CN1060027A - 改进的佐剂和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明包括佐剂，当该佐剂与抗原混合并给人或 动物施用时，比起单独施用抗原，对该抗原引起更强 的免疫应答。在很多情况下，本发明所述佐剂将增加 对该抗原具有特异性的特异同型抗体的总滴度。例 如，在鼠中，当本发明的佐剂与常规的抗原混合时，在 鼠中诱导的同型，从占优势的IgG1转化为更具保护 性的IgG2同型，有些情况下转化为IgG3同型。因 此，通过实施本发明，可以改造常规疫苗的总体保护 作用。

Description

本发明涉及疫苗佐剂和用佐剂改进疫苗。可以设计一定佐剂使免疫应答主要为所需同型的抗体，例如鼠的IgG2或IgG3同型或者人和其他动物的相应同型抗体，因此改进了疫苗的保护作用。另外，本发明改进的疫苗和佐剂提供了长期持久的保护作用。
术语“抗原”是指任何可用作免疫应答目标的物质。免疫应答可以是细胞的，也可以是体液的。术语“疫苗”在本文中是指抗原部分的悬浮液或溶液，通常它含有感染剂或感染剂的某些部分，将其注射进体内产生自动免疫。制备疫苗的抗原部分可以是微生物，也可以是从微生物提纯的天然产物、合成产物或者遗传工程蛋白质、肽、多糖或者类似的产物。术语“细胞介导的免疫”是指免疫应答是由细胞而不是抗体介导的。它包括（但不限于）迟发型超敏反应和细胞毒性T细胞。本文所用术语“佐剂”是指与所注射的免疫原混合能够增加或者修饰免疫应答的任何物质。“半抗原”在本文中是指与合适的抗体或T细胞选择性反应的物质，但是半抗原本身通常不是致免疫的。大多数半抗原是小分子或者大分子的小部分，但是一些大分子也可以具有半抗原的功能。本文所用术语“共轭作用”是指以共价或者其他形式连接两个或多个分子。它可以通过化学方法或者通过体内生物学方法例如遗传工程来实现。术语“同型”是指任何抗体的亚型。术语“脂多糖”（LPS）是从革兰阴性细菌的外膜获得的两亲糖磷脂，它具有被称作类脂A的疏水部分和糖部分（多糖或者寡糖）。术语“无毒的LPS”是指具有很低毒性的LPS，该毒性是以根据对动物50%致死剂量（LD50）、50%鸡胚致死剂量（CELD50）、兔子的致热性或者皮肤的施瓦茨曼反应进行一项或多项测量来确定的，也可以通过体外测量由巨噬细胞诱导的组织坏死因子和/或IL-1，来测定LPS毒性。术语“去毒LPS”是指通过将类脂A部分的结构化学改性，从而降低了毒性的LPS，化学改性即除去一个磷酸根基团，除去一至三个脂肪酰基，引入新的官能团（例如甲基、乙酰基和醇等），或者部分还原或氧化。
有效的疫苗对于正确的一种抗原或多种必需引起合适的应答。有几种独特的免疫应答类型，它们具有不同的保护能力，以抵抗特殊的疾病。例如，抗体具有抗细菌感染的保护作用，但是对于排除身体很多病毒感染和肿瘤来说则需要细胞介导的免疫。有多种独特的抗体与细胞介导免疫应答类型。细胞间介的应答分为两个基本组：1）迟发型超敏性反应，其中T细胞通过巨噬细胞和其他细胞或者细胞产物间接发挥作用，和2）细胞毒性反应，其中特化T细胞专门和直接进攻感染的细胞，并杀死感染的细胞。
有五类主要的抗体：IgM、IgG、IgE、IgA和IgD。这几类抗体具有独特的免疫应答功能。IgG，在血液中占优势的一类抗体，细分为几个不同的亚类或者同型。在鼠中，这些同型是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在人体中，这些同型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。1在已经研究的很多其他哺乳动物种中已经定义了相似的同型。在不同种中，IgG同型的命名不同，因为这些名称是在抗原同型的结构和功能被认识到之前就给定的。尽管许多IgG同型还需进一步了解，但是已表明IgG同型在哺乳动物种中是高度地守恒。
IgG同型具有不同的抗特殊感染的保护能力。鼠的IgG2a和IgG2b能激活补体、介导抗体介导的和细胞介导的细胞毒性及其他功能。它们对于抵抗很多细菌、病毒和寄生虫感染尤其具有有效的保护作用。人的相似同型以IgG1和IgG3表示。与此形成对照，鼠IgG3对于抵抗具有多糖膜的细菌例如肺炎球菌尤其具有有效的保护作用。人的相似同型似乎是IgG4。象鼠IgG1这样的同型不结合补体、不能有效地中和毒素，而它们对于很多细菌和病毒感染的作用明显很低。由于不同的IgG同型明显地具有不同的免疫能力，因此对于特定的感染用疫苗诱导最适合同型是重要的。虽然命名不同，但是有效证据和现代理论表明，在哺乳动物各个种之间，那些决定所产生抗体同型的免疫原的性质是相似的。换句话说，在一个种内能刺激延发型超敏IgG和补体结合的IgG抗体的免疫原，在其他的种内一般也能刺激相似的应答。
利用生物合成和重组DNA技术可以发展从前不可能生产的具有抗原表位的疫苗。目前候选的疫苗实际上包括所有感染剂、变应原以及宿主成分，例如激素和与自身免疫疾病、癌症和其他疾病有关的分子。感染剂包括（但不限于）病毒、细菌、寄生虫、立克次体和真菌。对作为疫苗、用于不同目的（例如避孕和治疗疾病）激素进行评估。治疗癌症例如黑瘤的疫苗在动物和人体中进行评估。对于每个患例，疫苗的最适作用取决于刺激合适的类型、免疫应答的强度以及持续的时间。
对寄生虫病疟疾所进行的研究尤为重要。为种疾病每年在全世界范围内要侵袭2亿多人，并且从发病率和工作损失来说，它在全世界都是最重要的疾病。现在利用遗传工程技术已经识别并且大量生产出了几种与疟疾寄生虫有关的肽和蛋白质。特别是已经测定出子孢子期的一个12氨基酸肽运载了一个重要的抗原位点。在注射了抗该特定肽的抗体后可以立即杀死寄生虫。遗憾的是，这种肽本身不能产生足够的免疫应答。每种疟疾有不同的肽，但是发现所有这些肽都具有特定的结构和重复单元。
为了对子孢子肽产生有效的免疫应答，使肽与载体共轭，并且与佐剂一起施用。但是至今为止，与肽或者肽共轭物一起使用的佐剂还不能产生令人满意的结果。在疟疾寄生虫的嗜血期已识别出同样重要的抗原，但是市售的疫苗制剂还不能产生保护性免疫。
人免疫缺陷病毒（HIV）引起了艾滋病（AIDS）。从HIV已经制备出了很多重组体和肽抗原。有证据表明抗这些抗原的抗体能够使病毒失去作用，并且体免疫应答能够防止和控制感染。但是通常能产生抗HIV保护性免疫应答的有效的疫苗仍然难以实现该目的。流感嗜血杆菌（Hemophilusinfluenza）和肺炎球菌（Pneumococcal  Pneumonia）提供了进一步的例子。这些细菌的重要抗原是多糖，它在婴儿和老年人中所引起的保护性免疫应答很弱，而这些人正是这些感染最危险的人群。除肿瘤和其它能通过免疫应答调节的疾病外，很多其它病毒、细菌和寄生虫感染也存在同样的状况。现代科学提供了识别和产生很多由免疫应答影响的疾病抗原的方法，许多引起最佳保护作用的新抗原的不足显著地表明需要增加一些方法，从而对疫苗所产生的免疫应答的类型、强度和持续时间产生影响。
因此，增加了人们发展有效的无毒佐剂，以提高、以及或许更重要的是调节半抗原表位的致免疫力的优点。另外，需要将佐剂与常规疫苗一起使用，以产生较早的、更有效的或者更长期的合适类型的应答。这种佐剂对于抗原供给有限或者造价昂贵的情况也是有益的。
直到目前为止，佐剂的发展仍然是经验性的。已经发现了大量可调节免疫应答的化合物。值得注意的是，这些化合物的本质和功能均不同，而实际上进行了多种尝试以发现佐剂的一致作用机理。对这些机理的解释已经落后于目前对免疫***的了解方面的进展。
佐剂的这种多样性已经使对其分类产生了困难。有时将佐剂按照其来源分矿物、细菌、植物、合成的或者宿主产物。这种分类的第一组是矿物佐剂，例如铝化合物。首先将铝化合物作为佐剂使用记载于1926年。从那时起，用铝盐沉淀抗原或者将抗原与铝化合物混合或者用铝化合物吸附抗原就已被广泛使用，以增强动物和人的免疫应答。铝化合物及相似的佐剂呈现了下面的工作原理：铝和抗原物理结合成颗粒，经注射后，这些颗粒在组织中形成抗原的积存，抗原缓慢***，因此延长了抗原与呈现于抗原的细胞（例如巨噬细胞或囊状树突细胞）之间相互作用的时间。另外，免疫活性细胞被吸引至注射区域，并且被激活。已经证实在免疫接种第7天后，在兔的局部***中有铝颗粒，并且它可能有另一个重要的功能，就是将抗原引入***所在区域中的T细胞中。已经表明，佐剂的效能与衰竭***的炎症有关。很多研究证实了将抗原与铝盐一起施用导致体液免疫提高，同时细胞介导的免疫只有很小的提高，正如迟发型超敏测量的结果。氢氧化铝作为激活补体的途径也已经被描述。该机理可以对局部炎性应答以及免疫球蛋白产生和B细胞记忆起作用。
主要因为其良好的安全记录，铝化合物至今是仅有的人用佐剂。但是它们并非不存在问题。含有铝的疫苗有时引起局部反应。虽然变应原反应通常不表现出临床问题，但是据说铝盐通过T细胞依赖机理将嗜酸性细胞吸引至注射区域，如果在抗原起动后注射会诱导IgE应答，并且产生具有促进IgE应答功能的载体特异性细胞群。此外，含铝的疫苗不能冻干，必须冷却运输和贮存。因此具有污染危险。
最后，也是最重要的，铝化合物并非总是成功地引起持久的对疾病的保护作用。这是部分地因为它们不能诱导最适的抗体同型或者细胞介导的免疫的最佳类型。因此对于只需要抗体应答从而产生保护作用的强免疫原，铝盐是足够的佐剂，而当其与弱免疫原（例如合成的疟疾肽）一起使用或者用于引入细胞介导的免疫应答或需要对抗感染类型的IgG同型时，它们是无效的。
另一个大组的佐剂是那些细菌源。最近已经纯化并且合成了具有细菌源的佐剂（例如muramyl二肽，类脂A）并且已经克隆了宿主介体（白细胞介素1和2），它们提供了具有化学特性的研究用产物。近十年来，在化学纯化三种细菌源活性成分的佐剂方面已取得了显著的进展，这三种佐剂是百日咳杆菌（Borde-tella  pertussis）、脂多糖和弗氏完全佐剂（FCA）。
百日咳杆菌是重要的，因为它能够通过在T淋巴细胞群上的作用调节细胞介导的免疫。对于脂多糖和弗氏完全佐剂，已经识别并且合成了佐剂活性部分，对此可以进行有关的结构-功能研究。
已经发现，脂多糖及其各种衍生物，包括类脂A，与脂质体或其他脂质乳剂结合时，是高效的佐剂。还不能确定能否生产用于人类的具有显著低毒性的衍生物。弗氏完全佐剂在多数实验研究中是标准的。但是它产生严重的局部和全身性炎性反应，其严重程度足以使宿主残缺或杀死宿主。它不能用于人类并且可能禁止用于动物。
在很多时候，许多其他类型的物质也被用作佐剂。这些物质包括植物产物，例如皂素、动物产物，例如几丁质和许多合成的化学试剂。还没有证实这些类型中的佐剂源对于预言其生物学性质特别有用。
佐剂还根据其建议的作用机理进行分类。这种类型的分类带有一点任意性，因为多数佐剂通过一种以上机理表现其功能。佐剂可以通过抗原定位或传送发生作用，或者直接作用于细胞，例如巨噬细胞和淋巴细胞修补免疫***，佐剂提高免疫应答的另一种机理是通过产生抗原积存。铝化合物、油乳胶、脂质体和合成聚合物的佐剂活性属这种类型。已表明，脂多糖和muramyl二肽的佐剂活性主要是通过巨噬细胞活化介导的，而百日咳杆菌对巨噬细胞和淋巴细胞都有影响，新近的和推测的免疫强化方法，例如利用单因子（monokines）和淋巴因子，以及抗原、载体和佐剂的手法，以加强免疫应答，是当前流行的方法。
小免疫原例如合成的疟疾肽，可以连接到较大的蛋白质或者其他载体上，以增强免疫应答。与致免疫力有关的抗原的分子大小与复杂性之间的关系反映出了分子上抗原决定簇的有效性。这种关系是Landsteiner在证明需要将小基团与较大（载体）分子配合以刺激免疫应答时首先注意到的。但是这种机理的基础还有待实验，以证明载体的作用和最少需要一分子上有两种抗原决定簇以表达致免疫力。这些决定簇分别代表了与T和B淋巴细胞相互作用的载体和半抗原决定簇。但是，在T依赖性体液应答中载体部分的影响超出了通过T细胞活化所产生的简单抗原性。
在抗原分子上决定簇的结合可以通过各种类型的辅助基因T细胞和抑制基团T细脆的不同活化作用影响免疫应答。演示这种作用的模型***是应答者（C57B1/6）和非应答者（DBA/1）鼠对合成三元共聚物1-谷氨酸60-L-丙氨酸30-L-酪氨酸
Figure 911052801_IMG1
（GAT）的遗传控制体液应答，当C57B1/6鼠对该多肽有应答时，而仅仅假如GAT与甲基化牛血清白蛋白（MBSA）偶合，那么DBA/1鼠才有应答。但是，如果在用GAT-MSBA免疫之前给鼠注射GAT，则不能产生可测量出的对GAT的抗体应答。对这些现象的解释是GAT刺激了应答鼠中的辅助基因T细胞，但是优先激活了非应答鼠中的抑制基团T细胞。这种抑制基团的优势阻止了对GAT、甚至与MBSA偶合的GAT的应答。但是，如果主要是用GAT-MBSA免疫，那么通过载体部分活化辅助因子T细胞有助于压倒任何GAT活化抑制因子细胞的作用。
