CN105992770A - 白蛋白的变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力有所提高的白蛋白的变体以及其用途,且具体地说,涉及此类白蛋白的变体作为免疫原载剂的用途。在一些实施方案中,本发明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜递送的疫苗)。
Description
发明领域
本发明涉及对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力有所提高的白蛋白的变体以及其用途,且具体地说,涉及此类白蛋白的变体作为免疫原载剂的用途。在一些实施方案中,本发明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜递送的疫苗)。
发明背景
白蛋白是一种在哺乳动物的血浆中天然发现的蛋白质,在血浆中它是最丰富的蛋白质。其在维持血液的所需渗透压以及血流中各种物质的输送中起着重要的作用。已经从包括人类、猪、小鼠、大鼠、兔以及山羊在内的许多物种表征白蛋白,且已经发现来自不同的来源的白蛋白共享高度的结构关系。
白蛋白体内结合于新生儿Fc受体(FcRn),且已知此相互作用对于白蛋白的血浆半衰期来说是重要的(Chaudhury等人2003;Montoyo等人,2009)。FcRn是一种膜结合蛋白,且已经发现其使白蛋白以及IgG免于细胞内降解(Roopenian D.C.和Akilesh,S.(2007),Nat.Rev.Immunol 7,715-725)。因此,FcRn是一种有助于维持例如人类等哺乳动物的血清中高水平的IgG和白蛋白的双功能分子。
虽然已经在现有技术中表征了FcRn-IgG相互作用,但未充分表征FcRn-白蛋白。数据表明IgG和白蛋白非协同地结合于FcRn上不同的位点(Andersen等人(2006),Eur.J.Immunol 36,3044-3051;Chaudhury等人(2006),Biochemistry 45,4983-4990)。众所周知,小鼠FcRn结合来自小鼠和人类的IgG,而人类FcRn似乎更加区别对待(Ober等人(2001)Int Immunol 13,1551-1559)且不结合小鼠IfG(Ober等人(2001)Int Immunol 13,1551-1559)。此外,人类FcRn结合来自小鼠与人类的白蛋白,而小鼠FcRn不结合人类白蛋白(Andersen等人(2010)JBC)。
人类血清白蛋白(HSA)已被充分表征为585个氨基酸的多肽,其序列可见于Peters,T.,Jr.(1996)All about Albumin:Biochemistry,Genetics and Medical,Applications,Academic Press,Inc.,Orlando中。其特征性结合于其受体FcRn,其中其在pH 6.0下结合,而在pH 7.4下不结合。已经发现HSA的血清半衰期是大致19天。已经鉴别具有较短的血浆半衰期的天然变体(Biochim Biophys Acta.1991,1097:49-54),其具有取代D494N。此取代在此变体中产生N-糖基化位点,此N-糖基化位点在野生型HSA中不存在。不知道糖基化或氨基酸变化是否引起血浆半衰期的变化。
白蛋白具有长血清半衰期,且因为此特性,其已经用于药物递送。白蛋白已经偶联于药学上有益的化合物(WO0069902A),并发现偶联物维持白蛋白的长血浆半衰期,因此,一般发现偶联物所得到的血浆半衰期比单独有益的治疗化合物的血浆半衰期显著更长。
此外,白蛋白已经与治疗有益肽融合(WO 01/79271A和WO03/59934A),典型的结果是融合物具有治疗有益的肽的活性和长血浆半衰期,比单独治疗有益的肽的血浆半衰期显著更长。
白蛋白能够结合大量配体,且此特性已经用于延长能够结合于白蛋白的药物的血浆半衰期。此已经通过药学上有益的化合物结合于具有白蛋白结合特性的部分来实现。不清楚什么决定了所形成的偶联物或融合多肽的血浆半衰期,但似乎由构成其的白蛋白和所选的药学上有益的化合物/肽给予。需要能够控制既定白蛋白偶联物或白蛋白融合多肽的血浆半衰期,使得血浆半衰期可以比偶联物/融合物的组分所给予的血浆半衰期长或短,从而能够根据意图治疗的适应症的具体情况设计一种特定的药物或疫苗。
