种只含11个氨基酸的环形多肽，取名为环孢素(CsA)，可以有效地特异性抑制淋巴细胞反应和增生。对T细胞，尤其是TH细胞有较好的选择性抑制作用，而对其他的免疫细胞的抑制作用则相对较弱，因此在抗器官移植排斥中取得了很好的疗效；也用于自身免疫病的治疗，因此是一种具有很高临床使用价值的免疫抑制剂。经10年的临床试验应用研究证实其抗排斥反应作用较其他药物强而且副作用小的多。故于八十年代末被批准正式注册投入市场应用。CsA近20年的临床应用显示了神奇的效果，使得除小肠移植外，肝、肾、心及心/肺、胰移植的病人/移植物一年存活率达70－85％，而在此之前仅30－50％。CsA相关性神经毒性症状的发生率大约为10-28％，是影响患者预后的一种较为重要的因素。轻度以头痛、肢体震颤、感觉障碍等多见，中度以视力障碍为主。CsA相关神经毒性的重症表现发生率极低。

植物内生真菌作为与植物共生的真菌，其在与植物共生的过程中，发展拥有与普通致病菌不同的天然代谢产物。分离植物中存在的新的内生真菌，探索该菌的次生代谢产物活性，是一个新的开发方向。

发明内容

本发明提供一种新化合物球腔烯胺的制备方法：包括以下步骤：

1)制备ZJLQ129发酵液：将直径为0.5厘米的ZJLQ129菌饼共10个接入500ml PDB中于25℃，200转摇床上培养10天得到菌丝液，菌丝液在无菌条件下粉碎；在500ml PDB接入菌丝液25ml，室温下静置培养2周后过滤分别获得发酵液与菌丝体。

2)制备球腔菌素：发酵液用乙酸乙酯萃3次后萃取液浓缩得浸膏A，重1.72g，菌丝体用丙酮浸泡过夜后浓缩至小体积，获得浸膏B，重1.76g；合并二部分得浸膏C，重3.5g；取浸膏C 3.5g加15g硅胶拌样，旋转蒸发仪蒸干，200-300硅胶950克干法装柱，将拌样后的样品上样后进行柱层析分离，依次用石油醚∶乙酸乙酯体积比4:1，石油醚∶乙酸乙酯体积比3:2，石油醚:乙酸乙酯体积比3:7，乙酸乙酯∶甲醇体积比4:1分别进行梯度洗脱分离，硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色，合并Rf值为0.46且茴香醛显色为蓝色的组分；该组分1.70g用凝胶柱层析分离纯化，以氯仿∶甲醇体积比1:1为洗脱剂洗脱分离，硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色，获得球腔菌素纯品300mg。

3)制备球腔烯胺：取纯品球腔菌素200mg，于三颈瓶中，冰盐浴中至0℃，通入氨气反应30分钟，样品浓缩至干，取浓缩后的样品7克用甲醇溶解，加14g硅胶拌样上柱，加入洗脱剂为石油醚∶氯仿∶甲醇＝18∶4∶1，200-300目硅胶柱层析分离，获得新化合物球腔烯胺150mg。

本发明同时提供了上述名球腔烯胺具有免疫抑制活性。球腔烯胺是由名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129发酵产生的次生代谢产物球腔菌素氨化衍生而来。名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129保藏名称为：Mycosphaerella nawae ZJLQ129，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期：2015年9月9日，保藏号：CCTCC NO：M2015517。

上述优选的，球腔烯胺具有免疫抑制活性。优选的，在2nM浓度下球腔烯胺对刀豆蛋白A诱导的T细胞增殖的免疫抑制率为32.4±6.2％。

球腔菌素化合物具有免疫抑制活性。优选的，10μM浓度球腔菌素化合物的免疫抑制率为51.28％。

免疫抑制：是指对于免疫应答的抑制作用，或者说是对机体的免疫反应具有抑制作用。免疫抑制剂能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。