已证实联合阴性蛋白分子的决定簇也表现出具有不同的辅助和抑制作用。致免疫载体对抗原的共轭作用能够改变对该抗原的应答产生的抗体的同型。从很多胶囊包着的细菌中纯化的多糖是非胸腺依赖性的抗原，这归因于它们具有多种重复抗原决定簇的高聚物性质。当它们代表这些细菌的保护性抗原时，所产生的IgM抗体对于预防疾病只有有限的效力。这主要归因于，处于高度感染危险的非常年幼和年老的个体中，它们不能刺激免疫记忆或者足够的免疫应答。因此，已将脑膜炎奈瑟菌（Neis-seria  meningitidis）和b型流感嗜血杆菌的多糖与蛋白质，例如破伤风类毒素共轭。这些共轭制剂起到胸腺依赖性抗原的作用，并且引起IgG对多糖部分的应答以及免疫记忆。它们也在年幼和年老的个体中引起应答。同样地，非胸腺依赖性多糖载体对于提高肽（例如那些包括需要胸腺依赖性IgG免疫应答的疟疾肽）的致免疫力具有很小的效力。
Feldmann和Lee以及其他作者的出版物说明了沙门菌属（Salmonella）生物体的鞭毛抗原是典型的非胸腺依赖性抗原，它刺激强的IgM抗体应答。2，3它们只刺激晚成熟的B细胞，而B细胞在婴儿中是不存在的。这些免疫原还趋于在婴儿中产生耐药力，而在成年人中不容易产生记忆或者由胸腺依赖性抗原引起的其他方面的复杂免疫应答。这些公开的资料使人们确信，它们作为疟疾肽或者其他需要胸腺依赖性IgG抗体应答的小抗原的佐剂或者载体没有什么效力。
或许没有精确的区分点，以区别佐剂和载体。载体部分是有助于抗原的性质的，这被称作固有的辅佐性。某些材料将耐受原转化为免疫原的能力被称作外源辅佐性。通过增加抗原的大小可以提高辅佐性，通过蛋白质的凝聚反应或者吸附在致免疫的或惰性载体上可增加抗原的大小。于是，能吸附抗原并增强免疫应答的材料，例如氢氧化铝、乳胶颗粒、膨润土或脂质体，被称作佐剂。但是，所观察到的这种抗原凝聚反应的作用只代表有限的佐剂作用，而目前这种作用认为是极复杂的。
在不使用佐剂的情况下，小肽和其他半抗原不能引起强的免疫应答。目前能得到的很多佐剂是有毒性的和/或不能引起免疫应答，以有效地保护动物和人抗感染剂的感染。因此，需要一种疫苗，该疫苗能够施用于动物或人，并且引起免疫***增强持久的和有效力的、对合适抗原的正确类型的免疫应答。
已表明，大量疏水性非离子嵌段共聚物表面活性剂是能适用于人的有效的致免疫佐剂。4，5，6它们具有粘结剂的作用，能够以促进抗原出现的方式将蛋白抗原结合到油滴和/或细胞的表面上。以前的研究已经证明了这些共聚物能引起高滴度、持久的抗体应答。有趣的是，密切相关的共聚物却有很弱的活性，不是佐剂，或者引起不合适的应答或引起耐药性。这就造成了佐剂活性的预言复杂化和不精确性。
有人可能预言，其主要活性是细胞刺激或免疫调节的佐剂，与粘性共聚物佐剂结合可能很好地发挥作用。已有报导，共聚物PLURONICRL121与MDP的苏氨酰衍生物结合比起L121自身产生更好的应答，特别是细胞介导的免疫应答7。
众所周知，脂多糖作为B细胞***素对巨噬细胞具有显著的作用。8很多年以来，其佐剂活性就是已知的，但是其应用受到毒性和效力不稳定的限定。在几篇论文和综述中已经报导了脂多糖的生物学活性存在于脂多糖分子的类脂A部分中。9已经发展了几种方法，以降低LPD制剂的毒性，同时保留其佐剂活性。这些方法包括除去类脂A上的磷酸基从而产生一磷酰基类脂A（MPL），或者除去类脂A部分的一个或多个脂肪酸链。有些类型的LPS，特别是球形红假单胞菌（Rhodopseudomonassphaeroides），有不同的类脂A并且本身是无毒的。
抗体的同型对于抗很多感染是非常重要的，但是关于如何产生特定的同型应答却知道的很少。已将IgG2a与作为抗各种病原体，包括克氏锥虫、10，11T.musculi12和PLasmodium Yoelii（疟病）以及布鲁杆菌（bacterium Brucella的保护性同型联合。IgE抗体对于鼠寄生虫是特别有毒的，许多寄生虫包括蠕虫、血吸虫和幼线虫天然主要刺激IgG1和IgE抗体。IgG1和IgE的产生表明是相互关联的。每种适用于中和特定感染剂的同型都有功能优点。IgG2a最容易与叵噬细胞结合，它能影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用，并且能活化补体。鼠IgG3同型对于抗胶囊包裹的细菌（例如肺炎双球菌（S.pneumoniae））感染的保护是特别有效的。
最后，由肺炎双球菌引起的疾病是最重要的婴儿和儿童的细菌感染之一。含有23种肺炎球菌的胶囊多糖的多价疫苗目前已广为使用。几项研究表明，该疫苗在预防菌血病方面的效力是2-10岁儿童为0%，大于10岁的人为49%。没有令人信服的证报表明该疫苗对慢性病有效，而且研究表明该疫苗对老年患者和长期患病的（institutionalized）患者没有作用。
胶囊多糖自身是非胸腺依赖性2型（TI-2）抗原，它们对于非常年幼和年老的人没有致免疫作用。TI-2抗原只诱导有限量的同型，主要是IgM。它们只引起弱的记忆应答，或者不引起记忆应答，而且容易引起耐药性。
因此，在疫苗领域中需要一种组合物和施用疫苗的方法，以诱导最有效的和保护性抗体同型。该疫苗还应该能诱导长期持久的、高滴度的抗体。
本发明包括疫苗佐剂，当该疫苗佐剂与抗原混合并施用于人或动物时，能引起比单独施用抗原时更强的对抗原的免疫应答。在很多情况下，本发明所述佐剂将增加对疫苗抗原抗体特异性的总滴度。例如，当用常规的抗原实施本发明时，所诱导的同型从主要的IgG1同型转变为更具保护性的IgG2同型，而且在有些情况下，转变为IgG3同型或者其他种的相应同型。因此，通过实施本发明，人们能够改进常规疫苗的总体保护作用。
另外，本发明对于诱导抗肽抗原的保护性抗体特别有效。肽抗原包括（但不限于）（天冬酰胺-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸）5-酪氨酸[（NAGG）5]疟疾抗原。它对于很宽范围的抗原和各种类型的抗原都是有效的，这些抗原包括多糖例如肺炎球菌多糖、寡糖、蛋白、肽和天然的或合成的半抗原，或者这些物质的结合物。
本发明包括佐剂和由抗原与改进的佐剂组成的疫苗。在本发明一个具体例子中，将抗原与有效量的具有下列通式的表面活性共聚物混合：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4500-9000，而亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。
本发明改进的疫苗还包括抗原和佐剂，其中佐剂包括具有下列通式的表面活性共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，而亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%，该共聚物配制成油包水型乳剂。该共聚物对常用的油包水型疫苗乳剂不稳定，但是如果去掉通常的乳化剂，则意外地增加了其效力和稳定性。
含有无毒脂多糖的佐剂也将作为本发明的一部分。无毒脂多糖可以是天然产生的脂多糖，例如从球形红极毛杆菌得到的脂多糖，或者去毒的脂多糖。期望从有毒的脂多糖制备佐剂，其中分子的糖部分不动，分子的脂A部分被改性，从而使脂多糖具有非常低的毒性。
本发明的改进疫苗还包括抗原和佐剂，其中佐剂含有具有下列通式的表面活性共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%，还含有脂多糖（LPS）衍生物。含有LPS和表面活性共聚物的结合物的佐剂在滴度峰值、达到峰值的时间和应答时间长度方面产生了协同作用。此外，这种结合导致增加了保护性IgG2同型。
这种类脂共轭的多糖与共聚物和免疫调节剂例如一磷酰基类脂A的结合引起强IgG3应答的产生，该应答中存在所有的IgG亚类。特别是，具有抗肺炎球菌感染保护性的IgG2和IgG3占优势。这是意外的发现，因为在免疫原制剂中不含蛋白质或者肽。人们相信，对于刺激产生这些同型需要的T细胞来说，肽部分是必需的。其他人曾经报导，多糖不能刺激T细胞。然而，共聚物、类脂共轭的多糖和免疫调节剂的结合能产生这种应答。
本发明还包括一种疫苗，该疫苗对于抗蛋白质、小肽、多糖或半抗原使动物或人免疫特别有用。按照本发明，将蛋白质、小肽、多糖或半抗原与从微生物得到的鞭毛共轭。鞭毛可以从任何具有鞭毛的微生物得到;但是优选从沙门菌种（Salmonellaspecies）得到的。
此外，可以通过遗传工程得到鞭毛。因此，本发明的一个目的是提供一种疫苗，该疫苗对于小致免疫决定簇提供延长的和强力的免疫应答特别有效。当共轭的鞭毛加上抗原与具有下列通式的共聚物和脂多糖（LPS）衍生物混合时更为有效：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。含有LPS和表面活性共聚物的结合物的该佐剂在滴度峰值和达到峰值的时间方面产生协同作用。此外，该结合导致保护性IgG2同型增加。
因此，本发明的一个目的是提供一种与抗原一起施用的改进的佐剂，该佐剂能对该抗原引起更强的免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗，该疫苗在婴儿和少儿以及对常规疫苗产生不良应答的成年人中引起较强的对抗原的抗体应答。
本发明的另一个目的是提供一种能诱导所需抗体同型的佐剂。
本发明的另一个目的是提供一种佐剂和疫苗，它们能在对常规疫苗产生不良应答的非常年幼和年老个体中引起保护性免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种佐剂和疫苗，它们能够引起适当平衡的抗体和细胞介导的免疫，从而提供抗特定疾病的最大保护作用。
本发明另一个目的是提供一种能诱导较长期持久的抗体群的佐剂。
本发明的另一个目的是提供一种有效的疫苗，该设苗能够使用重组蛋白或合成肽，以产生持久的能保护个体不被疟寄生虫感染的免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种有效的疫苗，该疫苗能够使用艾滋（AIDS）病毒的合成肽，以产生有效予防该疾病的免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗，该疫苗能够刺激动物或人的免疫***，从而对小的致免疫决定簇（例如肽、半抗原或多糖）或者大分子（例如蛋白质或多糖）产生有效的和延长的IgG应答。
本发明的另一个目的是提供一种对人或动物具有很低毒性的疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗，该疫苗很少或者不引起局部过敏反应。
本发明的再一个目的是提供一种能冻干的疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种弗氏完全佐剂的替代物，以在动物体中产生抗体。
本发明的再一个目的是提供能诱导所需抗体同型的佐剂。
本发明的另一个目的是提供一种可与常规疫苗制剂一起使用的佐剂。
在回顾了下面所公开的具体例子和附加的权利要求的详细说明之后，本发明的这些和其他目的、特征与优点将变得显而易见。
图1是说明在用与沙门菌属的鞭毛蛋白共轭的三硝基苯酚（TNP）免疫的鼠中抗体滴度的图解。
图2是说明用与沙门菌属的鞭毛蛋白共轭的TNP免疫的鼠的剂量应答的图解。
图3是比较用与鸡卵白蛋白（HEA）共轭的TNP免疫的和用与沙门菌属的鞭毛蛋白共轭的TNP免疫的鼠的免疫应答的图解。该图还比较了使用和不使用佐剂T150R1的两种化合物的应用。
图4是说明在使用TNP10-HEA和各种佐剂免疫的应答中，于鼠中产生IgG抗体应答的图解。
图5是说明具有冻干TNP10-HEA抗原的在2%角鲨烷的水包油型乳剂中的共聚物的佐剂作用的图解。
图6是说明含有和不含有所选择共聚物的二氧化硅的油乳胶佐剂作用的图解。
图7是与可溶性抗原，TNP10HEA一起施用的共聚物佐剂进行比较的图解。
图8表示POP的分子量对于对TNP10HEA的抗体滴度的影响。
图9表示类脂A衍生物包括类脂X、类脂IVA、一磷酰基类脂A和（hexacyl  MPL）的化学结构。
图10表示肠杆菌科（SR至Re）的大致化学类型脂多糖的结构。缩写：S，糖;Glc，葡萄糖;GlcNAc，N-乙酰基葡萄糖胺;Gal，半乳糖;Hep，L-甘油基-D-甘露庚糖;P，磷酸根;EtN，乙醇胺;KDO，2-酮-3-脱氧辛酸盐;GlcN，葡萄糖胺;R和R2，磷酸乙醇胺或氨基***糖（不在大肠杆菌（E.coli中）。SR至Re表示LPS的不完全形式或大致的化学类型。Rc和Rd1化学类型在Hep上不连接磷酸根。
图11表示球形红假单胞菌LPS的结构。
图12表示去毒RaLPS的结构。
图13表示给鼠施用含有和不含有去毒RaLPS和/或L141共聚物的TNP-HEA第28天时的IgG应答。