发明概要
本发明涉及对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力有所提高的白蛋白的变体以及其用途,且具体地说,涉及此类白蛋白的变体作为免疫原载剂和作为治疗剂的用途。在一些实施方案中,本发明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜递送的疫苗)。
在一些实施方案中,本发明提供一种变体人类血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA),其以相对于野生型HSA或MSA增加的亲和力结合于FcRn,其中多肽包含至少一个变体氨基酸。在一些实施方案中,多肽以10或更小、5或更小或1或更小(例如在酸性条件下测量)的Kd结合于FcRn。在一些实施方案中,多肽以比野生型白蛋白高的水平跨越极化人类细胞输送(例如如在极化人类细胞分析中4小时后以ng/ml测量)。在一些实施方案中,高水平为比野生型白蛋白高至少2、3、4、5或10倍。在一些实施方案中,功效超过10ng/ml(例如超过15ng/ml,或超过30ng/ml)。
在一些实施方案中,变体多肽与SEQ ID NO:1或野生型MSA至少80%、90%或95%一致。在一些实施方案中,变体氨基酸为例如SEQ ID NO:1的K573Y、I523G、I253A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M或K500A/H510Q中的一个或多个、HSA的结构域III的缺失或野生型MSA的K500A/H510Q。
在一些实施方案中,本发明提供一种包含突变(例如对应于SEQ ID NO:1或MSA的变体的位置573、523、527、505或结构域III中一个或多个的位置的取代突变)的白蛋白的变体、其片段或其融合物,其中与野生型白蛋白比较,白蛋白与hFcRn或mFcRn的结合增加或减少。在一些实施方案中,本发明提供白蛋白的变体与偶联于白蛋白的氨基酸的免疫原(例如抗原)的融合蛋白。在一些实施方案中,与野生型白蛋白相比改变的与FcRn的结合为结合亲和力增加。在一些实施方案中,白蛋白的变体为SEQ ID NO:1的K573Y、I523G、I253A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、K500A/H510Q、V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M或结构域III缺失。在一些实施方案中,白蛋白的变体为MSA的K500A/H510Q。在一些实施方案中,免疫原共价附接于包含硫醇基的氨基酸。
在一些实施方案中,本发明提供一种编码白蛋白的变体、其片段或其融合物(如上所述的免疫原融合蛋白)的核酸。在一些实施方案中,本发明提供包含核酸的宿主细胞。
在一些实施方案中,本发明提供一种组合物(例如疫苗组合物),其包含上述白蛋白的变体或融合蛋白和药学上可接受的载剂。在一些实施方案中,组合物调配成用于粘膜施用的疫苗。
在一些实施方案中,本发明提供一种在受试者中诱导免疫反应(例如粘膜免疫反应)的方法,其包括向受试者施用包含白蛋白的变体、其片段或其融合物和如上所述的免疫原的融合蛋白。在一些实施方案中,本发明提供包含白蛋白的变体、其片段、其融合物或其偶联物和如上所述的免疫原的融合蛋白治疗受试者的用途。
其它实施方案提供一种疫苗组合物,其包含:a)包含野生型白蛋白多肽和偶联物(例如免疫原)的融合蛋白;和b)药学上可接受的载剂。其它实施方案提供在受试者中诱导免疫反应的方法和用途,其包括在使得受试者对免疫原产生免疫反应的条件下向受试者施用上述疫苗组合物。在一些实施方案中,疫苗组合物进行气雾化。在一些实施方案中,疫苗组合物被递送至受试者的粘膜表面(例如鼻内)。
本文中描述其它实施方案。
附图简述
图1提供SEQ ID NO:1,野生型HSA。
图2(A)和(B)展示通过突变诱发靶向的HSA位置的结晶学图解。
图3展示用于产生白蛋白融合物的卡匣载体***。
图4展示纯化的白蛋白-GST变体的SDS-PAGE分析。(A)HSA-GST变体和B(MSA-GST变体)的代表性非还原SDS-PAGE凝胶分析。
