CN105999415A - 一种跨尺度血管及其3d打印方法 - Google Patents

一种跨尺度血管及其3d打印方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种跨尺度血管，由内至外依次包括：内衬层，以中空纤维形式螺旋卷绕而成的内管壁，以中空纤维形式螺旋卷绕而成的外管壁。本发明还公开了一种跨尺度血管的3D打印方法，包括利用含有平滑肌细胞的内层打印材料进行3D打印，以中空纤维形式螺旋卷绕形成内管壁；利用含有成纤维细胞的外层打印材料进行3D打印，以中空纤维形式螺旋卷绕在内管壁上形成外管壁；对内、外管壁进行固化处理，再利用含有血管内皮细胞的内衬材料在内管壁里面形成内衬层。本发明打印的血管结构不仅包含三层血管细胞，而且具有宏‑微两级流道，有利于细胞的后续培养和化学力学刺激的研究。

Description

一种跨尺度血管及其3D打印方法
技术领域
本发明属于生物制造技术领域，尤其是涉及一种跨尺度血管结构及其3D打印方法。
背景技术
我国心血管病发病的危险因素持续增长，心血管病发病率和死亡率居高不下，心血管病负担日益加重，成为重要公共卫生问题。目前心血管疾病的致病机理探讨主要围绕动物模型试验及二维细胞培养实验展开。构建三维血管细胞模型便于更真实的模拟体内环境，可加速心血管致病机理探讨研究的速度。
通过细胞三维集群来模拟真实的器官结构，目前有两种方法，其一是利用传统组织工程思路，打印支架然后在支架内培养细胞，其二是借助3D打印的思路，利用细胞直接打印构成器官。传统组织工程方法的缺点是难以实现细胞密度、细胞种类的空间分布可控，也难以实现细胞的三维环境生长。因而目前器官打印技术又称之为细胞打印技术开始逐渐成为生物器官制造的研究热点。将细胞混合凝胶及生长因子制成生物墨水，利用3D打印技术定向控制细胞沉积，即可获得接近于真实器官结构的活性器官模型。目前采用3D打印(细胞打印、生物打印)方法实现含细胞的管状结构制造，已经有较多的文献报道，其打印方法包括采用喷墨式(inkjet-basedprinting)、激光激发式(laser-based printing)以及挤出式(extrusion-basedprinting)。
Yong Huang等采用z形升降平台辅助的喷墨打印***制造出了三维之字形管状结构(Xu C,Chai W,Huang Y,et al.Scaffold‐free inkjet printingof three‐dimensional zigzag cellular tubes[J].Biotechnology andbioengineering,2012,109(12):3152-3160)。喷墨式打印精度较高，但是不适合制造大尺寸的血管结构，而且在制造水平管状结构时需要复杂的补偿算法来解决变形问题。Yong Huang等利用激光转写技术制造血管状结构(Yan J,Huang Y,Chrisey D B.Laser-assisted printing of alginate long tubesand annular constructs[J].Biofabrication,2012,5(1):015002)。Ozbolat ITd等采用同轴喷头挤压制造类血管的凝胶管道(Zhang Y,Yu Y,Chen H,Ozbolat IT Characterization of printable cellular micro-fluidic channels fortissue engineering[J].Biofabrication,2013,5(2):025004)。
采用基于喷墨、激光直写的细胞打印可实现多细胞的可控沉积，但基于液滴的逐层叠加方式使得制造的管状结构强度较低，同时管状结构的密闭性也存在一定问题。基于挤出原理构造的管状结构主要目的是用于构造实体结构的营养通道，无法实现血管机理探讨所需的动态加载要求。真实的血管结构是由内皮细胞、平滑肌细胞、和成纤维细胞组成，现有文献报道的3D打印方法制造出的血管结构大部分是单层凝胶结构，且强度无法满足后续血管细胞力学的研究。