图14表示在共聚物存在和不存在下，对由整个有毒的脂多糖和去毒RaLPS引起的对TNP10HEA的同型应答。
图15表示由L141和/或TDM与MPL结合引起的TNP10HEA的IgG同型浓度。
图16表示小LPS衍生物对于TNP10HEA应答的佐剂作用。
图17表示限定链长度的较大LPS突变体与共聚体L141结合对TNP10HEA的佐剂作用。
图18表示含有不同量O-多糖的最大LPS的部分与共聚物L141结合对TNP141HEA的佐剂作用。
图19表示强度和IgG同型分布随不同摩尔比率肽与鞭毛共轭的变化。
图20表示本发明的佐剂制剂与几种市售佐剂制剂的比较。
图21表示去毒LPS对免疫应答的影响。
图22表示去毒LPS的剂量应答。
图23表示LPS加L141对免疫应答的影响。
图24表示从胶质红假单胞菌（R.gelatinosa）分离出的LPS与L141结合对免疫应答的影响。
本发明包括一种改进的佐剂。本发明的一个具体例子是，将抗原与有效量的佐剂混合，该佐剂含有具有下列通式的表面活性共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4500-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。该共聚物可以从BASF公司（Parsippany，New Jersey）或从Cyt Rx公司（Atlanta，GA）得到。
优选的表面活性共聚物是被称为PLURONIC
Figure 911052801_IMG2
L141的具有下式的共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
另一种优选的表面活性共聚物是被称为PLURONIC
Figure 911052801_IMG3
L180.5的具有下式的共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为5%。
另一种优选的表面活性共聚物是被称为PLURONIC
Figure 911052801_IMG4
L181.5的具有下式的共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为15%。
另一种优选的表面活性共聚物是被称为PLURONIC
Figure 911052801_IMG5
L190.5的具有下列通式的共聚物：
其中疏水基（C3H4O）的分子量约为8600，亲水物（C2H4O）的重量百分数约为5%。
一种佐剂制剂（该制剂将作为本发明的一部分），含油（例如动物油如角鲨烷或角鲨烯、植物油或矿物油）、适于形成油包水乳剂的非离子表面活性剂（例如Span80（一油酸脱水山梨醇酯））、二氧化硅和具有下列通式的表面活性共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。另外，该表面活性共聚物可以是具有下列通式的八嵌段共聚物：
Figure 911052801_IMG6
其中：
由（C3H6O）组成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量约为5000-7000道尔顿;
a是一个数，它使得由（C2H4O）所代表的亲水部分占该化合物总分子量的约10%-40%;
b是一个数，它使得八嵌段共聚物的（C3H6O）部分占该化合物和脂多糖衍生物的约60%-95%。
这些组分优选的量是，角鲨烯约为40%-90%（重量），脱水一油酸山梨醇酯约为2%-50%（重量），二氧化硅约为0.5%-10%（重量），表面活性共聚物约为2%-10%（重量），优选表面活性共聚物是PLURONIC
Figure 911052801_IMG7
L141。优选的二氧化硅的粒度是直径约为0.5-20μ。
作为本发明一部分的另一种佐剂是无毒性脂多糖和去毒的毒性脂多糖。这些脂多糖，它们或者是本身无毒性的脂多糖，或者是被化学改性降低了毒性的有毒脂多糖。这包括轻度碱水解的脂肪酸。
天然产生的无毒脂多糖包括（但不限于）那些与红假单胞菌种（Rhodopseudomonas）、包括球形红假单胞菌（R.spharoides）、嗜酸红假单胞菌（R.acidophilia）、胚素红假单胞菌（R.blastica）、胶质红假单胞菌（R.gelatinosa）、荚膜红假单胞菌（R.capsulata）、池沼红假单胞菌（R.palustris）和绿霉红假单胞菌（R.Viridis）相联系的脂多糖。有几种可行的使毒性脂多糖去毒的方法。这些方法中的一些在实施例中给出。这些方法一般包括分子的类脂A部分化学改性。注意到这一点是重要的，即去毒脂多糖是有毒的脂多糖，其中分子的多糖部分是未变的，分子的类脂A部分通过除去脂肪酸被改性，因此使该脂多糖具有非常低的毒性。
本发明改进的佐剂还含有与具有下列通式的表面活性共聚物结合的脂多糖衍生物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%，本发明还包括与具有下列通式和八嵌段共聚物结合的脂多糖衍生物：
Figure 911052801_IMG8
其中：
由（C3H6O）组成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量约为4000-9000道尔顿，优选5000-7000道尔顿;
a是一个数，它使得由（C2H4O）所代表的亲水部分占该化合物总分子量的约5%-40%;
b是一个数，它使得八嵌段共聚物的（C3H6O）部分占该化合物约60-95%。
该共聚物的（C3H6O）部分可以在该化合物中含高达95%之多。该共聚物的（C2H4O）部分可以在该化合物中含低至5%。
含有LPS与表面活性共聚物结合的该佐剂，在滴度峰值和达到峰值的时间方面，产生协同作用。在一些情况下，特别是使用低分子量脂多糖时，初始滴度较高，然后随时间缓缓降低。使用高分子量脂多糖时，初始滴度较高，而且一直保持高水平的应答。使用所有这些脂多糖时，它们的结合将增加保护性IgG2a和IgG2b同型。这是出人意料的，因为已有报导，LPS本身作为佐剂主要引起IgG1免疫应答。
这种改进的佐剂还含有具有下列通式的表面活性共聚物：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%;以及含具有下列通式的反八嵌段共聚物：
Figure 911052801_IMG9
其中：
由（C3H6O）组成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量约为5000-7000道尔顿;
a是一个数，即它使得由（C2H4O）代表的亲水部分构成该化合物总分子量的约10%-40%;
b是一个数，即它使得八嵌段共聚物的（C3H6O）部分构成该化合物的约60%-90%。
该共聚物的（C3H6O）部分可以在该化合物中占高达95%。该共聚物的（C2H4O）部分可以在该化合物中占低至5%。
a是一个数，即它使得由聚氧乙烯（C2H4O）代表的亲水部分构成该化合物总分子量的约5%-40%;
由聚氧丙烯（C3H6O）组成的八嵌段共聚物的疏水部分的平均聚集分子量约为4000-8000道尔顿;b是一个数，即它使得八嵌段共聚物的总分子量中的聚氧丙烯（C3H6O）部分占约60%-90%。
该共聚物的（C3H6O）部分可以在该化合物中占高达95%。该共聚物的（C2H4O）部分可以在该化合物中占低至5%。
改进的佐剂还含有具有下列通式的表面活性共聚物。
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000;亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%;以及含具有下列通式的八嵌段共聚物：
Figure 911052801_IMG10
由（C3H6O）组成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量约为5000-7000;
a是一个数，即它使得由（C2H4O）代表的亲水部分构成该化合物总分子量的约10%-40%;
b是一个数，即它使得八嵌段共聚物的（C3H6O）部分构成该化合物的约60%-90%。
该共聚物的（C3H6O）部分在该化合物中可占高达95%。该共聚物的（C2H4O）部分在该化合物中可占低至5%。
本发明还包括含有抗原和上述佐剂的疫苗。
本发明还包括一种疫苗，该疫苗对于抗多糖、蛋白质、小肽和其他半抗原，使动物或人免疫特别有用。根据本发明，将小肽或半抗原与从微生物得到的鞭毛共轭。鞭毛可以从任何具有鞭毛的微生物得到;但是，优选从沙门菌种得到的。应该理解，对于任何特殊的应用，那些优选的获得鞭毛的细菌种类取决于该应用需要的特定抗原，而这对于本发明不是关键的。
有些细菌具有单一的鞭毛，而另一些具有一丛鞭毛，还有一些具有分布于整个细胞表面的鞭毛。细菌鞭毛的直径为10-35nm，有时长度可以超过10-15μm，或者是细胞直径的很多倍。多数细菌鞭毛呈现有规律的和均匀的卷曲，其波长约为2.5μm。
当细菌鞭毛（实际上是蛋白质）被酸化至PH＝3时，它们分解成为完全相同的被称为鞭毛蛋白的单节显性亚单位，在大多数种类中，其分子量约为40000，在合适的PH和盐浓度条件下，鞭毛蛋白单体将自发地再聚合，形成与完整的鞭毛完全相同的结构，该鞭毛具有与天然鞭毛同样波长的有规律的卷曲。
天然形式的或者用许多固定剂固定的完整细菌鞭毛可用于实施本发明。另外，再聚合的鞭毛蛋白在实施本发明中是令人满意的。可以确信，本发明的基本组成部分是由聚合物组成的制剂，其中聚合物由规则地按几何学模型分隔的鞭毛蛋白分子组成，从而产生拉长的特定微生物的典型鞭毛结构。
已经发展了很多从细菌培养物制备鞭毛的方法，这些方法对于那些本领域的普通专业人员来说是众所周知的。优选的方法是如本文所述的改进的Kobayashi等人的方法。13
将菌株TY2的伤寒杆菌（Salmonella  typhi）生物体在能动性琼脂中生长。应该选择高能动生物体，因为它们产生最多的鞭毛。然后将生物体接种于20升类胰蛋白酶（trypticase）大豆肉汤中，并在37℃培养约30小时，直到对数相生长终止。此时可以通过加入甲醛杀死生物体，从而产生0.3%悬浮液。优选通过离心收集生物体;但是应该小心以避免产生过多的切应力。然后在振动器上剧烈振摇20分钟，从生物体上除去鞭毛。其他能产生切应力以切下鞭毛而不破坏生物体的混合方法与装置同样是令人满意的。
然后通过差速离心将鞭毛从细胞体上分离。在标准实验离心机上，以大约2000rpm的转速离心，除去细胞体。然后以30，000rpm的转速超速离心收集鞭毛。然后将鞭毛再悬浮并在超速离心机上再次离心，并将可溶性污染物质倒掉。大的污染物质将在透明鞭毛小球的底部形成黑点。物理分离出这种物质并将其去除。从20升细菌培养物中得到的最终产物将是约100mg纯化的鞭毛。
在大约pH2将未固定的鞭毛酸化过夜，可以制得鞭毛蛋白。这种处理将鞭毛蛋白分解，产生分子量约为30，000的鞭毛蛋白单体。当这种单体在中性pH条件下静置至少24小时后，这种单体重新聚集成聚合的鞭毛。这种再聚合的鞭毛蛋白作为佐剂和载体对小抗原部分的作用接近于天然鞭毛。单节显性鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白的蛋白水解裂片效果非常低。
可以通过本领域普通专业人员所熟知的任何一种标准方法，将抗原即蛋白质、多糖、半抗原或者肽部分与鞭毛化学共轭。最简单和最有效的方法之一是通过使用戊二醛。戊二醛是二价交联化合物，它将肽共价连接于鞭毛上，并且进一步固定鞭毛制剂。其他化学交联试剂或化学抗原衍生物例如二硝基氟苯都是有效的。这些抗原、半抗原或肽部分的共轭方法是本领域普通专业人员所熟知的。
连接于鞭毛上的抗原的量随具体应用而变化，并且这不是本发明的关键组成。优选的是，在鞭毛制剂中每个鞭毛蛋白单体有2-10个肽或半抗原单位就足够了。对于较大的蛋白质或者多糖抗原需要较少的倍数。
通过透析、离心或者任何其他的标准方法，纯化共轭的鞭毛制剂。然后将该物质再悬浮于盐水中，浓度约为100μg/ml。
该制剂在每支注射液1-100μg的低剂量则有效。在很多情况下，10μg的剂量产生令人满意的应答。可以通过任何常规的途径注射该物质，例如静脉内注射、皮下注射、肌内注射或者腹膜内注射。对于很多为疫苗使用目的，通常皮下或肌内途径是最常规的。
例如，与二硝基苯酚共轭的20μg的伤寒杆菌鞭毛注射液可导致对半抗原DNP的IgG抗体滴度特异性，IgG抗体滴度在注射后第一周末升高，并且能持续一年。