附图说明

图1：球腔菌素(-)mycousunine结构式图

图2：球腔烯胺(-)mycousunine amide结构式图

图3：球腔烯胺(-)mycousunine amide绝对构型图

图4：球腔烯胺(-)mycousunine amide(化合物2)选择性抑制T细胞增殖。(A)：刀豆蛋白A(Con A)诱导的T细胞增殖。(B)：脂多糖(LPS)诱导的B细胞增殖。(C)：PANC-1和A549细胞增殖。纵坐标为细胞相对增殖率，n＝4，与对照组(0nM组)比较，^bP<0.01和^cP<0.001。

图5：(A和B)：球腔烯胺(-)mycousunine amide(化合物2)抑制CD3⁺T细胞增殖。纵坐标表示CD3⁺T细胞的比例。n＝3，与对照组比较，^bP<0.01和^cP<0.001。(C)：化合物2的细胞毒性。纵坐标表示细胞存活率，n＝4，与对照组(0nM组)比较，^aP<0.05,^bP<0.01和^cP<0.001。

图6：球腔烯胺(-)mycousunine amide(化合物2)抑制活化T细胞中细胞因子的分泌。纵坐标表示细胞因子的浓度，n＝3，与对照组比较，^aP<0.05,^bP<0.01和^cP<0.001。

具体实施方式

新化合物球腔烯胺的制备方法是主要是通过名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerellanawae)ZJLQ129发酵产生的代谢产物球腔菌素衍生化得到的，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明中的主要仪器包括：3K‐30高速台式离心机，德国Sigma；RE‐6000A旋转蒸发器，上海亚荣；玻璃层析柱；LCQ‐Advantage型质谱仪，美国Finnigan；DRX‐500型核磁共振仪，德国Bruker公司。MCO-15AC型细胞培养箱，日本三洋公司；SpX-250B-Z生化培养箱，上海***实业有限公司；1700型电子天平，德国Sartorius公司；SW-CJ-1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LD5-2A型离心机，北京医用离心机厂；1-13型离心机，德国SIGMA公司；MH-1型微量振荡器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；680型酶联免疫检测仪，美国Bio-Rad公司；synergy-2SLFPA全波长多功能酶标仪，美国BioTek公司；XDS-1B型生物倒置显微镜，重庆光学仪器厂；IX73研究级倒置荧光显微镜，日本Olympus公司；5804R型高速冷冻台式离心机，德国Eppendorf公司；PTC-200PCR仪，美国Bio-Rad公司；ABI7900荧光定量PCR仪，美国应用生物***公司；ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计：美国赛默飞公司；FACS Calibur型流式细胞仪：美国Becton Dickson公司。

本发明中的主要试剂包括：柱层析硅胶(200–300目)，青岛海洋化工厂；柱层析凝胶(Sephadex LH‐20)，Pharmacia公司。刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖LPS、醋酸***、3-[4，5-dimethylthylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)、台酚蓝、二甲基亚砜溶液(DMSO)购自Sigma公司；环孢菌素A(CsA)由华东医药股份有限公司馈赠；RPMI1640细胞培养液和DMEM培养液购自Thermo Fisher公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；100×青链霉素溶液和Hank’s液购自江苏碧云天生物工程研究所；含10％灭火胎牛血清和1×青链霉素溶液的RPMI1640细胞培养液即为完全培养液；40μm孔间细胞滤网购自Biologix公司；抗体FITC-anti-CD3，PE-anti-CD4，PE-anti-CD8，PE-anti-CD69和PE-anti-CD25购自eBioscience公司；小鼠细胞因子(IL-2和IFN-γ)Elisa检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；Trizol购自Invitrogen公司；MMLV反转录酶购自Fermentas公司；SYBR Green PCR试剂盒购自TIANGEN公司；PCR引物及其他PCR试剂购自上海生工生物工程技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

实施例一、名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129的获得

名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129的分离培养与鉴定：

在实验室中按下列条件和步骤分离培养，即可获得本发明所述的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129：