发明内容
本发明提供一种跨尺度(宏-微两级尺度)血管结构，利用凝胶交联的化学反应方式实现融合，可获得具有宏观血管流道以及微尺度通道的血管结构，并具有较好的强度。
一种跨尺度血管，由内至外依次包括：内衬层，分别以中空纤维形式螺旋卷绕而成的内管壁和外管壁；所述内衬层、内管壁和外管壁的材料分别含有血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，其中内管壁和外管壁采用3D打印制成。
本发明的血管结构具有宏-微两级尺度的流道，宏观流道为相互融合的中空纤维构成的血管流道，微观流道为中空纤维内部的微通道。
本发明还提供一种跨尺度血管的3D打印方法，包括：
利用含有平滑肌细胞的内层打印材料进行3D打印，以中空纤维形式螺旋卷绕形成内管壁；
利用含有成纤维细胞的外层打印材料进行3D打印，以中空纤维形式螺旋卷绕在内管壁上形成外管壁；
对内、外管壁进行固化处理，再利用含有血管内皮细胞的内衬材料在内管壁里面形成内衬层。
为了形成稳定、均匀的多圈螺旋卷绕结构，作为优选，在形成内管壁时，利用同轴嵌套的喷头向回转体模板的外周输出内层打印材料，在打印的同时轴向移动喷头在回转体模板的外周逐圈卷绕形成内管壁，所述同轴嵌套的喷头中，内喷头输送支撑材料，外喷头输出内管壁打印材料。
根据血管结构形状，回转体模板可以为等直径结构，也可以为变直径的结构。
作为优选，回转体模板为等直径结构，材料选用玻璃或者不锈钢。便于脱模。
作为优选，回转体模板为变直径结构，材料选用水溶性PLA。可以溶于水得到血管结构。
逐圈卷绕时，通过控制每圈之间的距离，保证未完全反应的相邻中空纤维相互融合，形成管状结构。
同理，在形成外管壁时，利用同轴嵌套的喷头向内管壁外周输出外层打印材料，在打印的同时轴向移动喷头在内管壁的外周逐圈卷绕形成外管壁，所述同轴嵌套的喷头中，内喷头输送支撑材料，外喷头输出外管壁打印材料。
在形成内衬层时，所述内衬材料通过注射、涂覆或浸渍的方法覆着在内管壁里面。
本发明利用3D打印装置将中空纤维围绕旋转的回转体模板逐圈缠绕，控制相邻圈中空纤维的距离，使其相互融合而不影响中空纤维内部的微通道。当去除回转体模板后，相互融合的中空纤维构成可用于输送营养。通过多个喷头的依次打印即可实现多种血管细胞的可控沉积，最终得到含有三层细胞的血管结构。
所述内层打印材料为含有平滑肌细胞的海藻酸钠水凝胶；所述外层打印材料为含有成纤维细胞的海藻酸钠水凝胶；所述内衬材料为含有血管内皮细胞的细胞溶液。
所述支撑材料为氯化钙水溶液。
本发明3D打印方法的具体步骤为：
(1)制备海藻酸钠溶液和氯化钙水溶液：将灭菌后的生化级海藻酸钠粉末和去离子水混合，制备成海藻酸钠水溶液；将灭菌后的生化级氯化钙粉末和去离子水混合，制备成氯化钙水溶液；
(2)根据血管细胞的组成和血管的结构特征，选用成纤维细胞和平滑肌细胞，培养(按照现有相关技术)后分别与海藻酸钠水溶液混合均匀，制备得到外层打印材料和内层打印材料；
(3)设置两个同轴嵌套结构的喷头，将外层打印材料和内层打印材料分别加入到与外喷头相连的注射器中；将氯化钙水溶液加入到与内喷头相连的注射器中；内喷头的出料端伸入到外喷头的喷腔内且继续延伸至外喷头的出料端平齐；
将四个注射器放置在四通道注射泵上，利用注射泵实现对各外喷头和各内喷头流量的控制；
(4)设置连接内层打印材料的喷头的出料速度、运行参数，控制外喷头和内喷头按照设定参数在回转体模板的外周进行打印，同时移动轴向移动喷头，使得中空纤维逐圈的螺旋卷绕在回转体模板的外周，得到未完全反应的中空纤维，且相邻圈中空纤维外壁贴靠处融合在一起，完成内管壁(第一层平滑肌细胞)的打印；
由于内喷头输出氯化钙水溶液起到支撑作用，所以通过外喷头输出的内层打印材料在氯化钙水溶液流失后会形成中空纤维结构。
运行参数一般是指喷头的沿回转体模板轴向的移动速度和回转体模板的转动速度，这些参数均可以通过3D打印装置直接控制；