鞭毛和与鞭毛共轭的抗原部分的免疫应答的持久性是不同寻常的和出人意料的。这种物质不含在注射处形成局部抗原积存。在24小时内，大约90-95%注射剂量的鞭毛破碎并且排泌掉。该物质的一部分保留在局部***中胚中心较长时间。可以确信，在胚中心内这种抗原的存在引起了时间延长的抗体产生。
本发明有很多超出市售佐剂制剂的优点。它极少在注射部位产生感染，并且可以完全生物降解。这与油乳胶或矿物盐例如铝形成鲜明的对照。产生延长的免疫应答只需要很小剂量的抗原。抗体的有效部分是补体固定的IgG，它是抗疟疾、子孢子和其他重要感染的保护作用所需的类型。当用固定剂例如戊二醛制备时该产品特别稳定。它可以被冻干以及在室温下无限期地贮存。当用盐水再组成时，将其放入冰箱可以稳定几周，在室温下可以稳定几天。
与那些能在易感宿主中引起感染的活的减毒疫苗不同，这种疫苗制剂仅由聚合的蛋白质与微量多糖组成。
按照本发明制备的疫苗优选的剂量是5μg至500μg。任何疫苗的最佳剂量将取决于与鞭毛蛋白共轭的抗原和被接种的动物或人的免疫学条件。
本发明的疫苗还包括将该疫苗与佐剂一起施用，从而进一步提高免疫应答。可以与本发明的疫苗一起使用的优选的佐剂是嵌段共聚物，它含有建立于乙二胺引发剂上的亲水聚氧乙烯聚合物。然后将疏水聚氧丙烯聚合物加在亲水聚氧乙烯中嵌段。于是产生了具有下列通式的八嵌段共聚物：
其中：
由（C3H6O）组成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量约为5000-7000道尔顿;
a是一个数，即它使得由（C2H4O）代表的亲水部分构成该化合物总分子量的约10%-40%;
b是一个数，即它使得八嵌段共聚物的（C3H6O）部分构成该化合物的约60%-90%。
该共聚物的（C3H6O）部分可以高达该化合物的95%。该共聚物的（C2H4O）部分可以低至该化合物的5%。
优选的佐剂具有下式：
Figure 911052801_IMG11
其中a约等于5，b约等于32。
可以与本发明包括的疫苗一起使用的另一种共聚物具有下式结构：
HO（C2H4O）b（C3H6O）a（C2H4O）bH
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为2000-5500，该化合物总的分子量约为2300-5500。
优选的佐剂具有下式：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
另一种优选的佐剂具有下式：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
在碱性催化剂存在下，升高温度和压力，将环氧乙烷和环氧丙烷缩合到四官能度的乙二胺引发剂上，形成聚合物嵌段。在每一共聚物中，结合形成高分子链的单体单元在数量上有一些统计学变化，在每次制备中所给出的分子量是共聚物分子的近似平均重量。在US专利2674619和2979528中可以找到制备这些嵌段共聚物的进一步描述，这两篇专利引入本文作为参考14
所公开的poloxamers和poloxamines的分子量通常是通过羟基法测定的。聚醚链的末端基团是羟基。从分解测定的“OH数目”可以计算数均分子量，以mg  KOH/g样品表示。应该理解，多分散化合物的分子量的绝对值根据测定分子量所用的方法可以不同。因此，知道用何种方法测定的共聚物的分子量是重要的。本文所用的所有共聚物的分子量是通过羟基法测定的。当用另一种方法例如高效液相色谱法测定分子量时，得到略微不同的数值。
将本发明的疫苗与八嵌段共聚物混合，并且给人或动物施用。与本发明的疫苗一起施用的佐剂优选的量是约0.1mg-5.0mg，最优选的量是约0.5mg-2mg。
本发明佐剂的另一种具体例子是类脂A的各种衍生物。Takyama，K等人和Raetz.C.R.H的论文中描述了不同种类脂A的结构，这两篇文献都引入本文作为参考。15，16磷酰基类脂A比完全类脂A分子毒性更低，而对动物的毒性比完全类脂A更低。类脂IVA和类脂X是类脂A的生物合成前体。将作为本发明一部分的一些类脂A衍生物的结构表示在图10-13中。
新近的几篇报导暗示了IgG2a抗体具有抗几种病毒和细菌感染的保护作用。对IgG2b抗体的研究尚不完善;但是已有其具有保护性的报导。IgG1抗体亚类不固定补体，并且被认为在很多情况下具有相当低的保护效力。所以，可以预期，LPS衍生物能够将抗体应答转向IgG2同型，特别是当与共聚物混合时，从而增加疫苗的效力。
可用于本发明的抗原是那些引入哺乳动物中时将导致抗体形成的化合物。按照本发明可使用的典型的抗原包括（但不限于）天然的产物，重组体或者从病毒、细菌、真菌、寄生虫以及除自身免疫疾病、激素或者可用于蛋白水解或治疗疫苗的肿瘤抗原外，还有其他感染剂得到的合成产物，这些病毒或细菌产物可以是酶促裂解产生的生物体成分，或者可以是通过重组DNA技术产生的生物体成分，这是本领域普通专业人员所熟知的。下面是典型抗原的部分目录：
病毒
HIV
Rotavirus
脚与口腔疾病
流行性感冒
类流行性感冒
疱疹，单纯性疱疹，EB病毒
鸡痘，假性狂犬病
狂犬病
脊髓灰质炎
肝炎A
肝炎B
肝炎C
麻疹
瘟热
委内瑞拉马脑脊髓炎
Rota病毒
猫白血病病毒
呼吸道肠道病毒
呼吸Sycytial病毒
Lassa热病毒
多瘤肿瘤病毒
犬细小病毒
牛***瘤病毒
蜱产生的脑炎
牛疫
人鼻病毒
肠道病毒，Mengo病毒
副粘液病毒
鸟感染的支气管炎病毒
细菌
百日咳杆菌
流产杆菌（Brucella  abortis）
大肠杆菌（Escherichia  coli）
沙门菌种，伤寒杆菌
链球菌
霍乱
志贺菌
假单胞菌
结核
麻风
立克次体感染
洛矶山斑疹热
Thyphus
寄生虫
疟疾（恶性疟原虫（Plasmodium  falciparum），间日疟原虫（P.vivax），三日疟原虫（P.malariae））
血吸虫
锥虫
真菌
新型隐球菌（Cryptococcus  neoformans
亚单位重组蛋白
单纯性疱疹
EB病毒
肝炎B
假性狂犬病
黄热病毒，登山热，黄热病
淋病奈瑟菌（Neisseria  gonorrhoeae）
疟疾：子孢子周蛋白，裂殖子蛋白
锥虫表面抗原蛋白
百日咳
α病毒
腺病毒
蛋白质
白喉类毒素
破伤风类毒素
脑膜炎双球菌外膜蛋白（OMP）
链球菌M蛋白
肝炎B
流感血凝素
合成肽
疟疾
流感
脚与口腔疾病病毒
肝炎B，肝炎C
多糖
肝炎球菌多糖
流感嗜血杆菌
多核糖基-核糖醇磷酸酯（PRP）
脑膜炎双球菌
绿脓假单胞菌（Pseudomonas  aeruginosa）
肺炎杆菌（Klebsiella  pneumoniae）
寡糖
肺炎球菌
半抗原是那些当结合于致免疫载体并引入脊索动物中时将引起对半抗原具有特异性的抗体形成的化合物。典型的半抗原是类固醇例如***和皮质醇、低分子量肽、其他低分子量生物化合物、药物例如抗生素和化疗化合物、工业污染物、调味剂、食物添加剂和食物污染物，和/或它们的代谢产物或者衍生物。
除上述的本发明具体例子之外，二氧化硅悬浮液中加入某些共聚物提供了出人意料的该组合物佐剂活性的增加。
二氧化硅是已知的佐剂，但是因其毒性使应用受到限制，特别是纤维变性。通过将二氧化硅结合至油状赋形剂中可以降低这种毒性并且增加效力，该赋形剂可以含有或者不含有其他佐剂部分，例如表面活性共聚物或LPS。通过本发明降低了二氧化硅的剂量和毒性，同时提高了效力。优选的是，油乳胶含有油和二氧化硅颗粒，乳液含有40%-99%的油。优选的油是角鲨烷（Sigma化学公司，St.louis，MO）。除了油之外，可以任意地向油中加入去污剂或去污剂的混合物。可用于本发明的去污剂的例子是聚氧乙烯脱水山梨脱（Tween）和脱水山梨醇（Span）（Sigma化学公司，St.Louis，MO）。而共聚物例如PLURONIC
Figure 911052801_IMG12
L121经常是优选的。
由于疫苗佐剂的某些成分易于氧化，所以要加入抗氧剂如防腐剂。油赋形剂角鲨烯特别容易氧化。嵌段共聚物也会受到影响。很多抗氧剂可以购买到，它们能够被接受，以防止疫苗成分的氧化降解。已经发现，这些抗氧剂的例子，生育酚（维生素E）或生育酚衍生物，除了防止氧化之外，还能够提高疫苗的活性。已经发现，当抗氧剂与嵌段共聚物或者二氧化硅乳剂结合使用时，除了作为抗氧剂之外，对于增加免疫应答和降低局部炎症特别有效。因此，抗氧剂例如生育酚或生育酚衍生物与本文所述的佐剂和疫苗的混合物将作为本发明的一部分。
下面的具体例子将说明本发明用于提高生物体对小的半抗原的免疫应答。可以意识到，对于本领域的普通专业人员来说其他的例子将是显而易见的，并且本发明并非局限于这些具体的说明例子。
实施例1
使TY2菌侏的沙门氏伤寒菌生物体在能动性琼脂中生长。然后使生物体在20升trypticase大豆肉汤中接种，并在37℃孵育30小时至生长log相结束。此时加入甲醛杀死生物体而得0.3%的悬浮液。离心分离收集生物体。注意避免产生过分的剪切力。在振荡器中用力振荡20分钟，然后从生物体上移取鞭毛。能够不破坏生物体而产生剪切力折断鞭毛的其它混合设备及装置均符合要求。
通过差离心作用使鞭毛从细胞体上分离。用标准实验室离心机在2000rpm转速下离心移出细胞体。以30000rpm转速超速离心收集鞭毛。超速离心后鞭毛再次悬浮，再用超速离心机离心，将可溶性污染物质倾析掉。大的污染物质在透明的鞭毛小球底部形成黑斑。这些污染物质用物理方法除去或扔弃。由20升细菌培养物中得到的最终产物是大约100mg的纯鞭毛。
实施例2
在pH值大约2左右将鞭毛酸化12个小时得到鞭毛蛋白。这种处理是将鞭毛蛋白质离解成分子量大约为30000的鞭毛蛋白单体。这种单体在中性pH值放置至少24个小时后又变成聚合的鞭毛。
实施例3
戊二醛是一种二价交联化合物，其肽与鞭毛共价相连并进而固定了鞭毛的制制。这些将功能基团共轭连接到蛋白质上的方法对本领域普通技术人员来说是熟知的。其它化学交联试剂或抗原衍生物例如二硝基氟苯也是有效的。
实施例4
共轭鞭毛制剂是通过透析、离心或其它标准方法进行纯化的，将此物质再次在大约100μg/ml的盐水中悬浮。此制剂在每次注射1至100μg之间的低剂量范围内就有效。在许多情况下使用10μg的剂量能产生满意的应答。此制剂可通过任何常用途径进行注射：静脉内注射、皮下注射、肌内注射或腹膜内注射。皮下和肌内通常是接种很多疫苗的最方便的途径。
实施例5
Ra-LPS（Ra-detox）去毒作用按以下步骤完成：从大肠杆菌EH-100（10.0mg）中获得的Ra-LPS悬浮在5.0ml水中，声处理15分钟，在100℃孵育5分钟。孵育后将样品移开孵育箱，立刻向样品中加入三十分之一体积的三乙胺并混合均匀。将此样品在室温（22℃）放置4天。然后将样品冻干，用己烷萃取由此释放出的游离脂肪酸。剩余物组成Ra-detox。在0.1MHCl17中水解的样品的TLC分析表明MPL的形式已由六酰-五酰转移为五酰-四酰。被认为类脂A的3位置上，单个的3-羟基肉豆蔻酸释放出来，导至具有减少内毒素活性的占主导地位的五酰Ra-LPS的形成。18去毒的LPS可以从多种不同的其它LPS形式制备得到，包括（但不局限于）由S.minnesota R 60或S.typhimurium TV119得到的Ra-LPS以及由S.typhimurium SF1512得到的SR-LPS，并用作佐剂。
实施例6
用ELISA检定法测定直接对抗三硝基苯酚半抗原的抗体。这是对最初由Sanuders公开的方法的改进。19检定中使用一种蛋白蛋，牛血清白蛋白，水凝胶用以减少附着于塑性载体上的蛋白质的变性作用，并且蛋白质和表面活性剂的使用可减少能增加本底、减少灵敏性的蛋白质的非特殊吸附。用戊二醛将抗原连接到覆盖96孔的微滴平板的BSA上。洗脱未结合的戊二醛。加到平板上的抗原通过戊二醛的游离醛基与平板共价相连。
剩余醛基基团用赖氨酸阻隔，这样平板就制好备用了。平板用不同稀释度的抗血清孵育、洗涤，再用第二种抗体例如过氧化物酶共轭的山羊抗鼠IgG或其亚钢中的一员进行孵育和洗涤。将平板洗涤并加入基质（例如邻二胺基苯的过氧化物）。用Titertek  Multiscan光度计读出其波长492nm处的吸收率。抗体的滴度作为抗血清的稀释度计算，需要产生本底的1/3至1/2的最大值的光密度。通过同时将样品和参照抗血清进行比较使其标准化。这样作简化了不同日期测定的滴度的比较。抗体之间的相对亲合力可通过光密度对血清稀释度的曲线斜率的分析而进行估计。
用本领域的普通技术可发展相近似的ELISA检定，使其针对很多抗原包括蛋白质，肽和多糖。另外，加入第一种抗体后向ELISA孔中加入1-4摩尔硫氰酸胺能促进除去低亲合力抗体，从而提供一种更加定量的亲合力的测量方法。
实施例7