图5展示HSA-GST变体与hFcRn的结合。(A-D)ELISA测量,展示在pH 6.0下WT HSA-GST和突变变体与hFcRn的结合。(E)在pH 6.0下HSA-GST变体与hFcRn的相对结合。相对结合基于ELISA结果(A-D)计算,其中WT FcRn结合设定成1。结果代表至少三个独立实验。
图6展示MSA和HSA-GST变体与hFcRn和mFcRn的结合。ELISA测量展示在pH 6.0下WTHSA和MSA-GST融合物以及突变变体与(A)hFcRn和(B-D)mFcRn的结合。在pH 6.0下WT HSA和MSA-GST融合物以及突变变体与hFcRn的相对结合。在pH 6.0下WT HSA和MSA-GST融合物以及突变变体与mFcRn的相对结合。相对结合基于ELISA结果计算,其中WT设定成1。结果代表至少三个独立实验。
图7展示MSA和HSA-GST变体与hFcRn和mFcRn的相对结合。(A)在pH 6.0下MSA和HSA-GST变体与(A)hFcRn和(B-D)mFcRn的相对结合。相对结合基于图6中的ELISA结果计算,其中WT FcRn结合设定成1。结果代表至少三个独立实验。
图8展示单体hFcRn与固定HSA变体的SPR结合。固定的(A)未融合的WT HSA、(B)WTHSA-GST、(C)HSA-EQ-GST、(D)HSA-IG-GST、(E)HSA-IA-GST、(F)HSA-KP-GST和(G)HSA-EQ/TM/KP上注射滴定量的单体hFcRn的结合。结合数据与BIA评估软件供应的1∶1朗缪尔结合模型拟合。估计的结合动力学概述于表2中。
图9展示跨越极化人类上皮细胞层的工程化HSA融合物变体的FcRn介导的转胞吞作用。从在Transwell***中生长的极化T84细胞的顶侧至基底外侧输送的WT HSA、KA/HQHSA和KP HSA融合物的量的ELISA定量。在时间点0小时和4小时从基底外侧储集器收集样品,且转胞吞的量表示为ng/ml转胞吞的HSA融合物。结果表示四个独立实验的平均值。
图10展示单体hFcRn与固定HSA变体的SPR结合。固定的(A)V547A(1μM-0.031μM)(B)V547A/K573P(1μM-0.031μM)和(C)E505Q/T527M/V547A/K573P(0.25μM-3.9μM)上注射滴定量的单体hFcRn的结合。
图11(A-F)展示在pH 7.4下HSA-GST变体与hFcRn的ELISA结合。
图12(A)和(B)展示HSA-GST变体与hFcRn的ELISA结合。ELISA测量展示在pH 6.0下WT HSA-GST和突变变体与hFcRn的结合。(B)ELISA测量展示在pH 7.4下WT HSA-GST和突变变体与hFcRn的结合。
图13展示跨越极化人类细胞的未融合HSA变体的转胞吞作用。从在Transwell***中生长的极化T84细胞的顶侧(A)至基底外侧(B)以及从B侧至A侧输送的未融合的WT HSA和KP的量的ELISA定量。
图14展示跨越极化人类细胞的HSA-GST变体的转胞吞作用。从在Transwell***中生长的极化T84细胞的顶侧至基底外侧输送的HSAWT、EQ、TM和KP/EQ/TM GST融合物的量的ELISA定量。
图15展示跨越极化人类细胞的HSA-GST变体的转胞吞作用。从在Transwell***中生长的极化T84细胞的顶侧至基底外侧输送的HSA VA、KP/VA和KP/EQ/TM/VA GST融合物的量的ELISA定量。
图16(A)和(B)展示跨越极化人类细胞的HSA耦接NP的转胞吞作用。(A)展示与WTHSA耦接的NP或KA/HQ在pH 6.0和7.4下的结合的ELISA。
定义
如本文所用,术语“白蛋白”意指三维结构与HSA基本上相同的蛋白质。根据本发明的白蛋白蛋白质的实例包括(但不限于)人类血清白蛋白、灵长类动物血清白蛋白(例如黑猩猩血清白蛋白、大猩猩血清白蛋白)、啮齿动物血清白蛋白(例如兔血清白蛋白、小鼠白蛋白和大鼠血清白蛋白)、牛血清白蛋白、马血清白蛋白、驴血清白蛋白、仓鼠血清白蛋白、山羊血清白蛋白、绵羊血清白蛋白、犬血清白蛋白、天竺鼠血清白蛋白、鸡血清白蛋白和猪血清白蛋白。如SEQ ID NO:1中公开的HSA或其任何天然存在的等位基因是根据本发明的优选白蛋白且具有67kDa的分子量。技术人员将了解可存在性质基本上与HSA相同,但与SEQ IDNO:1比较具有一个或几个变化的天然等位基因,本发明人还涵盖此类天然等位基因的使用。