1)从我国浙江龙泉自然保护区采集，将采集的拔葜叶子用浓度0.5％(w/v)的次氯酸钠进行表面消毒10min，然后无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水。菝葜，也称金刚藤，百合科菝葜属，多年生藤本落叶攀附植物。生于山坡林下，分布于中国长江以南各地，攀援灌木，叶薄革质或坚纸质，干后通常红、褐色或近古铜色，圆形、卵形或其他形状，长3-10厘米，宽1.5-6(-10)厘米，下面通常淡绿色，较少苍白色；叶柄长5-15毫米，约占全长的1/2-2/3具宽0.5-1毫米(一侧)的鞘，几乎都有卷须，少有例外，脱落点位于靠近卷须处，根状茎粗厚，坚硬，为不规则的块状，粗2-3厘米。茎长1-3米，少数可达5米，疏生刺。

2)用无菌刀片把表面消毒过的菝葜叶子切成1cm左右大小的组织片，将组织片移接在含100μg/ml氨苄青霉素和链霉素的2％(w/v)水琼脂平板上，光照培养箱中培养，培养条件：25℃，16小时光照，8小时黑暗；

3)待菌丝长出后，将单菌丝顶端移接到PDA固体培养基上培养，25℃培养，连续纯化3次，获得纯培养。本发明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawaeZJLQ129 CCTCC NO：M2015517)具有如下特性：PDA培养基上生长缓慢，20-25d菌落直径为2-3cm，60-66d菌落直径为3-4cm，生长速率减小。PDA培养基上于25℃，12小时黑暗交替培养，菌落呈不规则形，无气生菌丝，菌丝初期为灰色，后期变为灰黑色，背面和正面均有皱折，菌落边缘不整齐，无色素分泌；子囊座为黑色，不产生孢子，菌丝有隔膜。名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129 CCTCC NO：M2015517)，它属于真菌界(Fungi)，双核亚界(Dikarya)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，子囊菌纲(Ascomycetes)，盘菌目(Pezizales)，盘菌科(Pezizaceae)，球腔菌属(Mycosphaerella)。

4)菌种鉴定：将ZJLQ129进行beta-tubulin基因测序，并利用BLAST程序进行比对，利用PAUP程序进行***发育分析。

将菌株菌丝在液氮中研成粉末，取100mg粉末装于1.5mL离心管中，采用DNeasyPlant Mini Kits(QIAGEN)按厂商的程序提取基因组DNA。采用通用引物BT1(5'-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3')和BT22(5'-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3')扩增beta-tubulin基因，PCR体系：DNA模板(100ng/μL)5.0μL，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl₂)5.0μL，dNTPs(5mmol/L)1.0μL，引物(50μg/mL)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)1μL，加水补足50μL，混匀后在BIORAD公司S1000型号的PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，53℃50s，72℃90s，35个循环；72℃10min。

PCR扩增产物用Axygen柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化。纯化的ITS rDNA PCR扩增产物分别用扩增引物对ITS1和ITS4测序，纯化的beta-tubulin扩增产物测序。测序由上海生工生物工程服务有限公司完成。测得的序列在GenBank上进行BLAST搜索。基于BLAST结果，用软件Clustal X 1.81将菌株ZJLQ129的序列与GenBank上球腔菌属的相关序列进行比对，然后进行***发育分析。以上结果表明菌株ZJLQ129可以定名为名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae。

实施例二、球腔烯胺前体球腔菌素(-)mycousunine的制备和结构鉴定

1)名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129发酵培养，依次进行以下步骤：

将ZJLQ129菌饼(直径为0.5厘米)共10个接入500ml PDB中于25℃，200转摇床上培养10天，培养液在无菌条件下粉碎，加入500ml PDB中培养，每瓶接入菌丝液25ml，共接40瓶即20L，于室温下静置培养2周后过滤分别获得发酵液与菌丝体。其中发酵液用乙酸乙酯萃3次后萃取液浓缩得浸膏1.72g(A部分)，菌丝体用丙酮浸泡过夜后浓缩至小体积，获得浸膏1.76(B部分)。合并二部分得浸膏3.5g(C部分)。