在下述实施例中，通过后足肉趾给老鼠服用25μg的鞭毛，每鞭毛与平均四个分子的TNP共轭。TNP共轭的鞭毛在0.5ml盐水中给药。TNP的抗体特性在施用TNP共轭鞭毛后的下列时间进行测定：8天，19天，30天，50天和90天。实验结果列于图1。可以看到即使90天后对TNP共轭鞭毛的免疫应答仍然明显很高。而对常规的TNP共轭体例如TNP共轭的鸡蛋白蛋白，其免疫应答时间就短得多，而且抗体的滴度低得多。往往在单独一次注射后，动物对可溶性蛋白质载体上的半抗原的可检测出的抗体完全没有反应。
实施例8
老鼠对剂量的反应通过施用不同剂量的TNP共轭鞭毛进行测定。每分子鞭毛（分子量大约是40000）与平均4个分子TNP共轭的鞭毛通过后足肉趾对老鼠给药。TNP共轭鞭毛在0.5ml盐水中给药。给老鼠服用下列浓度的TNP共轭鞭毛：4μg，10μg，25μg和50μg。服用TNP共轭鞭毛后8天和19天，测定产生的应答TNP共轭鞭毛的抗体，实验结果示于图2。
实施例9
老鼠对TNP共轭的鸡蛋白蛋白（HEA）的免疫应答和对TNP共轭的细菌鞭毛蛋白质的免疫应答的对比见图3。在此实验中，TNP对HEA的共轭与对鞭毛共轭方式一样使用活性三硝基苯磺酸的衍生物（TNBS）。通过老鼠的后足肉趾给老鼠服用100μgTNP共轭的HEA或25μgTNP共轭的鞭毛。服用TNP共轭蛋白质后10天，按照实施例6测定抗体的滴度，结果见图3。通过测定抗体滴度知TNP共轭鞭毛与TNP共轭HEA相比可导致大得多的免疫应答。应该注意，本实验中施用TNP-HEA的量是TNP共轭鞭毛量的4倍（100μgTNP-HEA对25μgTNP共轭鞭毛）。
实施例10
用实施例9中相同的制剂再加入1.0mgT150R1佐剂对老鼠给药。通过后足肉趾给老鼠施用100μgTNP共轭HEA或25μgTNP共轭鞭毛。施用TNP共轭蛋白质和佐剂后10天，按实施例6测定抗体滴度。这些实验结果汇集于图3。可以看到该佐剂提高了TNP共轭HEA和TNP共轭鞭毛的免疫性应答。然而TNP共轭鞭毛导致的免疫应答比TNP共轭HEA大得多。用锁眼
Figure 911052801_IMG13
血篮蛋白（KLH）代替HEA做相似的实验得到了相似的结果。作为载体、KLH比HEA更有效，但不如鞭毛效果好。
实施例11
因为嵌段共聚物佐剂是通过独特机理进行反应的，因此有可能将其加入更复杂配方中以优化它在特殊应用中的活性。TNP10-HEA是在水包油乳状液中与1.0mg具有下面分子式的表面活性共聚物配制的：
其中疏水基团（C3H6O）的分子量大致是4600，亲水基（C2H4O）的重量百分含量大约是10%。
表面活性共聚物在水包油乳状液中与TNP10-HEA和不同类脂A衍生物配制，包括从两个来源得到的Re-LPS和单磷酰基类脂A。另外，评价了两种类脂母体、类脂IVA和类脂X。LPS和两种类脂A制剂与单独使用三嵌段共聚物相比，其抗体应答显著增加。油（2%角鲨烷）和共聚物与干燥的三硝基苯共轭的鸡蛋白蛋白（TNP10-HEA）混合，接着在pH为7.4的PBS中与0.2% Tween-80搅抖均匀。将50μl制剂分开注入老鼠两只后足肉趾中，每只动物所用剂量为50μg抗原、0.6mgL141、0.1mgT150R1。粘性物与离子载体共聚物的结合作用所产生的抗体应答比单独使用两者之一有显著的增加。这些实验结果见图4及图5。
标记有MPL-TDM和TDM的棒形制剂可在市场上买到、由Ribi  Immunochemical（Hamilton，Montana）提供。这些佐剂的配制可参照佐剂的说明书。可在看到商业佐剂MPL-TDM和TDM与其它制剂相比，在老鼠身上只能引起最小值的应答，然而共聚物与类脂A衍生物的不同结合作用却引起意料之外的高抗体滴度。
实施例12
评价2%角鲨烷的水包油乳液中共聚物与冻干抗原的佐剂效果。油与共聚物与干燥TNP10-HEA混合、然后在pH为7.4的PBS中与0.2%Tween-80搅匀。将50μl制剂分开注入老鼠的两只后足肉趾中。每只动物的剂量是50μg抗原、0.6mg标示L141的三嵌段共聚物和1mg标示T150R1的共聚物。
标示L141的共聚物有如下结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分含量大约是10%。
标示T150R1的共聚物是离子载体，其具有下面的分子式：
Figure 911052801_IMG14
其中a大约为5，b大约为32。
实验结果见图5。可以看到三嵌段共聚物与反八嵌段共聚物的结合，给出了协同佐剂效果。
实施例13
在此实验中，在一只老鼠的两个足趾分开给老鼠施用50μl剂量的50μg冻干TNP10-HEA（每摩尔10.4TNP）。在与盐水乳化作用之前使干燥抗原与油混合。弗氏完全佐剂（FCA）试剂（Grand Island Biologicals）是由盐水中60%油构成，没有别的附加成份。其它所有制剂是60%油及50μlSpan-80，10μlTween-80及每剂量1.6μl乳状液中15mg二氧化硅（5μm Minusil）。使用时每只老鼠的剂量包含0.6mg浓度的三嵌段共聚物和0.1mg浓度的八嵌段共聚物。实验数据由每组5-15只老鼠的两组实验复合而成（见图6）。
标示L121三嵌段共聚物的分子式如下：
其中疏水基（C3H6O）的分子量大约是4000，亲水基团（C2H4O）的重量百分含量大约是10%。
标示L141的共聚物的分子式如下：
其中疏水基（C3H6O）的分子量大约为4600，亲水基团（C2H4O）的重量百分含量大约为10%。0.1mg标示T150R1的带有***聚物的八嵌段共聚物的分子式如下：
其中a约等于5，b约等于32。
除弗氏完全佐剂（FCA）以外，所有配方都含有二氧化硅作为主剂。可以看到含有共聚物的组合物都增加辅助活性并比FCA更为有效（见图6）。
油和二氧化硅的结合比单独使用油或二氧化硅更有效。60%油乳状物自己的平均滴度为100，二氧化硅自身的滴度小于20，当结合使用一次注射30天后，其滴度超过300。对于免疫鸡滑囊病病毒或免疫带各种蛋白抗原的兔子，使用二氧化硅本身或共聚物一同使用，其效果比单独使用油乳状物更好。最后，我们发现其它表面活性剂可代替Span和Tween，只要它们能产生稳定的乳状物。与由弗氏完全佐剂引起的剧烈慢性炎症反应相比，二氧化硅乳状液只产生温和的局部反应。另外，二氧化硅混合物不能引起自免疫佐剂关节炎。与最常用产生抗血清的佐剂弗氏完全佐剂相比，这是它的一个主要优点。
实施例14
将由5至10只老鼠组成的各组老鼠用含1mg每种图7表示的共聚物的2%水包角鲨烷乳状液中的TNP-HEA进行免疫。除L81只引起短暂的反应外，每组中抗体反应经历的时间相近。滴度的峰值大约在注射后一个月处并持续过三个月。免疫后90天时给动物加强注射，一周后再次给它们抽血。含10%或更少聚氧乙烯（POE）的共聚物都可引起强的免疫应答。共聚物L122是差的佐剂。含有一定范围POE链长和分子量为5200的聚氧丙烯链（POP）的共聚物（L180.5，L181.5和L182.5）的佐剂活性遵循先前一系列小共聚物L121，L122和L123建立的模式。再次发现含高于10%POE共聚物是无效佐剂。
每POP链长含10%或更少POE的共聚物促进平均滴度的程度随POP疏水基团分子量的增加而增加，见图7。尽管组与组之间不一样，但重复发现滴度随疏水基团分子量而增加的一般模式。
用标定级特异抗血清进行ELISA检测，在多个时间点测量抗体的同型，见图8。诱导抗体的有效佐剂共聚物制剂可诱导同型的完全不同模式。低分子量制剂，L101，诱导了带较少量的IgG2a和IgG2b的显著的IgGI应答。增加疏水基团分子量可增加IgG2，特别是IgG2b的比例。有趣的是IgG3同型的产生遵循相反的模式，由低分子量制剂L121尤其是L101产生高滴度。IgG1对IgG2b抗体的比例随疏水基团分子量增长的关系呈近似的线性关系，见图8。再在多个时间间隔测量同型的分布情况继续28天。由各个共聚物产生的同型模式在下步的检定中趋于不变。
实施例15
用50μg含1mg共聚物L141和/或100μg去毒的RaLPS水包角鲨烷乳状液中的TNP-HEA对各组老鼠进行免疫。
图13显示了当去毒的RaLPS和L141与TNP-HEA混合并给老鼠给药的协同反应。图14显示由各个佐剂结合物引起的IgG同型加上与毒性LPS的比较。30天后，测定几种内毒素衍生物和减少了毒性的成份的抗体同型。共聚物141本身主要产生IgG1同型抗体应答及较少量的IgG2a和IgG2b以及痕量IgG3。去毒的RaLPS减小对TNP-HEA的IgG1抗体的量而显著增加IgG2a和IgG2b抗体。在相似的实验中，无毒性S.SphaeroidesLPS不能明显增加IgG滴度的总量，但却能减少IgG1抗体的量而增加IgG2a和IgG2b量。其它无毒和去毒LPS衍生物既增加其滴度也使同型的平衡移向IgG2a和IgG2b。注射无任何佐剂的抗原不能产生可测抗体。
实施例16
将与单磷酰基类脂A结合的L141共聚物与二霉菌酸海藻糖酯进行比较。用50μg含所表明佐剂的水包油乳状液中的TNP-HEA使老鼠免疫。每剂量乳状液中含50μgMPL和/或TDM。在28天时从老鼠身上抽血。
与TDM-MPL结合相比，L141与MPL的结合作用可产生较高滴度。IgG2a亚纲的滴度是主要的，如图15所示，所有三种材料的结合产生了最高的IgG2滴度并明显添加了IgG3。
实施例17
人们一直认为来自革兰氏阴性细菌的脂多糖是有效的免疫调节剂和免疫佐剂。但这些材料的毒性却妨碍了它们作为佐剂的发展。最近报告了一种既减少它们的毒性同时又保持其实质佐剂活性的方法。此方法包括从类脂A中除去磷酸根基团而产生单磷酰基类脂A（MPL）。另外，从类脂A部分除去一个或多个脂肪酸链也可减少毒性。有些类型的LPS，尤其是从红假单胞球形菌（结构见图11）中得到的LPS，其本身无毒性。其结构与毒性类脂A非常类似。Rietchsel认为整个类脂A结构具有毒性，并证实许多修改可减少其毒性。
设计本实验以评价一系列LPS衍生物与非离子嵌段共聚表面活性剂结合作为佐剂的潜力。选择LPS衍生物来评价结构修饰谱，这种结构修饰用来评估减少毒性的几种方法和以同型及免疫应答强度来评估结构。用这些试剂自身和它们与嵌段共聚佐剂L141的结合来评估试剂间的协同作用，这种协同作用是通过独特机理实现的。
最后报导出6，6′-二霉菌酸海藻糖酯（TDM）是将抗原连接到油滴表面的粘着佐剂。研究结果比较了TDM与和LPS衍生物结合的嵌段共聚物的佐剂活性。
动物：
使用由Charles  River  Laboratories，Raleigh，NC处得到的几组7-10周大的雌鼠ICR（选系繁殖）。
抗原制剂：
将三硝基苯基（TNP）半抗原与重结晶的鸡蛋白蛋白（HEA）连接。在PH为8.221的硼酸盐缓冲液中用5mM三硝基苯磺酸盐使TNP与HEA共轭。用分光光度法在350nm处用15400消光系数侧定三硝基苯基化程度，每摩尔HEA连接有8-9个单位的TNP。
佐剂：
由stlouis，Mo的SigmaChemical Company购买从S.minnesotaR7中提取的Rd1-LPS，从鼠伤寒沙门氏菌SL684中提取的Rc-lps和从大肠杆菌EH-100中提取的Ra-LPS由Hamilton，MT的Ribi ImmunochemResearch，Inc购买从S.minnesota R595中提取的MPL;从西德Borstel的Institute für Experimentelle Biotogie undMedizin得到S.minnesotap345，S.minnesotaR60和鼠伤寒沙门氏菌SF1512培养基。由Statens Seruminstitut，DK-2300 Copenhogen，Denmark处得到大肠杆菌O9和O58的培养基。由New Haven，CT.的Genetic Stock Center，Department of Human Genetics，yale University School of Medicine处得到大肠杆菌D31m4的培养基。
对温度敏感的大肠杆菌MN7和鼠伤寒沙门氏菌i50突变体的生长以及类脂X和母体类脂IVA的制备已分别由Takayama，K.，等和Raetz，CRH，等描述过，将之所有引入作为参考。22，23大肠杆菌D31m4的生长和纯的Re-LPS的制备已由Qureshi，等进行了描述，在此引入作为参考。24参照Quireshi，N.，等的方法（引入作为参考）25由D31m4和Re-LPS制备MPL。这个产品包含一个六酰和少量的五酰MPL的混合物。
用经修改的Galanos，等的方法由S.minnesota R345，S.Minnesota R60，鼠伤寒沙门氏菌SF1512和球形红假单胞菌ATCC17023制备粗化学类型的脂多糖。26，27由最小（Re-LP5）到最大（SR-LPS）一系列粗化学类型的LPS结构见图10。球形红假单脆菌LPS的结构见图11。