如本文中所用,术语“白蛋白的片段”意指保留结合于FcRn的能力的白蛋白部分。片段可由一个来源于HSA的不中断序列组成或可包含两个或超过两个来源于HSA的序列。根据本发明的片段的尺寸超过大致20个氨基酸残基,优选超过30个氨基酸残基,更优选超过40个氨基酸残基,更优选超过50个氨基酸残基,更优选超过75个氨基酸残基,更优选超过100个氨基酸残基,更优选超过200个氨基酸残基,更优选超过300个氨基酸残基,甚至更优选超过400个氨基酸残基,且最优选超过500个氨基酸残基。
术语“野生型”在提及蛋白质而使用时是指由细胞、组织或生物体的基因组编码的蛋白质,不同于经操纵以产生合成蛋白质的蛋白质。
术语“变体”和“突变体”在提及多肽而使用时是指与另一通常相关多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化,其中经取代的氨基酸具有类似的结构或化学性质。一种类型保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。举例来说,一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸;一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酷氨酸和色氨酸;非天然氨基酸如对氨基苯并氨酸,一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;并且一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酷氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。更罕见地,变体可具有“非保守”变化(例如甘氨酸经色氨酸替换)。类似的微小变化还可包括氨基酸缺失或***(即添加)或两者。可使用本领域众所周知的计算机程序,例如DNAStar软件,发现决定哪些和多少氨基酸残基在不消除生物活性下可经取代、***或缺失的规则。可以在功能分析中测试变体。优选变体具有小于10%且优选小于5%且更优选小于2%变化(是否取代、缺失等等)。对于氨基酸取代,使用以下名称:原始氨基酸、位置、经取代的氨基酸。因此,位置573赖氨酸经丙氨酸取代称为“K573A”且位置573赖氨酸经脯胺酸取代称为K573P。多个突变通过添加标记(“+”)或“/”分隔,例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R/S411F”,分别表示甘氨酸(G)经精氨酸(R)和丝氨酸(S)经苯丙氨酸(F)的位置205和411的突变。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“一致性”描述。对本发明来说,两个氨基酸序列之间的一致性程度使用Needleman-Wunsch演算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453),如EMBOSS套装的Needle程序中所执行(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends inGenetics 16:276-277),优选3.0.0或更新版本中所执行来确定。所用的任选参数11644.000-EP7是间隙开口罚分10、间隙延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作一致性%且如下计算:(一致残基×100)/(比对长度-比对的间隙总数)。
表述“对应于参考序列中位置的氨基酸位置”和类似表述意图鉴别主要或空间结构中对应于参考序列中特定位置的氨基酸残基。技术人员将了解此可通过将既定序列与参考序列比对且鉴别与参考序列中特定位置比对的氨基酸残基来进行。举例来说,为发现既定白蛋白序列中对应于HSA中位置573的氨基酸残基,既定白蛋白序列与HSA比对且鉴别与HSA中位置573比对的氨基酸为既定白蛋白序列中对应于HSA中位置573的氨基酸。
表述Xnnn意图指位于对应于HSA中位置nnn的位置的氨基酸残基X,且表述XnnnY意图指位于对应于HSA中位置nnn的位置的任何氨基酸X经氨基酸残基Y取代。