其中上述培养基或培养液的成分如下：

PDA培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar)去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20min，以纱布滤去固体残渣，滤液加水补足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，再加入15g溶化的琼脂粉，分装，121℃灭菌20min备用。

PDB培养液：即马铃薯葡萄糖(potato dextrose broth)：去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20min，以纱布滤去固体残渣，滤液加水补足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，分装，121℃灭菌20min备用。

2)化合物的制备：

取上述浸膏C 3.5g加15g硅胶拌样，旋转蒸发仪蒸干。另外，用200-300硅胶950克干法装柱，将拌样后的样品上样后进行柱层析分离，依次用石油醚∶乙酸乙酯4:1(v/v)，石油醚∶乙酸乙酯3:2(v/v)，石油醚:乙酸乙酯3:7(v/v)，乙酸乙酯，乙酸乙酯∶甲醇4:1(v/v)分别进行梯度洗脱分离，每500ml接收1个流分，共接收31个流分，将接收的样品进行硅胶薄层层析，以茴香醛显色剂显色后，将Rf值为0.46且茴香醛喷雾显色为蓝色的流分合并，获得Fr8这一部分。茴香醛显色剂的配方如下：茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1：广谱。配制方法：135乙醇+5mL浓硫酸+1.5mL of冰醋酸+3.7mL茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀。茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2：萜烯，桉树脑(cineoles)，withanolides，出油柑碱(acronycine)。配制方法：茴香醛:HClO₄:丙酮:水(1:10:20:80)。Fr8部分(Rf值＝0.46)共1.70g采用凝胶柱层析分离纯化，以氯仿∶甲醇1:1(v/v)为洗脱机洗脱反复分离，硅胶薄层层析检测，以茴香醛显色剂显色后，合并组分相同的流分，最终获得纯品300mg，记为化合物(1)。化合物(1)是从名和氏球腔菌株ZJLQ129中分离获得的代谢产物。

3)化合物(1)球腔菌素(-)mycousunine的鉴定过程如下：

化合物(1)，见图1，黄色针晶，mp 86-89℃(MeOH)；HRESIMS m/z:376.1158M+(calcd for C₁₉H₂₀O₈ 376.1158)¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，3.17(1H，d，J＝18Hz，H-4a)，3.31(1H，d，J＝18Hz，H-4b)，1.63(3H，s，H-10)，2.56(3H，s，H-12)，2.59(3H，s，H-14)，2.04(3H，s，H-15)，3.54(3H，s，H-16).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)197.7(s，1-C)，110.7(s，2-C)，194.6(s，3-C)，37.9(t，4-C)，51.3(q，4a-C)，156.6(s，5a-C)，101.8(s，6-C)，163.4(s，7-C)，107.2(s，8-C)，159.1(s，9-C)，105.3(s，9a-C)，59.8(s，9b-C)，17.3(q，10-C)，202.4(s，11-C)，27.4(q，12-C)，201.0(s，13-C)，31.2(q，14-C)，7.2(q，15-C)，51.3(q，C-16)。化合物(1)的分子量与核磁共振氢谱与碳谱数据与松萝酸很相似，说明该化合物为二苯并呋喃类化合物。化合物1比松萝酸多了一个甲氧基(δC 51.4，δH 3.56，s 3H)，一个ABq亚甲基(δC 37.9，δH 3.17d，J＝18.0，δH 3.31d，J＝18.0)，但少了一个苯环叔碳及对应氢质子信号(δC98.2，δH 5.98，s 1H)，说明化合物1的4a位被甲氧基取代，而4号位为亚甲基，化合物(1)的¹H NMR及¹³C NMR与文献中(-)-mycousnine的数据一致，因此将化合物(1)鉴定为(-)mycousnine，中文名球腔菌素。