喷头通过X轴驱动机构和Y轴驱动机构可分别实现同轴喷头沿x轴方向(回转体模板的轴向方向，一般水平布置)的移动和沿y轴方向(回转体模板的径向方向)的移动；回转体模板与A回转轴驱动机构连接，通过A回转轴驱动机构实现回转体模板的旋转运动。
打印过程中，打印材料的出料速度，回转体模板的转速和喷头的移动速度必须匹配才能形成均匀一致的血管模型。具体的工艺参数可按照以下公式得到：
n = v 0 2 π · r = v 0 2 π · f ( x ) - - - ( 1 )
v x = S · v 0 2 π · f ( x ) 1 1 + f ′ 2 ( x ) - - - ( 2 )
v r = S · v 0 2 π · f ( x ) f ′ ( x ) 1 + f ′ 2 ( x ) - - - ( 3 )
其中：
v0是打印材料的出料速度，
r是回转体半径(r＝f(x))，
x是回转体的轴向距离，
f′(x)是回转体外轮廓曲线的斜率
S是相邻圈中空纤维的间距，
n是回转体模板的转速，
vx是喷头水平移动速度，即沿x轴移动速度，
vr是喷头径向移动速度，即沿y轴移动速度。
(5)以相同的方法在内管壁(第一层平滑肌细胞凝胶层)上打印形成外管壁(第二层成纤维细胞凝胶层)；
作为优选，在形成内管壁和外管壁的过程中，外喷头物料流速为0.5-1.5ml/min；内喷头物料流速为1-4ml/min。配合适宜的物料粘度，打印得到的血管结构强度较好，生物兼容性较好。
(6)去除回转体模板，将打印的内、外管壁浸泡在氯化钙溶液中，完全反应得到具有一定强度的两层血管结构；
(7)选用血管内皮细胞，培养后，制备成细胞悬浮液注射到内管壁的内表面；
在内管壁的内壁上，中纤维间构成了具有一定起伏的表面结构，贴壁沉积血管内皮细胞更容易构造出光滑的血管内壁；
(8)静置一段时间，待内皮细胞均匀贴壁后得到具有三种细胞的三层血管结构。
步骤(1)-(8)得到的血管结构具有宏-微两级尺度的流道，宏观流道为去除回转体模板后，相互融合的中空纤维构成的血管流道，微观流道为中空纤维内部的微通道。
本发明与现有技术相比较，具有以下优点：
(1)通过多个同轴喷头的依次打印即可实现多种血管细胞的可控沉积；
(2)通过改变回转体的外形可以打印出不同形状的血管结构；
(3)打印出的血管结构具有跨尺度的流道，单层细胞凝胶结构中的微尺度流道可用于输送营养物质，使每种血管细胞均具有独立的物质输送通道，便于后续血管细胞化学刺激的研究；
(4)本发明利用凝胶交联的化学反应方式实现融合，打印的血管结构强度较好，便于后续血管细胞力学刺激的研究。
附图说明
图1为本发明打印出的跨尺度血管的纵切面示意图。
图2为本发明的跨尺度血管结构的3D打印过程示意图。
图3为利用本发明的方法打印出的跨尺度血管结构实物图。
其中：(a)、(b)部分是在不同放大倍数下拍摄的结构图，(c)部分是在电镜下拍摄的结构图。
图4(a)是打印出的不同浓度的血管结构的应力-应变曲线图。
图4(b)是打印出的血管结构的抗拉强度与海藻酸钠浓度的关系图。
图4(c)是打印出的血管结构的最大应变与海藻酸钠浓度的关系图。
图4(d)是打印出的不同培养时间后的血管结构的应力-应变曲线图。
图4(e)是打印出的血管结构的抗拉强度与培养时间的关系图。
图4(f)是打印出的血管结构的最大应变与培养时间的关系图。
图5为利用本发明的方法打印出的不同形状的血管结构实物图；
其中：(a)部分为直径递减的血管结构；(b)部分为直径先增后减的血管结构；(c)部分为直径成正弦函数规律变化的血管结构。
具体实施方式
参见图1，本发明一种跨尺度血管，由内至外依次包括：内衬层5，内管壁3和外管壁4。
内管壁3和外管壁4分别以中空纤维形式螺旋卷绕而成，内衬层5、内管壁3和外管壁4的材料分别含有血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。
内衬层5所围拢的空间作为宏观流道1，而中空纤维内部的微通道作为微观流道2。