如本文所用,术语“亲和力”是指例如白蛋白与FcRn等结合对的两个成员之间的结合强度的量度。Kd是解离常数且具有摩尔浓度的单位。亲合常数是解离常数的倒数。亲合常数有时用作描述此化学实体的通用术语。其为结合能量的直接量度。通过方程式ΔG0=-RTLN(K),K的自然对数与结合的吉布斯自由能线性相关,其中R=气体常数且温度为开氏度数。亲和力可实验测定,例如通过表面等离子体共振(SPR),使用市售Biacore SPR装置(GEHealthcare)。
如本文所用,如“包含白蛋白和偶联物的融合蛋白”中的术语“偶联物”是指任何附接(例如如融合蛋白中共价或非共价(例如经由疏水性相互作用))至白蛋白的分子。实例包括(但不限于)肽、多肽、免疫原、药物、蛋白质、脂质、小分子、核苷酸、放射性示踪剂等。
如本文所用,术语“在使所述受试者产生免疫反应的条件下”是指免疫反应(例如先天性或获得性)的任何定性或定量诱导、产生和/或刺激。
如本文中使用,术语“免疫反应”是指受试者的免疫***的反应。举例来说,免疫反应包括(但不限于)Toll受体活化、淋巴因子(例如细胞因子(例如Th1或Th2型细胞因子)或趋化因子)表达和/或分泌、巨噬细胞活化、树突状细胞活化、T细胞活化(例如CD4+或CD8+T细胞)、NK细胞活化和/或B细胞活化(例如抗体产生和/或分泌)的可检测的改变(例如增加)。免疫反应的其它实例包括免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽))与MHC分子结合和诱导针对免疫原性多肽所来源于的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应,诱导B细胞反应(例如抗体产生)和/或T辅助淋巴细胞反应和/或缓发型超敏反应(DTH)、免疫***的细胞(例如T细胞、B细胞(例如任何发育阶段(例如浆细胞)))的扩展(例如细胞群体发育)和抗原呈递细胞对抗原的加工和呈现增加。免疫反应可为针对受试者的免疫***识别为外来(例如来自微生物的非自体抗原(例如病原体)或识别为外来的自抗原)的免疫原。因此,应了解,如本文所用,“免疫反应”是指任何类型免疫反应,包括(但不限于)先天免疫反应(例如活化Toll受体信号传导级联)、细胞介导的免疫反应(例如免疫***的T细胞(例如抗原特异性T细胞)和非特异性细胞介导的反应)和体液免疫反应(例如B细胞介导的反应(例如经由产生和分泌抗体至血浆、淋巴和/或组织液中)。术语“免疫反应”意指涵盖受试者的免疫***对抗原和/或免疫原(例如对免疫原(例如病原体)的先天性反应以及作为适应性免疫反应结果的获得性(例如记忆)反应)起反应的能力的所有方面。
如本文所用,术语“免疫性”是指在暴露于能够引起疾病的微生物(例如病原体)后避免患上该疾病((例如预防减弱(例如抑制)疾病的征象、症状或病状)。免疫性可以是先天性(例如先前未暴露于抗原下存在的非适应性(例如非获得性)免疫反应)和/或获得性(例如在先前暴露于抗原后由B和T细胞介导的免疫反应(例如其展现对抗原的特异性和反应性增加))。
如本文所用,术语“免疫原”是指能够引起受试者中免疫反应的因子(例如微生物(例如细菌、病毒或真菌)和/或其部分或组分(例如蛋白质抗原))。在一些实施方案中,免疫原引起针对免疫原(例如微生物(例如病原体或病原体产物))的免疫性。
术语“测试化合物”是指可用于治疗或预防身体功能的疾病(disease)、病、疾病(sickness)或病症或以其它方式改变样品的生理或细胞状态的任何化学实体、药剂、药物等等。测试化合物包含已知与潜在的治疗化合物两者。测试化合物可以通过使用本发明的筛选法筛选来确定为治疗剂。“已知的治疗化合物”是指已展示(例如通过动物试验或在施用于人类的经验前)有效于此类治疗或预防的治疗化合物。
如本文所用,术语“样品”以其最广泛意义使用。如本文所用,术语“样品”以其最广泛意义使用。在某种意义上,其可以指组织样品。在另一种意义上,意味着包括从任何来源获得的样本或培养物以及生物制剂。生物样品可从动物(包括人类)获得且涵盖流体、固体、组织和气体。生物样品包括(但不限于)血液制品,例如血浆、血清等等。这些实例不应理解为限制可应用于本发明的样品类型。怀疑含有人类染色体或与人类染色体相关的序列的样品可包含细胞、从细胞分离的染色体(例如一系列中期染色体)、基因组DNA(在溶解状态中或结合于固体支撑物,例如用于DNA印迹分析)、RNA(在溶解状态中或结合于固体支撑物,例如用于RNA印迹分析)、cDNA(在溶解状态中或结合于固体支撑物)等等。怀疑含有蛋白质的样品可包含细胞、组织一部分、含有一种或多种蛋白质的提取物等等。