实施例三：化合物(2)球腔烯胺(-)mycousunine amide的获得和命名

1、化合物(2)是化合物(1)通过氨化反应得到的，具体如下：

取上述纯品化合物(1)共200mg，置于三颈瓶中，放置于冰盐浴中至0℃，通氨气反应30分钟，将样品浓缩至干。将反应前后产物进行硅胶薄层层析对比，发现反应在Rf值为0.4(展开剂为石油醚∶氯仿∶甲醇3∶3∶1)产生一个新化合物，7克用适量甲醇溶解，加14g硅胶拌样，旋转蒸发仪蒸干。采用200-300目硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚∶氯仿∶甲醇＝18∶4∶1，进行分离获得新化合物150mg，记为化合物(2)。

2、化合物(2)球腔烯胺(-)mycousunine amide的鉴定：

化合物(2)为化合物(1)的氨化反应产物，其结构式见图2，黄色针晶，旋光度：(c＝0.1，MeCN)mp HRESIMS m/z:376.1399[M+H]+(calcd for C₁₉H₂₁O₇N376.1399)。比化合物(1)的分子量少了1。1H NMR(500MHz，CDCl₃)，13C NMR(125MHz，CDCl₃)见表1。通过比较化合物(1)与(2)的¹H及¹³C NMR数据，确定其结构为(-)mycousnine amide。为了进一步验证其结构及绝对构型，对化合物(2)进行X-ray分析。最终确证化合物(2)的绝对构型为(4aR，9bS，E)-6-acetyl-2-(1-aminoethylidene)-7，9-dihydroxy-4a-methoxy-8，9b-dimethyl-4，4a-dihydrodibenzo[b，d]furan-1，3(2H，9bH)-dione，图3为化合物(2)的绝对构型。

表1 化合物²的¹³C NMR与¹H NMR数据(CDCl₃，δppm；Hz)

实施例三：新化合物球腔烯胺的制备方法

通过以下方法实现：

1)制备ZJLQ129发酵液：将直径为0.5厘米的ZJLQ129菌饼共10个接入500ml PDB中于25℃，200转摇床上培养10天得到菌丝液，菌丝液在无菌条件下粉碎；在500ml PDB接入菌丝液25ml，室温下静置培养2周后过滤分别获得发酵液与菌丝体。

2)制备球腔菌素：发酵液用乙酸乙酯萃3次后萃取液浓缩得浸膏A，重1.72g，菌丝体用丙酮浸泡过夜后浓缩至小体积，获得浸膏B，重1.76g；合并二部分得浸膏C，重3.5g；取浸膏C 3.5g加15g硅胶拌样，旋转蒸发仪蒸干，200-300硅胶950克干法装柱，将拌样后的样品上样后进行柱层析分离，依次用石油醚∶乙酸乙酯体积比4:1，石油醚∶乙酸乙酯体积比3:2，石油醚:乙酸乙酯体积比3:7，乙酸乙酯∶甲醇体积比4:1分别进行梯度洗脱分离，硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色，合并Rf值为0.46且茴香醛显色为蓝色的组分；该组分1.70g用凝胶柱层析分离纯化，以氯仿∶甲醇体积比1:1为洗脱剂洗脱分离，硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色，获得球腔菌素纯品300mg。

3)制备球腔烯胺：取纯品球腔菌素200mg，于三颈瓶中，冰盐浴中至0℃，通入氨气反应30分钟，样品浓缩至干，取浓缩后的样品7克用甲醇溶解，加14g硅胶拌样上柱，加入洗脱剂为石油醚∶氯仿∶甲醇＝18∶4∶1，200-300目硅胶柱层析分离，获得新化合物球腔烯胺150mg。

实施例四：化合物(2)球腔烯胺(-)mycousunine amide的免疫抑制活性测定：

实验方法如下：

1、供试品化合物(2)(-)mycousnine enamine配制：化合物(2)(-)mycousnineenamine纯度>99％。化合物(2)先以DMSO溶解为50mM浓度，-20℃冷冻保存。临用前再采用RPMI1640细胞培养液稀释至相应浓度。稀释液中DMSO的含量≦0.2％，对细胞的生物活性没有影响。