大肠杆菌O9和O58在LB肉汤中生长，光滑的化学型脂多糖用Westphal和Jann的热苯酚-水萃取方法制备28。由大肠杆菌O9和O58得到的LPS产率分别是8.0和14.9%（干重量）。大肠杆菌O58LPS的O-抗原区域的结构确定如下：
[→3）GlcNAc-B（1→4）-Man-α（1→4）-Man-α（1→]n
（1→3）  2（3）
RhaLA  OAc
其中RhaLA是3-O-（R-1’-羧乙基）-L-鼠李糖（rhamnolactylic  acid）。
将O9LPS（100.7mg）溶解在2.0ml含0.6%脱氧胆酸，pH值为7.8的0.2M三盐酸中，并在37℃下用相同的缓冲液在2.8×54cm Bio-Gel P-100栓（Bio-Rad，Richmond，CA）柱上进行分馏。其过程与Vukajlovich等的方法相似，在此引为参考。29收集2ml各馏份分析其KDO和甘露糖。根据这些分析将馏份27-35（Ⅰ），36-43（Ⅱ）和44-51（Ⅲ）汇集起来并彻底地用流动的水渗析。最后这些样品在Bio-Gel P-4柱上脱盐而得43.5mg Ⅰ，27.2mgⅡ和6.6mgⅢ。三个样品用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳显示馏份Ⅰ主要含有光滑化学型LPS，馏份Ⅱ含有光滑和粗糙化学型LPS的混合物，馏份Ⅲ几乎只含有粗糙化学型LPS。这些结果与甘露糖对总的亚磷摩尔比相一致，即对于Ⅰ是9.2∶1.0，对于Ⅱ是5.3∶1.0，对于Ⅲ是2.9∶1.0。O9LPS的外核已糖区域显示出大肠杆菌R1类型，而内核对所有沙门氏菌和大肠杆菌均相同。O9LPS的O-抗原区域的结构确定为：
[→3）-Man-α（1→3）-Man-α（1→2）-Man-α（1→2）-Man-α（1→2）-Man-α（1→]12-14
由Dr.Kuni  Takayama，VA  Hospital，Madison，WI处获得类脂A母体和其衍生物（包括MPL）。由Ribi Immunochem Research，Inc.，Hamilton，MT处购卖MPL和MPL-TDM制剂。由CytRx Corporation，Atlanta，GA处获得非离子嵌段共聚物表面活性剂L141。它由分子量为4600道尔顿的中心聚合物聚氧丙烯（POP）和在两端带有平均分子量为500道尔顿的聚氧乙烯（POE）的亲水链组成。
免疫应答的激发作用：
将单独或结合的上述添加剂冻干，并并入含2%角鲨烷（hexamethyl tetracosane）的水包油乳状液中。对每只老鼠的最后浓度是50μgTNP-HEA，100μg LPS，50μg MPL和MPL-TDM，以及1mg共聚物L141。根据试验的特定小组给动物的后足肉趾进行皮下注射（40-50μl体积）含上述剂量的抗原和佐剂。用使血液不凝固的Natelson毛细管通过后眼窝血管丛在本研究过程内不同时间点对老鼠抽血，血浆在-70℃下保存。
抗体检测过程：
用Enzyme  Linked  Immunosorbant  Assay（ELISA）分析评价由各个制剂引起的免疫应答。使苦基磺酸与BSA馏份V反应制备抗原。在4℃下，用0.5μg/ml浓度PBS中的pH为8.4的TNP-BSA（每摩尔BSA含25个单位的TNP）将微滴平板处理过夜）。处理量为每孔100μlTNP-BSA。用pH为7.4，含1%BSA的PBS代替抗原溶液，并使平板在室温下孵育1小时，以阻隔任何对抗体非特异性连结可利用的位点。然后用pH7.4，含0.05%poloxamer188的PBS冲洗4次平板。然后加入100μl含0.1%BSA的试验血清的系列稀释剂和PH7.4，含0.1%  poloxamer188的PBS，并在轨道振荡器上（200rpm）于室温下孵育1小时。然后将平板洗三次，并在37℃用针对鼠IgG或特异IgG亚纲的亲合纯化辣根过氧化酶共轭的山羊抗体孵育90分钟。除对IgG3使用1∶1000稀释液外，其它组都使用共轭物的1∶2000稀释液。下一步是将平板洗三次，在PH5.0的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中，用0.4mg/ml邻苯二胺（OPD）HCl显色。在加入OPD后15分钟用2.5N硫酸终止反应，并用BIORAD型3550微板读数器在490nm处读出数据。滴度被定义为产生1.0吸收率所需的抗血清稀释度。下面公式计算协同作用：
LPS+L141的滴度/LPS或L141的滴度
结果：
图16表示在后足肉趾上用50μg含1mg共聚物L141加100μg一系列类脂A衍生物之一的2%水包角鲨烷乳状液中的TNP-HEA进行免疫的远系繁殖的ICR雌性老鼠各组的情况。最小的衍生物类脂X在所有时间范围内测量都抑制了免疫反应。其它每个衍生物在免疫作用10天后都产生了加速免疫应答，具较高滴度，但30天和60天时产生了中度的抑制免疫应答作用。
用从与核多糖大小不同的突变生物体中取得的LPS制剂进行相似的研究，见图17。注射后10天这些LPS衍生物产生了增长的抗体应答。最小的制剂，Re-LPS，在60天时抑制应答。其它衍生物产生中度的促进作用。最后评价了与共聚物L141结合的含不同量O-多糖的LPS各馏份的佐剂效果，见图18。这些制剂的每一个在整个测量期间持续产生快速增加的免疫应答。
表1总结了单独使用和与共聚物L141结合使用的每个LPS馏份和衍生物的观测结果。
表1 IPS/类脂A 存活 抗体滴 28天的 母体1来源 百分数2度3协同比
类脂X 大肠杆菌MN7 100 14，201±4，753 0.60
母体类脂IVA 鼠伤寒沙门氏菌i50 100 11,140±2,350 0.50
MPL 大肠杆菌D31m4 100 27,184±5,845 1.13
Re-LPS 大肠杆菌D31m4 100 14,985±2,695 0.62
RdI-LPS S.minnesota R7 83 52,925±15,799 2.20
Rc-LPS 鼠伤寒沙门氏菌SL684 66 50,518±13,555 2.10
Rb2-LPS S.minnesota R345 NA NA NA
Ra-LPS S.minnesota R60 16 72,169±0 3.00
Ra-LPS detox 大肠杆菌  EH-100 100 122,668±29,635 5.10
SR-LPS 鼠伤寒沙门氏菌  SF1512 0 NA NA
R-LPS 球形红假单脆菌ATCC17023 100 21,651±5,233 0.90
S-LPS-I5 大肠杆菌09 100 81,792±15,800 3.40
SR-LPS-II5 大肠杆菌09 50 103,443±14,291 4.30
R-LPS-III5 大肠杆菌09 66 50,518±10,219 2.10
S-LPA 大肠杆菌058 80 81,793±18,253 3.40‖
1、在材料和方法章节中描述的不同型式LPS和类脂A的结构。
S＝平滑;R＝粗糙
2、注射100μg含1.0mgL141和50μgTNP-HEA的水包角鲨烷乳状液中的LPS衍生物的动物的存活百分数。
3、用LPS加TNP-HEA的L141乳状液免疫的动物在28±SE天时对TNP的IgG抗体滴度。
4、协同比例是由LPS加L141引起的抗TNP抗体除以用L141而无LPS的相似乳状液引起的抗TNP抗体
5、从大肠杆菌09得到的LPS在Bio-Gel  P-100柱上分馏得到馏分Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ。
S＝光滑;R＝粗糙。
使表中的滴度标准化以有利于实验结果间的比较。计算协同比例以估价LPS制剂和衍生物对增加IgG抗体应答的相对能力，它们均超过作为佐剂单独使用的期望值。由存活率判断出含LPS的免疫原的毒性明显地不同。存活率小于100%的制剂通常产生挠发及其它引起痛苦的内毒素标志。然而有几种制剂不产生死亡，极少产生临床毒性标志。这些制剂包括单磷酰基类脂A，类脂A衍生物，类脂X，类脂IVA，去毒的Ra和球形红假单脆菌LPS。这些制剂增加抗体应答的能力方面（超过单独使用共聚物L141或LPS制剂的应答）在使用LPS制剂中明显是各不相同的。一些制剂抑制免疫应答而其它制剂则几乎没有效果。然而那些确实增加抗体滴度的制剂增加免疫应答并在观察期间持续超过三个月。特别成功的制剂是去毒的Ra-LPS衍生物，它自身是一弱的佐剂，但与共聚物L141结合时能显著增加滴度（见图3）。
抗体同型：
对几种去毒衍生物和减小毒性的馏份测定抗体的同型（图13和14）。正如预料的那样，共聚物L141自身主要产生IgG1同型抗体应答，及较少量的IgG2a和2b，以及痕量的IgG3。注射无佐剂抗原不产生可检测出的抗体。在产生IgG1抗体方面，LPS衍生物具有不同的效果，实质结果是主要产生IgG2反应。即使使用不产生促进抗体滴度的制剂，也可出现同型由IgG1向IgG2a和b的偏移。
实施例18
动物：
由charles  River  Breeding  Lakoratories（Raleigh，N.C.）处得到6周大的雌性远系繁殖ICR白鼠，并在免疫前使其在动物笼内适应一周，随意喂水和食物。
共聚物和其它试剂：
由CytRx Corporation，Norcross，GA处获的协同嵌段共聚物L121，L141L180.5;由Syntex Corporation（Palo Alto、CA）处得到胞壁酰二肽（MDP）的苏氨酰衍生物;以及从Dr.KuniTakayama，VA Hospital（Makison，Wi）处得到球形红假单胞菌。
症疾肽和肽共轭：
用430A型肽合成仪（Applied  Biosystems，Inc.）在Microchemistry  Facility  of  Emory  University（Atlanta，GA）合成肽（NAGG）5，纯度用氨基酸分析和HPLC确定。（NAGG）5是猕猴疟原虫N1H菌株的子孢子的环子孢子蛋白质中的一个串联重复。用改进的1984年Rougon等人的一步戊二醛偶联法将肽（P）共轭到牛血清白蛋白（BSA）或鸡蛋白蛋白（HEA）（sigma chemical Co.，st Lou-is，Mo）上。主要是将4×10-6摩尔溶解在PH8.7的0.8mlPBS中的肽与1.5×10-7摩尔在PH8.7的1.2mlPBS中的BSA或HEA混合。室温下超过15分钟以每等份0.05ml的量将2ml0.02M戊二醛溶液（Sigma chemical Co.，St.Louis，Mo）加到混合物中，每次添加之间搅拌成漩涡。温室下将混合物在轨道振荡器上旋转过液（150rpm）。用PH7.3的PBS将混合物通过Sephadex G-25柱将未结合的戊二醛和肽除去。在空容器中收集P-BSA或P-HEA并在-20℃保存。
抗体滴度和同型定量的ELISA分析：
用改进的Saunders法30得到针对该肽的抗体滴度。按0.1ml/每孔的标准用0.002mg/ml浓度的与PH7.3的PBS中鸡蛋白蛋白（P-HEA）共轭的肽溶液涂覆96孔微滴平板（Flow Laboratories，Mclean，VA）于4℃下过夜。其它进一步的孵育都在室温下进行。用0.1mlpH7.3PBS中的1%人白蛋白溶液（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）阻塞抗原涂覆的孔一小时。用含0.05%表面活性剂PLURONIC F68（Poloxamer 188）的PH7.3的PBS洗涤后，用相同方式向孔中加入0.1ml从免疫老鼠身上取出的血浆的一系列三倍稀释液。并同样加入从未免疫老鼠身上取出的血浆的三倍稀释液和针对肽，（NAGG）5的单克隆抗体，分别作为ELISA的阴性和阳性空白实验。在轨道振荡器（200rpm）上使平板孵育1小时。洗涤后，向各孔中加入0.1ml以1∶2000稀释的过氧化酶共轭的山羊抗鼠IgG，IgG1，IgG2a或IgG2b或以1∶1000稀释的抗IgG3（Fisher Biotech，Orangeburg，NY），并以200rpm转速孵育11/2小时。重新洗涤后，向各孔中加入0.1ml2.5mg/ml邻苯二胺（Sigma  chemical  Co.，st  Louis，Mo.）和0.03%PH5.0的柠蒙酸盐缓冲液的过氧化氢（Sigma  chemical  Co.，St  Louis，Mo.），孵育15分钟，用2.5M硫酸中止显色反应。用Biokad  Microplate读数器测定在490nm处的吸收率，用回归分析测定滴度（使用稀释液使吸收率为1）。借助标准曲线，通过使ELISA滴度转变为各个亚纲每毫升血浆毫微克来做同型定量分析。用10微克/ml浓度的稀释度在PH7.3PBS中的多克隆山羊抗鼠IgG（Fisher  Biotech，Orangeburg，NY）涂覆在96孔微滴平板的孔中。洗涤，阻塞，孵育次数与上述ELISA分析相同。每种同型的老鼠骨髓瘤蛋白质（Sigma  Chemical  Co.，St  Louis，Mo.）的稀释物作为标准使用。在119ng-0.03ng浓度，用山羊抗鼠同型特异性马萝葡过氧化酶共轭物（Fisher  Biotech，Orangeburg，NY）测量标准吸收率。用回归分析根据吸收率（490nm）对浓度的标准曲线测定吸收率为1的同型特异标准物的浓度。吸收率为1时的肽特异性同型的浓度乘上吸收率为1小时的ELISA滴度，得到的浓度以ng/ml表示。