发明详述
本发明涉及对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力有所提高的白蛋白的变体以及其用途,且具体地说,涉及此类白蛋白的变体作为免疫原载剂的用途。在一些实施方案中,本发明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜递送的疫苗)。
首先展示白蛋白上对FcRn的主要结合位点位于C端DIII内(Andersen等人,NatCommun.2012年1月3日;3:610;Chaudhury等人Biochemistry.2006年4月18日;45(15):4983-90)。接着通过定点突变诱发,靶向人类白蛋白的DIII内的三个完全保守组氨酸残基(His464、His510和His535)揭露了所有残基对于结合都是关键的(Andersen等人,2012,上述)。建立人类FcRn-人类白蛋白复合物的对接模型,其中除DIII之外,展示N端DI内两个暴露的环接近受体(Andersen等人,2012,上述)。按照这些预测,人类FcRn与人类白蛋白的复合物的两个近来公布的共晶体结构证实DI与DIII的影响(Oganesyan等人,J BiolChem.2014年3月14日;289(11):7812-24.;Schmidt等人,Structure.2013年11月5日;21(11):1966-78)。一种共晶体结构含有野生型白蛋白且另一种含有具有四个氨基酸取代(V418M、T420A、E505G和V547A)的工程化人类白蛋白的变体(HSA13)。后者在pH 6与pH 7.4下对FcRn的亲和力提高。两个共晶体结构展示高度类似的结合模式,但具有一些差异,可能是因为HSA13DIII中引入的突变。此外,两个共晶体结构都展示DI中与FcRn接触的两个暴露的环。
若干研究已经展示了人类FcRn可以在两个方向上跨越粘膜上皮屏障输送单体IgG与含IgG的免疫复合物(Zhu等人,J Immunol.2005年7月15日;175(2):967-76;Yoshida等人,Immunity.2004年6月;20(6):769-83;Spiekermann等人,J Exp Med.2002年8月5日;196(3):303-10.Erratum in:J Exp Med.2003年6月2日;197(11):1601;Dickinson等人,JClin Invest.1999年10月;104(7):903-11;Zhu等人,J Immunol.2001年3月1日;166(5):3266-76))。
使用过度表达FcRn的极化Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞,证实受体通过自顶侧或者基底外侧转胞吞作用输送IgG(Zhu等人,J Immunol.2001年3月1日;166(5):3266-76;Jerdeva等人,Traffic.2010年9月;11(9):1205-20)。
这些发现提出了FcRn是否能够介导白蛋白的转胞吞作用以及与FcRn的相互作用的化学计量是否起作用的问题,因为白蛋白以1∶1方式结合FcRn,而IgG是同二聚体且具有两个FcRn的结合位点。迄今,一种使用MDCK细胞的研究表明白蛋白未转胞吞(Tesar等人,Traffic.2006年9月;7(9):1127-42)。
酵母显示已经用于研发具有一系列对人类FcRn的亲和力的人类白蛋白的变体。一种此类变体(E505G/V547A)在pH 6.0下亲和力提高超过10倍,在中性pH值下微小增加,此将人类FcRn转殖基因小鼠和食蟹猕猴猴中半衰期分别延长1.5倍和1.3倍(Schmidt等人,Structure.2013年11月5日;21(11):1966-78)。