2、细胞株和实验动物来源：PANC-1和A549细胞购自中国科学院上海细胞库。培养于含10％灭活胎牛血清，100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基(Dulbecco'smodified eagle medium)中；放置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。待细胞生长80％以上融合程度时，用0.25％胰酶消化传代。雌性SPF级C57BL/6小鼠，6周龄，18-22g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物购得后饲养一周，适应环境后再进行实验。实验动物的处理程序按照浙江省医学科学院实验动物福利伦理委员会的规定执行。

3、单个脾细胞悬液制备：小鼠无菌取脾，研磨后，加适量Hank’s液混悬，以40μm孔间细胞滤网滤过，1500rpm离心5分钟，弃上清，加Hank’s液重复洗涤2次。收集脾细胞，加RPMI1640完全培养液混悬制成单个脾细胞悬液。以0.4％台酚蓝拒染法记数，活细胞数不少于95％。

4、Con A诱导的T细胞增殖和LPS诱导的B细胞增殖实验测定：于96孔平底培养板中，每孔加100μL脾细胞悬液(5×10 ⁶cell/ml)，并加入50μl Con A溶液(2μg/ml)或LPS溶液(2μg/ml)，最后加入不同浓度(0、2、10、50、250nM)供试药物的稀释液50μl，每个浓度重复4孔，另设正常细胞对照孔。37℃，5％CO₂培养44小时后，各孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μl，继续培养4h。离心(1800rpm，5min)，弃去各孔上清，分别加酸性DMSO溶液(4％1mol/lHCl)150μl，避光振荡15min，测定OD490nm，以丝裂原作用孔(药物浓度0)的增殖率计为100％，计算药物作用后的相对细胞增殖率。MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞增殖数量，OD值越大，细胞活性越强，增值率越高。

5、PANC-1和A549细胞增殖实验测定：取对数生长期的细胞，调整浓度至1×10⁵个/mL，接种于96孔细胞培养板中100μL/孔。培养24小时后，加入ZJLQ129稀释液至总体积为200μL，继续培养48小时后，采用上述MTT法测定细胞增殖率。

6、细胞毒性测定：于96孔平底培养板中，每孔加100μL脾细胞悬液(5×10 ⁶cell/ml)，并加入50μl不同浓度供试药物的稀释液，再加入RPMI1640培养液50μl，复4孔，37℃，5％CO2培养48小时，按前述MTT法测定细胞存活率。

7、CD3⁺T细胞比例测定：于24孔平底培养板中，每孔加1ml脾细胞悬液(5×10⁶cell/ml)，并加入Con A溶液(2μg/ml)和不同浓度的供试药物溶液各0.5ml，各浓度复3孔。置37℃，5％CO₂分别培养24小时和48小时后，收集细胞，以FITC-anti-CD3标记。PBS洗涤去除未结合的荧光抗体，置流式细胞仪测定荧光标记细胞的比例。

8、细胞因子的生产测定：于24孔平底培养板中，每孔加1ml脾细胞悬液(5×10⁶cell/ml)，并加入Con A溶液(2μg/ml)和不同浓度的供试药物溶液各0.5ml，各浓度复3孔。置37℃，5％CO₂培养24和48小时后，收集培养上清液，按ELISA试剂盒检测细胞因子IL-2和IFN-γ的含量。

上述实验结果表明：

观察化合物(2)对Con A诱导T细胞增殖的影响。结果如图4A所示，与CsA一样，化合物(2)在极低浓度(2nM)即能显著抑制T细胞的增殖，在2nM浓度下球腔烯胺(-)mycousunineamide对刀豆蛋白A(Con A)诱导的T细胞增殖的免疫抑制率为32.4±6.2％。在受试浓度范围内(2～250nM)呈较好的浓度依赖关系。化合物(2)的半数有效浓度(EC50)为26.97±6.00nM，CsA的EC50为18.27±4.60nM。但在该浓度范围内，化合物(2)和CsA对LPS诱导的B细胞增殖却没有任何影响(图4B)。甚至在提高浓度100倍以后(25μM)，化合物(2)对人胰腺癌细胞PANC-1和肺癌细胞A549的增殖均没有任何影响(图4C)。