图2为本发明3D打印过程示意图，整个***包括：喷头6、喷头7、回转体模板8、用于驱动两个喷头分别运动的X轴驱动机构和Y轴驱动机构，供给打印材料的四通道注射泵和注射器，以及用于控制打印过程的计算机。图中仅显示了喷头以及回转体模板和血管部分，其他部件省略。
喷头6、喷头7均为同轴嵌套结构，分别带有用于输出打印材料的外喷头以及用于输出支撑材料的内喷头。回转体模板8可沿箭头A方向绕自身轴线转动。
X轴驱动机构、Y轴驱动机构均可采用现有的驱动机构，一般包括电机、联轴器、电机丝杠、与电机丝杠螺纹配合的滑块以及对滑块进行导向、将电机丝杠转化为滑块的平动的导向部件或者导向结构。
X轴驱动机构一般固定在Y轴驱动机构的滑块上，实现对同轴喷头x轴和y轴移动方向的控制。
A回转轴驱动机构也可采用现有的驱动机构，一般包括电机、联轴器、电机座、轴承，实现回转体的旋转运动。在X轴驱动机构、Y轴驱动机构驱动下，喷头完成每层中空纤维的打印，在A回转轴驱动机构的配合下，完成血管管状结构的打印。
实施例1
本实施例的3D打印方法中成纤维细胞选用小鼠成纤维细胞L929，平滑肌细胞选用大鼠大动脉平滑肌细胞A7r5，血管内皮细胞选用人脐静脉血管内皮细胞HUVEC。在此条件下形成的中空纤维的平均外径为1113μm，内径为817μm，壁厚为148μm。回转体的直径为6mm。
为打印上述结构的血管，具体实施步骤如下：
(1)制备质量浓度为8％的海藻酸钠水溶液：称取一定量的生化级海藻酸钠粉末，放在紫外灯下照射灭菌半小时，按比例将海藻酸钠粉末和去离子水混合，磁力搅拌机搅拌24小时，温度设置为60℃，转速为120rpm。待混合均匀后得到质量浓度为8％的海藻酸钠水溶液；
(2)制备质量浓度为2％的氯化钙水溶液：称取一定量的生化级氯化钙粉末，放在紫外灯下照射灭菌半小时，按比例将氯化钙粉末和去离子水混合，磁力搅拌机搅拌1小时，温度设置为25℃，转速为120rpm。待混合均匀后得到质量浓度为2％的氯化钙水溶液；
(3)将培养在培养瓶中的成纤维细胞L929先用PBS冲洗，再用胰酶消化下来，得到的细胞悬浮液在离心机上离心，离心后去掉上清液，按比例加入MEM培养基混合均匀后得到细胞浓度为2×106个/ml的L929细胞溶液；
将培养在培养瓶中的平滑肌细胞A7r5先用PBS冲洗，再用胰酶消化下来，得到的细胞悬浮液在离心机上离心，离心后去掉上清液，按比例加入DMEM培养基混合均匀后得到细胞浓度为2×106个/ml的A7r5细胞溶液；
将培养在培养瓶中的内皮细胞HUVEC先用PBS冲洗，再用胰酶消化下来，得到的细胞悬浮液在离心机上离心，离心后去掉上清液，按比例加入M199培养基混合均匀后得到细胞浓度为1×106个/ml的HUVEC细胞溶液；
(4)将步骤(1)中的8％海藻酸钠水溶液分别与步骤(3)中的2×106个/ml的L929细胞溶液和2×106个/ml的A7r5细胞溶液按体积比1:1混合均匀，最终得到海藻酸钠成纤维细胞混合物(外层打印材料)和海藻酸钠平滑肌细胞混合物(内层打印材料)，其中海藻酸钠溶液的浓度为4％，细胞的浓度为1×106个/ml；
(5)将步骤(4)中配置好的含有成纤维细胞L929的4％的海藻酸钠溶液倒入与喷头6的外喷头相连的注射器中；
将步骤(2)中配置好的2％的氯化钙水溶液倒入与喷头6的内喷头相连的注射器中；
将步骤(4)中配置好的含有平滑肌细胞A7r5的4％的海藻酸钠溶液倒入与喷头7的外喷头相连的注射器中；
将步骤(2)中配置好的2％的氯化钙溶液倒入与喷头7的内喷头相连的注射器中。并将四个注射器均放置在双通道注射泵上；
(6)利用四通道注射泵控制喷头6和喷头7的外喷头和内喷头的液体的流动速度，均设置为1ml/min，得到含有细胞的未完全反应的中空凝胶纤维；
(7)打印第一层平滑肌细胞凝胶层：喷头7平行于X轴直线运动，根据工艺参数计算公式，回转体模板转动速度设置为42r/min，X轴驱动运动速度设置为46mm/min，线距设置为1mm。运行程序后得到融合在一起的第一层成纤维细胞凝胶结构；