此外,使用基于结构分析和交叉物种结合分析的方法,鉴别在酸性pH值下对人类FcRn的亲和力提高12倍,而在中性pH值下结合无法检测的的经单取代的人类白蛋白的变体(K573P)(Andersen等人,J Biol Chem.2014年5月9日;289(19):13492-502)。当在针对人类FcRn进行转殖基因的小鼠和食蟹猕猴中评估时,工程化变体展示半衰期分别延长1.4和1.6倍。
如上所述,本发明的实施方案提供了包含相对于野生型白蛋白,对FcRn的亲和力增强或减少的免疫原和白蛋白的变体的融合蛋白。具有改变的FcRn结合特性的工程化白蛋白的变体和衍生片段由于以下而具有提高的免疫原性:1)FcRn转胞吞作用提高;2)随分子量而变的生物分布/血清半衰期超过肾清除率阈值;3)FcRn介导的免于降解增加;4)因FcRn介导的树突状细胞胞内运输和加工增强而增加MHC I和II级上呈现;5)适用于粘膜递送;以及6)因为白蛋白是一种很稳定的分子,热稳定性增加。
与此类白蛋白的变体融合的疫苗亚单位不干扰FcRn结合。因为FcRn能够避免降解,驱使抗原呈现在MHC I和II级上且允许粘膜递送,所以相对于未结合于变体白蛋白多肽的免疫原,本发明的实施方案的疫苗的药物动力学和免疫原性提高。因此,本发明的实施方案提供改善的疫苗组合物和其用途,克服了现有疫苗的限制。
在研发本发明的实施方案的过程中进行的实验产生了具有改变的FcRn结合特性的全长白蛋白以及其衍生片段。此类变体展示当遗传学上与大量肽和折叠蛋白质结构域融合时保留FcRn结合。
本发明的实施方案提供了用于粘膜递送的疫苗。已经在关于Fc融合物的文献中证明和描述FcRn在免疫接种和粘膜递送中的作用。例如病毒和细菌等传染物在粘膜表面进入身体。肌肉内或皮下免疫接种通常由于次最佳递送和粘膜免疫***活化而仅仅在感染部位提供最低限度的保护。粘膜上皮细胞与固有膜内的免疫效应细胞之间紧密相关,因此通过粘膜表面递送疫苗可能是一种理想的方法。粘膜是预防有效进入的选择性屏障。本发明的实施方案提供了绕过此问题的组合物和方法,其通过使粘膜疫苗靶向在粘膜上皮上表达的FcRn。此提供了完整的亚单位疫苗跨越上皮屏障安全特定地输送至粘膜免疫***,以随后诱发免疫细胞活化和记忆。
设计用于粘膜递送的本发明的实施方案的疫苗利用FcRn介导的转胞吞路径来经粘膜递送基于与全长白蛋白或具有改变的FcRn结合特性的白蛋白突变体或片段的融合(化学或遗传学)的治疗剂或亚单位疫苗(抗原/免疫原)。此类疫苗用于预防和治疗感染(例如通过微生物)以及预防病毒诱发的癌症。在其它实施方案中,融合物用于递送治疗剂至特定的身体粘膜部位。因此,本发明的实施方案提供了用于局部递送至感染/发炎部位或癌症部位的方法和组合物。
在一些实施方案中,本发明提供了在HSA的位置573、253、523、527和505中的一个或多个或MSA的位置500或510具有取代的人类和小鼠白蛋白的变体。在一些实施方案中,变体是缺失。举例来说,在一些实施方案中,变体是SEQ ID NO:1的K573Y、I523G、I253A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、K500A/H510Q、V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M或结构域III缺失。在一些实施方案中,白蛋白的变体为MSA的K500A/H510Q。
本发明涵盖在不同于该位置的位置包含突变(例如取代、缺失或添加)的变体,只要该位置的取代维持即可。因此,在一些实施方案中,白蛋白的变体与野生型血清白蛋白(例如野生型HSA、SEQ ID NO:1或野生型MSA)至少80%、90%、95%、97%或99%一致,其限制条件为白蛋白的变体包含本文中描述的突变或缺失之一。在一些实施方案中,本发明提供变体白蛋白的片段。如上,片段优选与SEQ ID NO:1的一部分(即片段的亲本白蛋白)至少80%、90%、95%、97%或99%一致。在一些实施方案中,本发明提供了包含与变体白蛋白或其片段融合的异源多肽序列的融合蛋白。如上,形成融合蛋白一部分的变体白蛋白和片段优选与SEQ ID NO:1或其一部分(即片段的亲本白蛋白)至少80%、90%、95%、97%或99%一致,且包含如本文中描述的取代突变。
在一些实施方案中,变体白蛋白、其片段和融合物与对应野生型序列相比,对人类或小鼠FcRn的亲和力增加。技术人员将了解任何适合的方法可用于确定变体白蛋白对FcRn的亲和力是否高于或低于亲本白蛋白对FcRn的亲和力,例如确定和比较结合常数Kd。因此,根据本发明,认为Kd低于天然HSA的Kd的变体白蛋白具有比HSA更高的血浆半衰期,且认为Kd高于天然HSA的Kd的变体白蛋白具有比HSA更低的血浆半衰期。