化合物(2)对脾细胞的细胞毒性测定表明(图5C)，化合物(2)在6.25μM时开始表现微弱的细胞毒性(细胞存活抑制率为8.5％)，半数毒性浓度(TC₅₀)为120.37±17.97μM；CsA在6.25μM时细胞存活抑制率为43.7％，TC₅₀为16.17±4.80μM。根据上述获得的EC₅₀值，依次设定3、30、300nM三个浓度，对T细胞的特定表面抗原CD3分子进行FITC标记，采用流式细胞技术进一步观察化合物(2)对T细胞增殖的影响。结果显示(图5A、B)：化合物(2)能明显抑制Con A引起的脾细胞中T细胞比例的增加，并呈现较好的浓度依赖关系和时间依赖关系。

IL-2和IFN-γ是T细胞活化产生的主要细胞因子，也是T细胞活化的主要标志。进一步测定IL-2和IFN-γ的细胞分泌情况发现，化合物2在3nM以上即能浓度依赖性地显著降低Con A引起的IL-2和IFN-γ分泌。

以上结果充分表明：化合物2在极低浓度即能选择性地抑制T细胞增殖和活化，其活性并非其细胞毒性引起。虽然抑制T细胞增殖的作用强度不如CsA，但细胞毒性明显弱于CsA。ZJLQ129的治疗指数(Therapeutic index，TI，TC₅₀/EC₅₀)(4463.5)远大于CsA(885.0)。因此，化合物2具有高效、低毒、高选择性的特征，具有较好的研究开发前景。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种新化合物球腔烯胺的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

1)制备ZJLQ129发酵液：将直径为0.5厘米的ZJLQ129菌饼共10个接入500ml PDB中于25℃，200转摇床上培养10天得到菌丝液，菌丝液在无菌条件下粉碎；在500ml PDB接入菌丝液25ml，室温下静置培养2周后过滤分别获得发酵液与菌丝体。

2)制备球腔菌素：发酵液用乙酸乙酯萃3次后萃取液浓缩得浸膏A，重1.72g，菌丝体用丙酮浸泡过夜后浓缩至小体积，获得浸膏B，重1.76g；合并二部分得浸膏C，重3.5g；取浸膏C3.5g加15g硅胶拌样，旋转蒸发仪蒸干，200-300硅胶950克干法装柱，将拌样后的样品上样后进行柱层析分离，依次用石油醚：乙酸乙酯体积比4:1，石油醚：乙酸乙酯体积比3:2，石油醚:乙酸乙酯体积比3:7，乙酸乙酯：甲醇体积比4:1分别进行梯度洗脱分离，硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色，合并Rf值为0.46且茴香醛显色为蓝色的组分；该组分1.70g用凝胶柱层析分离纯化，以氯仿：甲醇体积比1:1为洗脱剂洗脱分离，硅胶薄层层析和茴香醛显色剂显色，获得球腔菌素纯品300mg。

3)制备球腔烯胺：取纯品球腔菌素200mg，于三颈瓶中，冰盐浴中至0℃，通入氨气反应30分钟，样品浓缩至干，取浓缩后的样品7克用甲醇溶解，加14g硅胶拌样上柱，加入洗脱剂为石油醚：氯仿：甲醇＝18：4：1，200-300目硅胶柱层析分离，获得新化合物球腔烯胺150mg。

2.根据权利要求1所述的新化合物球腔烯胺的制备方法，其特征是：所述的球腔烯胺具有免疫抑制活性。

3.根据权利要求2所述的新化合物球腔烯胺的制备方法，其特征是：所述的球腔烯胺在2nM浓度下对刀豆蛋白A诱导的T细胞增殖的免疫抑制率为32.4±6.2％。

4.根据权利要求2所述的新化合物球腔烯胺的制备方法，其特征是：所述的球腔菌素具有免疫抑制活性。

5.根据权利要求4所述的新化合物球腔烯胺的制备方法，其特征是：所述的球腔菌素在10μM浓度下的免疫抑制率为51.28％。