鞭毛制剂：
在美国典型培养物收集中心获得沙门氏伤寒菌株TYZ（type29）。使储备培养基在Tryptic  Soy  Agar平板（Difco  Laboratories，Detroit，MI）上生长，并在0.3%Tryptic  Soy  Motility  Agar中过4-5遍。选择游动性好的细菌，因为它们能提供最多的鞭毛。生物体在tryptic大豆肉汤中接种并在37℃孵育6小时。将细菌的肉汤悬浮液分等份接种到Mueller  Hinton  Agar平板（Carr  Scarlborou  gh）上并在37℃孵育16小时，用含0.1%乙基汞硫代水杨酸钠（sigma  chemical  Co.，St  Louis，Mo）的PBS收集平板上的细胞。在机械振荡器上（Red Devil Paint S haker）剧烈振荡20分钟使鞭毛离开细胞，并按以下方式通过差离心作用使鞭毛与细胞体分开：用带有GSA旋翼的Sorvall Rc-5B冷冻超速离心机（Dupont Instruments）以6000×9转速离心30分钟，将细胞体团成小球。然后以16000×9离心10分钟将破裂的细胞和其它小碎片也团成球。然后在带有SW27旋转捅式旋翼BeckmanL8-70M超速离心机中以90000×9将鞭毛团成球，再悬浮于乙基汞硫代水杨酸钠-PBS中。然后再悬浮于乙基汞硫代水杨酸钠-PBS中。用lowry′s蛋白质测定法测定蛋白质浓度。31按5.2mg/ml将鞭毛分等分于-70℃下冷冻。
鞭毛共轭作用：
应用Liang等32的二步骤戊二醛偶联法将多肽与沙门氏鞭毛（P-flagella）共轭。用等体积0.02M戊二醛处理溶解在1.2mlPH8.7的PBS中的肽（1.5×10-7摩尔），以0.05ml的量分等分加入并在加入过程之间搅拌成漩涡。在轨道振荡器上、于室温下旋转过夜（150rpm）。在4℃下用PBS渗析过夜，移去未反应的戊二醛之后，按肽对鞭毛的摩尔比为26∶1，13∶1和6.5∶1，将0.8mlPBS（PH8.7）中的4×10-6，2×10-6，1×10-6摩尔肽分别加入到渗析的鞭毛中，混合物在室温下旋转过夜。用带SW27旋转桶式旋翼的BechmanL8-70M超速离心器以90000×9超速离心1小时，将未反应的肽从鞭毛中分离出来。将鞭毛球重新悬浮于PH7.3的PBS中，再离心，再悬浮于PBS中，然后加入0.02M赖氨酸（Sigma Chemical Co.，St Louis，Mo.）。4℃下反应过夜，然后再离心，再悬浮于2ml的PBS中。
乳液和免疫作用模式：
用含2%角鲨烷（Sigma Chemcical Co.St Louis，Mo）与含0.2%Tween-80（Sigma Chemical Co.，St Louis.）PH7.2PBS混合物的水包油乳状液使5-8只老鼠的各组进行免疫。若存在的话，共聚物佐剂L121或L141其浓度是1mg/0.04ml，球形红假单胞菌LPS的浓度是0.1mg/0.04ml冻干肽或PBSA的浓度是0.1mg/0.04ml或P-鞭毛浓度是0.05mg/0.05ml。除一个实验中PBSA是0.05ml外，其余乳状液的制备均用相同浓度。用机动研杵在2ml玻璃均化器中将冻干抗原与角鲨烷和共聚物混合2分钟。除一个实验是将P-BSA或P-鞭毛不经冻干而加入PBS加到水相外，其它所有实验都是将水相和其余佐剂加入到油相，然后再乳化2分钟。或者是将0.04ml含0.1mgP-BSA的乳状液注射到一只后足肉趾中，或者是将0.025mlP-BSA或P-鞭毛（0.05mg/ml）注入每个后足肉趾中。在一个比较免疫途径的实验中，将0.1mg在0.04ml有或没有L121或L141的水包角鲨烷乳状液中的P-BSA注射入一只后足肉趾中（FP）或0.2mlIP或SC乳状液中的0.1mgP-BSA注射入一只后足肉趾（FP）中。29天时，用相同量的相同配方，水包油乳状液中的抗原和L121或者PBS中的抗原对所有的老鼠进行第二次免疫。在一项实验中，三组老鼠用含L121的水包油乳状液中的P-BSA进行第三次免疫，在初次免疫后的0，10，28和36天对大多数组的老鼠从后眼窝血管丛（retro orbital plexis）抽血到血液不凝固试管中。实验过程中，在初次免疫后10，28，60，90，97，111，141，171，201，207和214收集血浆，分别用ELISA分析从各个老鼠身上取得的血浆，并测定每组的平均和标准误差。
实施例19
用0.1mg有或没有共聚物和/或球形红假单胞菌LPS（每只老鼠0.1mg）的2%水包角鲨烷乳化液中的肽或肽-BSA对每组8只老鼠进行免疫。一个月后对所有的老鼠进行第二次免疫并在一周后收集血浆。根据上文描述的方法分析肽特异性总IgG和IgG同型。总的IgG抗体滴度以每组平均值±SEM列出。结果总结于表2。
表2
           滴度                             同型（％）IgG       IgG1        IgG2a       IgG2b       IgG3
肽 33 100 0 0 0
肽BSA 2205±1732 99.3 0 0.7 0
+R.sph-LPS 7529±1996 96.8 0.1 2.5 6.6
+L121 17420±3156 83.4 2.4 12.4 1.8
+L141 17641±7527 86.2 9.1 4.6 0
+L121+LPS 13105±2384 66.2 8.0 24.7 0.2
+L141+LPS 48435±3283 51.4 6.8 39.1 2.8
疟疾肽本身产生100%IgG1，但几乎检测不出免疫应答。与BSA共轭的肽产生几乎2log更高的IgG应答，几乎全是IgG1，并有少于1%的IgG2b。肽-BSA中加入LPS使总的IgG增加3.4倍，大部分是IgG1，并有2.5%的IgG2b和几乎没有可测水平的的IgG2a和IgG3。肽-BSA中加入两种共聚物中的一种可使总IgG的增加超过7倍并产生相当量的IgG2b和IgG2a。加入L121，可产生少量的IgG3。
当将L121和肽-BSA加入到LPS中时，尽管总的IgG滴度比没有LPS时稍低，但IGg2b的比例近乎加倍，并且IgG2a增长至总IgG量的8%。L141和LPS有协同作用，既使总IgG滴度增加近3倍也在影响亚纲分布上有协同作用。与单独使用L141相比IgG2b比例的增长超过了8倍，达到超过总IgG量的39%。并出现相当量的IgG2a，并且这种佐剂结合产生了2.8%比例的IgG3。
实施例20
IgG同型分布上半抗原密度效应：
使用有L121的干燥制剂测定每个鞭毛蛋白单体肽的不同摩尔比的效果。在两个后足肉趾上用含0.05mg肽-鞭毛（摩尔比为26∶1，13∶1和6.5∶1）的乳状液使各组老鼠免疫。一个月时用溶解在盐水中具有相同半抗原密度的肽-鞭毛加强注射老鼠。一周后收集血浆并分析肽特异性IgG同型的浓度。
改变肽对鞭毛的摩尔比会影响IgG抗体应答的强度和同型的分布（图19）。摩尔比由6.5∶1增加到26∶1可使总IgG浓度增加6倍，并使同型类型产生很大的改变。具有26∶1肽比的鞭毛可产生11%IgG1，43%IgG2a，17%IgG2b和29%IgG3。
减少肽比至13∶1几乎专影响IgG3，使其比例减少至4%。比例降至6.5∶1，消除IgG1和IgG3并减少IgG2a的浓度。
实施例21
动物：
将由Charles River Laboratories得到的7-10周大的雌性ICR（远系繁殖）老鼠作为实验用动物;所有共聚物由CytRx Corporation，Atlanta，GA处获得;TNP-HEA（Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo）根据Methods in Immunology33中的方法配制。
乳状液制剂：
乳状液是1ml最终体积和0.04ml注射体积。加入TNP-HEA（冻干）的标示量0.05mg/老鼠，加入2%角鲨烷盐水，加入标示量1.0mg/老鼠的共聚物。将混合物均化2分钟。有PBS/Tween80（0.2%）补足量至1ml，室温下均化大约2分钟。
注射：
在后足肉趾上给老鼠进行初次皮下注射（0.04ml），以一定抗原十共聚物的各种情况，在90天时对老鼠加强注射。
足肉趾测量：
在注射前测量基数，在注射后在特定时间点进行测量直到发炎退去。
血的收集：
在整个实验过程中在特定时间点收集用于血浆抗体检测的血液。通过后眼窝血管丛用血液不凝固Natelson试管收集。在2500rpm下将样品离心15分钟。血清在-70℃下保存。
表3
共聚物  MWPOP%POE   IgG抗体    滴度28天      97天
L101 =3250 =10 24875±8751 267919±82631
L121 ≈4000 ≈10 11828±4407 209891±120490
L122 =4000 =20 184±45
L141 ≈4600 ≈10 112431±22728 510272±125563
L180.5 =5200 =5 307863±66575 360072±77470
L181.5 =5200 =15 6715±1604 152367±33649
P182.5 =5200 =25 1500
用含1mg每种共聚物的2%水包角鲨烷乳液中的TNP-HEA对每组5-10只老鼠免疫，见表3。每组中抗体应答时间过程相似、滴度峰大约在注射后一个月并持续几个月。三个月后对老鼠加强注射。一周后再次抽血。含10%聚氧乙烯，而聚氧丙烯分子量等于或小于4600的共聚物导致很强的免疫应答。仅当含小比例聚氧乙烯，分子量为5200的聚氧丙烯的大制剂是有效的佐剂。含有较大比例聚氧乙烯的制剂效果要小得多。
实施例22
下面实验是将本发明配方之一与现有技术佐剂进行比较。配方具有下面一般组成：
Figure 911052801_IMG17
首先将二氧化硅与共聚物结合并充分混合使二氧化硅完全涂覆在共聚物上，然后加入Span80和角鲨烷，并用磁子搅拌混合大约45分钟，制备含50%水的油包水乳状液使抗原悬浮于水中。
本实验中所用其它佐剂包括由Ribi Immunochem Research.Inc.Hamilton MT得到的RAS;由Alpha-Beta Technology，Inc.Worcester，MA处得到的ADJUVAXTM;以及由Sigma chemical Co.st.Louis，Mo.得到的弗氏完全佐剂。所用佐剂的配制均参照厂家说明并按其指示施用。
用肽蛋白质共轭物（释放牛血清白蛋白激素的黄体化激素，LHRH-BSA）对各组雌性新西兰白兔（N＝4）进行免疫，如下：
Figure 911052801_IMG18
图20表示出每种佐剂在14，28，42，和56天时的抗BSA抗体滴度。由图20可看出在第56天时，本发明的配方产生的滴度是Freund’s完全佐剂的3-4倍。而本发明配方注射体积只是freund’s佐剂的五分之一。而且本发明配方毒性比freund’s完全佐剂明显小得多。其它方面，本发明配方引起的免疫应答至少等于或大于Freund’s。
实施例23
共聚物L180.5具有出人意料的物理性质，使其在无油的情况下是一有效的佐剂。在室温下此共聚物是不溶的，但在冷却温度（≈4℃）时是可溶的。与小分子佐剂L101，L121和L141不同，此不溶形式在室温下是一小颗粒稳定悬浮体。小共聚物都形成不稳定悬浮体，它们结成大的不定形块。这样的制剂是不好的疫苗佐剂。下面的例子证实了共聚物180.5自身以及无油时与去毒的Ra-LPS结合作为佐剂的能力。将0.1mlTNP10-HEA（25mg/ml）与0.4ml共聚物L180.5（125mg/ml）混合。将混合物放入冰箱中直到共聚物形成溶液。然后将其移出并缓慢升至室温以有利于抗原与共聚物颗粒连接。除加入适量去毒的Ra-LPS外，按相同方法制备相似制剂。用50μgTNP10-HEA，1mg共聚物180.5，及10μgLPS从后足肉趾对6只老鼠的各组进行免疫。18天时使某些组老鼠按相似方法加强注射。在24天和72天时抽血进行抗体测定。结果总结于表4。
