CN106008982B - 一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学领域，更具体地涉及一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法。具体步骤如下：（1）在氮气保护中，将功能单体4‑巯基苯硼酸与适量催化剂溶于溶剂中，磁力搅拌混合均匀；（2）加入炔基修饰的硅胶并在65℃温度下，恒温反应10‑70小时。反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用甲醇，水，甲醇三种溶剂进行冲洗。洗涤后产物干燥，即得本发明的硼酸硅胶前处理材料。

Description

一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法。
背景技术
糖蛋白作为一类重要的翻译后修饰蛋白，在信号转导、免疫及肿瘤发生等生物学过程中发挥着重要的作用。因此，糖蛋白和糖肽的发现与鉴定在疾病的诊断和蛋白质组学领域意义重大。目前，用于N 连接糖肽富集的主要方法有凝集素、酰肼、亲水作用色谱、硼酸亲和色谱等。对于具有1,2- 顺式二醇化学结构的糖型，苯硼酸可以与其形成可逆的五元或者六元环的酯，同时苯硼酸具有亲水性，能够与糖肽选择性结合。硼酸材料对糖肽的富集选择性集亲和和亲水作用力为一体，不仅能够避免糖链结构遭到破坏，而且所富集的产物与质谱兼容，对于研究糖蛋白糖基化位点信息及糖型结构归属较为方便。因此，硼酸在糖肽的选择性富集领域受到了人们的关注。而由硼酸为键合相开发的亲和材料也在糖蛋白或糖肽选择性富集中起到了越来越重要的作用。
点击化学指的是一类转化率高，产率高，操作简便，绿色环保的化学反应，广泛的应用在生物，药物等领域。我们课题组曾经将点击化学(Click Chemistry)用于合成硅胶基质的色谱固定相，相应的文章发表在国际知名期刊上（Journal of Chromatography A2009, 1216: 257-263；Chemical Communications 2007, 2491-2493；ChemicalCommunications 2006, 4512-4514；Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011，399，3359-3365; Talanta, 78 (2009) 916-921; Journal of separation science, 33:9 (2010) 1224-1230; Analytical Method, 2012，4, 1244-1251）。这些方法采用的均是铜催化的点击化学反应，虽然得到较高的反应效率，但是反应过程中引入铜这个重金属，会给色谱分离带来影响，因此有必要加以改进。无铜催化的点击化学以其高转化率，高产率，以及避免铜的引入，引起了研究人员的重视。以2,2’-偶氮二异丁腈催化的炔基和巯基反应的点击化学方法就是一种无铜催化的点击化学反应（J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131,14673–14675），相比较而言，合成转化率高，且没有铜离子的引入，是一种理想的化学反应。然而这种方法目前没有引入到色谱填料制备中，而且用于硼酸硅胶前处理材料的制备也未见报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于无铜催化的硼酸硅胶前处理材料制备方法，具体步骤如下：
（1）氮气保护下，将2,2’-偶氮二异丁腈加入功能单体4-巯基苯硼酸的甲醇溶液中磁力搅拌混合均匀；
（2）在搅拌的溶液中加入炔基修饰的硅胶，并在65℃条件下将样品反应10-70小时；
（3）反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用甲醇，水，甲醇等溶剂进行冲洗。洗涤后产物干燥，即得本发明的硼酸硅胶前处理材料。
在本发明的一个实施方案中，步骤2中所述的材料为炔基硅胶材料，为实验室自制，制备和表征方法均参照文献（Chem. Commun. 2007, 2491-2493）；溶剂为甲醇。
在本发明的另一个实施方案中，炔基硅胶材料、4-巯基苯硼酸与溶剂的重量比为1：0.2～5：5～100，优选为1：0.8：20。
在本发明再一个实施方案中，步骤（2）中所述催化剂为2,2’-偶氮二异丁腈，4-巯基苯硼酸与催化剂的重量比为24：1，反应温度优选为65℃，反应时间为48小时。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
（1）氮气保护下，将2,2’-偶氮二异丁腈(160 mg)加入功能单体4-巯基苯硼酸(3.8g)的甲醇溶液(50 mL)中磁力搅拌混合均匀；
（2）在搅拌的溶液中加入炔基修饰的硅胶，并在65℃条件下将样品反应24小时；
（3）反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用甲醇（500mL），水(500mL)，甲醇(200mL)进行顺序冲洗。洗涤后产物干燥，即得本发明的硼酸硅胶前处理材料。
另外，本发明还设定了以下对比例，具体如下：
对比例1：不采用氮气保护，其他同实施例1；
对比例2：炔基硅胶材料、4-巯基苯硼酸与溶剂甲醇的重量比为1：0.2：20，其他同实施例1；
对比例3：炔基硅胶材料、4-巯基苯硼酸与溶剂的重量比为1：5：50，其他同实施例1；
对比例4：催化剂为光催化，紫外可见光波长为254-470 nm，其他同实施例1；
实施例2
将实施例1制备的硼酸硅胶前处理材料1.5mg和50%乙腈/0.1%甲酸水溶液以一定比例（1:1.5，v:v）混合后超声分散5 min，装填于GE Loader小柱中，并用50%乙腈/0.1%甲酸水溶液（50 uL）清洗。备用。
实施例3
进行糖肽选择性富集实验，采用基质辅助激光解吸（MALDI）质谱以辣根过氧化物酶（HRP）酶解物作为分离对象，进行糖肽选择性富集，富集条件为：将实施例2中所制备的装有填料的GE Loader小柱，先用80%ACN（乙腈）/ 0.1%甲酸溶液（50 uL）清洗，弃除流出液。采用糖蛋白酶解物HRP作为对象进行亲水富集：取HRP酶解液（1mg/mL）（2 μL）旋干后，加入80%ACN（乙腈）/0.1%甲酸溶液（20uL）重溶解，上样GE Loader小柱。分别用上样缓冲液80%ACN（乙腈）/0.1%甲酸水溶液（40 μL）清洗，淋洗缓冲液50%ACN（乙腈）/ 0.1%甲酸溶液（20 μL）洗脱。所得的样品冷冻浓缩干燥以后，用70% ACN/0.5%TFA（20 μL）重溶，用MALDI质谱进行分析，采用DHB作为基质。并归纳实施例和对比例从HRP中富集出的糖肽数目，考察材料的糖肽富集选择性。
具体结果如下表显示
表1 实施例和对比例的糖肽选择性富集结果
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (5)

1.一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)氮气保护下，将2,2’-偶氮二异丁腈加入功能单体4-巯基苯硼酸的甲醇溶液中磁力搅拌混合均匀；
(2)在搅拌的溶液中加入炔基修饰的硅胶，并在65℃条件下将样品反应10-70小时；
(3)反应结束以后，将产物采用砂芯漏斗抽滤，并分别用甲醇，水，甲醇进行顺序冲洗；洗涤后产物干燥，即得本发明的硼酸硅胶前处理材料。
2.根据权利要求1所述的一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法，其特征在于，步骤1中2,2’-偶氮二异丁腈与功能单体4-巯基苯硼酸的摩尔比为1:5～50。
3.根据权利要求1所述的一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法，其特征在于，步骤2中炔基修饰的硅胶、4-巯基苯硼酸与甲醇的重量比为1:0.2～5:5～100。
4.根据权利要求3所述的一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法，其特征在于，步骤2中炔基修饰的硅胶、4-巯基苯硼酸与甲醇的重量比为1:0.8:20。
5.根据权利要求1所述的一种硼酸硅胶前处理材料的制备方法，其特征在于4-巯基苯硼酸与2,2’-偶氮二异丁腈的重量比为24:1，反应时间为48小时。
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