(8)打印第二层成纤维细胞凝胶层：喷头6平行于X轴直线运动，根据工艺参数计算公式，回转体模板转动速度设置为32r/min，X轴驱动运动速度设置为35mm/min，线距设置为1mm。运行程序后得到融合在一起的第二层成纤维细胞凝胶结构；
(9)去除回转体模板，将打印的含有平滑肌细胞和成纤维细胞的两层凝胶结构浸泡在2％氯化钙水溶液中，完全反应得到具有一定强度的两层血管结构；
(10)用注射器将步骤(3)中配置好的HUVEC细胞溶液注射到上述打印的平滑肌细胞凝胶层的表面；
(11)将整个结构放在培养箱里静置1个小时，内皮细胞贴壁后得到具有一定强度且具有跨尺度流道的血管结构。
图3为本实施例所打印出的跨尺度血管结构。该结构包含成纤维细胞凝胶层、平滑肌细胞凝胶层和内皮细胞层三层结构，图3中(a)、(b)部分是在不同放大倍数下拍摄的结构图，(c)部分是在电镜下拍摄的结构图，可以看出整个结构融合为一个整体，经过力学测试有较好的强度，如图4所示。
实施例2
如图5所示，采用本发明的方法打印具有不同外形的跨尺度血管结构。打印这些血管结构时，不同之处在于回转体7的转动速度和喷头的平动速度要根据血管结构的外形做相应变化，其余步骤同实施例1。

Claims (9)

1.一种跨尺度血管，其特征在于，由内至外依次包括：内衬层，分别以中空纤维形式螺旋卷绕而成的内管壁和外管壁；所述内衬层、内管壁和外管壁的材料分别含有血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，其中内管壁和外管壁采用3D打印制成。
2.一种跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，包括：
利用含有平滑肌细胞的内层打印材料进行3D打印，以中空纤维形式螺旋卷绕形成内管壁；
利用含有成纤维细胞的外层打印材料进行3D打印，以中空纤维形式螺旋卷绕在内管壁上形成外管壁；
对内、外管壁进行固化处理，再利用含有血管内皮细胞的内衬材料在内管壁里面形成内衬层。
3.如权利要求2所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，在形成内管壁时，利用同轴嵌套的喷头向回转体模板的外周输出内层打印材料，在打印的同时轴向移动喷头在回转体模板的外周逐圈卷绕形成内管壁，所述同轴嵌套的喷头中，内喷头输送支撑材料，外喷头输出内管壁打印材料。
4.如权利要求3所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，回转体模板为等直径结构，材料选用玻璃或者不锈钢。
5.如权利要求3所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，回转体模板为变直径结构，材料选用水溶性PLA。
6.如权利要求3～5任一项所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，在形成外管壁时，利用同轴嵌套的喷头向内管壁外周输出外层打印材料，在打印的同时轴向移动喷头在内管壁的外周逐圈卷绕形成外管壁，所述同轴嵌套的喷头中，内喷头输送支撑材料，外喷头输出外管壁打印材料。
7.如权利要求6所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，在形成内衬层时，所述内衬材料通过注射、涂覆或浸渍的方法覆着在内管壁里面。
8.如权利要求2所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，所述内层打印材料为含有平滑肌细胞的海藻酸钠水凝胶；所述外层打印材料为含有成纤维细胞的海藻酸钠水凝胶；所述内衬材料为含有血管内皮细胞的细胞溶液；所述支撑材料为氯化钙水溶液。
9.如权利要求6所述的跨尺度血管的3D打印方法，其特征在于，在形成内管壁和外管壁的过程中，外喷头物料流速为0.5-1.5ml/min；内喷头物料流速为1-4ml/min。
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