表4 IgG抗体滴度
佐剂(Adjuvant) 24天 ±SE 72天 ±SE
L180.5 184 ±80 462 ±288
L180.5加强注射 1155 ±255 577 ±274
LPS 387 ±18 413 ±158
L180.5+LPS 80136 ±19207 51869 ±18571
None ＜20 ＜20
无油共聚物产生持续的和中度的一级和二级抗体应答。在LPS存在下，共聚物使动物出现非常强的二级抗体应答。没有佐剂下进行相似的抗原注射没有产生可测的一级应答只产生很弱的二级应答。
实施例24
在另外一个实验中将动物用含佐剂的107全灭活的鼠疟疾（plasmodium yoelii）嗜血期寄生虫免疫，这些佐剂或只含1mg共聚物L180.5或是与去毒的10μgRa-LPS结合的0.1mg共聚物L180.5或是含1mg共聚物L180.5的水包角鲨烷乳状液或是含1mg与10μg去毒的Ra-LPS结合的共聚物L180.5的水包角鲨烷乳状液。在加入0.5%Tween80盐水之前在均化器中使角鲨烷共聚物，LPS和抗原结合形成水包油乳状液。在35天时对动物加强注射并在第70天时用104毒性嗜血期疟原虫生物体攻击动物。对照动物和用Freund’s完全佐剂的抗原免疫的老鼠被疟疾感染。而用上述四种含或不含LPS的L180.5佐剂中的抗原进行免疫的动物得到了保护。“被保护”定义为寄生物血在血红细胞中占不到10%，并在感染的第14天下降。
保护与寄生虫表面的表位IgG2a同型抗体有关。研究结果证明对于疟疾而言使用含有或不含有油或LPS共聚物的佐剂都可引起保护性免疫应答，并比Freund’s完全佐剂更有效。它们也导致高的抗体滴度。
实施例25
用人体免疫缺乏病毒的重组蛋白质（Gp120 of HIV）进行实验。老鼠用25μg水包角鲨烷中的Gp120或无油配方的1mg（有或没有10μg去毒RaLPS）共聚物L180.5进行免疫。在加入0.5% Tween80盐水之前在均化器中使角鲨烷、共聚物，LPS和抗原结合，形成水包油乳状液。所有动物组在第28天时作一次加强注射。表5显示了在第42天HIV蛋白质的滴度：
表5 对HIVGp120的IgG滴度
佐剂 42天 ±SE
O/WL180.6O/WL180.6+LPSL180.5L180.5+LPSnone 6767638187023264294217 3689182263100213952216
实施例26
制备两种RaLPS制剂。一种用硼酸盐处理30分钟去毒。另一种用硼酸盐处理7小时去毒。6只雌性ICR鼠的各组用各50μgRaLPS免疫，该RaLPS系在含50μgTNP10HEA，1mg共聚L141，5mg角鲨烷（悬浮于0.5%Tween80盐水中）的油、水乳液中、在加入0.5%Tween 80盐水前在一均化器中使角鲨烷、共聚物，LPS和抗原结合，形成水包油乳状液。注射体积是每只老鼠50μl。在间隔一定时间对动物抽血用ELISA方法测定IgG抗体滴度。如图21所示，LPS温和去毒制剂导致较高的早期应答，而更深度去毒制剂适中地增加了早期应答，但与部分去毒LPS制剂和全毒性的LPS制剂相比它持续时间长。这些结果与从前用MPL和其它不带核多糖的LPS制剂（同无LPS乳剂相比它们早期增加滴度而晚期抑制滴度）的研究形成鲜明对照。
实施例27
用与实施例26相同的配方，用0.1、0.05，0.025和0.01μg剂量的温和去毒和深度去毒的RaLPS对动物进行免疫。在第28天时，对动物抽血进行IgG同型测定。如图22所示，两种制剂的所有剂量都增加了全部同型。IgG2a增加决定于温和去毒的RaLPS的剂量。IgG2b的增加不完全决定于剂量，而相对来说在实验范围中IgG1不取决于剂量。出人意料的是，深度去毒的RaLPS高剂量产生的同型模式变化比得上部分去毒的RaLPS低剂量所产生的同型模式的变化。这证明可通过改变LPS的剂量或去毒程度来控制和优化特殊应用中的同型变换。
实施例28
用实验测定本身具有低毒性的从假单孢菌中提取的LPS的佐剂活性。这种低毒性是根据已报导的事实，即从假单孢菌中提取的LPS只含有5个具有10碳链长的脂肪酸。用标准方法将LPS从假单孢菌绿脓杆菌中离析出来。如前面所述用TEA处理将LPS样品去毒。用50μgLPS，50μgTNP10HEA，1mg共聚物L141，5mg角鲨烷（悬浮在0.5%的Tween80盐水中），或没有L141或没有LPS的相似乳状液对6只ICR雌性鼠的各组进行免疫，如图23所示。在加入0.5%Tween80盐水溶液之前在一均化器中使角鲨烷、共聚物，LPS和抗体结合形成水包油乳状液。LPS本身是一弱的佐剂，但与L141结合时却产生很强的协同作用，对IgG2a和IgG2b尤其如此。其作用与实施例27中温和去毒的RaLPS相似。去毒的假单胞菌LPS的作用与实施例27中深度去毒的RaLPS的作用相似。
实施例29
从自身具有中等毒性的胶质红假单胞菌提纯出LPS。将6只TCR雌鼠的各组用50μgLPS，50μgTNP10HEA，1mg共聚物L121，L141，L180.5，5mg角鲨烷（悬浮于0.5%Tween80盐水中）进行免疫。在加入0.5%Tween80盐水之前在均化器中使角鲨烷、共聚物，LPS和抗原结合形成水包油乳状液。如图24所示，共聚物L121和L180.5引起的免疫应答与L141相似。胶质红假单胞菌LPS与每种共聚物结合都可大大增加IgG2a和IgG2b同型，但只很少或不增长IgG1。而且共聚物L180.5是最有效的。
实施例30
5只Rhesus猴子各组用与白喉类毒素共轭的合成肽（NAGG）5，共聚物180.5和去毒RaLPS组成的抗子孢子疟疾疫苗免疫。在加入0.5%Tween80盐水之前在均化器中使角鲨烷、共聚物、LPS和抗原结合形成水包油乳状液。在两周时间间隔内给动物进行三次皮下注射，每次剂量是2%水包角鲨烷乳状液中的100μg肽共轭物，100μgRaLPS，5mg共聚物L180.5。所有动物都出现高IgG抗体滴度（由ELISA测定1∶500稀释度的OD大约是3）。对子孢子表面抗原决定基的免疫荧光法测定抗体滴度证实，平均IgG抗体滴度为100000。在免疫后两周，未测到免疫部位局部反应，也没有全身性中毒的迹象。
应该清楚，前文叙述只涉及了本发明中优选的具体实施例。在不偏离后面权利要求中本发明范围和精神的条件下，可提出很多修改和变化。
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30Saunders，supra
31Lowry，O.H.，et al.，“Protein measurement with the folin phenol reagent”，J.Biol.Chem..，Vol.193，pgs.265-275（1951）
32Liang et al.，“Oral Administration of Cholera Toxin-Sedai Virus Conjugate Potentiates Gut.and Respiratory Immunity Against Sendai Virus”，J.Immunol.，Vol.141，No.5，pgs.1495-1501（1988）
33Justine S.G.，et al.，supra

Claims (30)

1、一种疫苗佐剂，含有具有下式结构的表面活性共聚物：
其中疏水基(C3H6O)的分子量约为4500-9000，亲水基(C2H4O)的重量百分数约为3%-15%。
2、权利要求1的疫苗佐剂，其中所述表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为5%。
3、权利要求1的疫苗佐剂，其中所述表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为15%。
4、权利要求1的疫苗佐剂，其中所述表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
5、含有无毒脂多糖的疫苗佐剂。
6、权利要求5的疫苗佐剂，其中无毒脂多糖是分子的糖部份保持完整，而分子的类脂A部分被改性，因而是具有很低毒性的脂多糖。
7、权利要求5的疫苗佐剂，其中脂多糖是红假单胞菌种（Rhodopseudomonas  Species）分离出的。
8、权利要求7的疫苗佐剂，其中红假单胞菌种选自由球形红假单胞菌（R.sphaeroides）、嗜酸红假单胞菌（R.acidophilia）、胚素红假单胞菌（R.blastica）、胶质红假单胞菌（R.gelatinosa）、荚膜红假单胞菌（R.capsulate）、池沼红假单胞菌（R.palustris）和绿霉红假单胞菌（R.Viridis）组成的一组中。
9、权利要求5的疫苗佐剂、其中无毒脂多糖是去毒脂多糖。
10、一种疫苗佐剂，含有有效量的脂多糖和有效量的表面活性共聚物、该表面活性共聚物具有如下结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。
11、权利要求10的疫苗佐剂，其中脂多糖是无毒脂多糖。
12、权利要求11的疫苗佐剂，其中无毒脂多糖是分子的糖部分保持完整而分子的类脂A部分已被化学改性、从而具有非常低毒性的脂多糖。
13、权利要求11的疫苗佐剂，其中无毒脂多糖是从红假单胞菌种分离出的。
14、权利要求13的疫苗佐剂，其中红假单胞菌选自由球形红假单胞菌（R.sphaeroides）、嗜酸红假单胞菌（R.acidophilia）、胚素红假单胞菌（R.b  lastica）、胶原红假单胞菌（R.gelatinosa）、荚膜红假单胞菌（R.capsulata）、池沼红假单胞菌（R.palustris）和绿霉红假单胞菌（R.Viridis）组成的一组。
15、权利要求10的疫苗佐剂，其中无毒脂多糖是去毒脂多糖。
16、权利要求10的疫苗佐剂，其中表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为5%。
17、权利要求10的疫苗佐剂，其中表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为5200，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为15%。
18、权利要求10的疫苗佐剂，其中表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
19、权利要求10的疫苗佐剂，其中表面活性共聚物具有下式：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
20、权利要求10的疫苗佐剂，其中表面活性共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3250，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
21、一种佐剂，含有：
a、油
b、适于形成油包水乳剂的非离子表面活性剂
c、二氧化硅
d、表面活性共聚物，含有
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。
22、权利要求21的佐剂，其中油是动物油。
23、权利要求22的佐剂，其中动物油是角鲨烷。
24、权利要求21的佐剂，其中非离子表面活性剂是一油酸脱水山梨醇酯。
25、权利要求21的佐剂，其中共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
26、一种提高人或动物对抗原免疫应答的方法，包括以下步骤：
a、将该抗原与佐剂混合，佐剂含有：
ⅰ、油
ⅱ、适于形成油包水乳剂的非离子表面活性剂
ⅲ、二氧化硅
ⅳ、表面活性共聚物，含有
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为3000-9000，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为3%-15%。
b、给人或动物施用该抗原和佐剂的混合物。
27、权利要求26的方法，其中油是动物油。
28、权利要求27的方法，其中动物油是角鲨烷。
29、权利要求26的方法，其中非离子表面活性剂是一油酸脱水山梨醇酯。
30、权利要求26的方法，其中共聚物具有下式结构：
其中疏水基（C3H6O）的分子量约为4600，亲水基（C2H4O）的重量百分数约为10%。
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