在一些实施方案中,HSA变体包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中,氨基酸取代在HSA的位置547、573、253、523、527和505或MSA的位置500或510。在一些实施方案中,取代引起对FcRn的亲和力更高(例如Kd更低)。举例来说,在一些实施方案中,变体具有10或更低、5或更低或1或更低的Kd。在一些实施方案中,取代是保守或非保守变化。在一些实施方案中,特别涵盖具有与本文中描述的变体类似的侧链的既定位置的一种或多种变体(例如相对于本文中描述的变体的保守变化)。
保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。举例来说,一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸;一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酷氨酸和色氨酸;一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;并且一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。示例性的保守氨基酸取代组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酷氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
基因编码的氨基酸可以被分成四个家族:(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸);(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸);(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸);和(4)不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酷氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酷氨酸有时共同分类为芳香族氨基酸。以类似方式,氨基酸谱系可以分组为(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸);(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、(3)脂族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸),其中丝氨酸和苏氨酸视情况分开分组为脂族羟基;(4)芳香族(苯丙氨酸、酷氨酸、色氨酸);(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺);和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如Stryer等人,Biochemistry,第17-21页,第2版,WH Freeman and Co.,1981)。
在一些实施方案中,变体包括“非保守”变化(例如甘氨酸经色氨酸替换)。可以使用计算机程序,发现决定哪些氨基酸残基在不消除生物活性下可以经取代、***或缺失的规则。
根据本发明的白蛋白或其片段可使用本领域内已知的技术偶联于免疫原(例如抗原)。本发明不限于特定的免疫原。可以利用任何免疫原或抗原片段。实例包括但不限于来源于微生物(例如致病微生物)、肿瘤(例如用于癌症疫苗)的免疫原等等。
本发明的变体白蛋白、其片段和融合物可以使用技术人员众所周知的技术制备。一种合宜的方式是通过克隆编码包含本文中描述的取代突变的亲本白蛋白、其片段或融合多肽的核酸。
包含本发明的变体白蛋白、其片段和融合物的融合蛋白也可以连接至信号序列以使得在转型的宿主生物体培养期间多肽分泌至生长培养基中。一般宜将变体多肽分泌至生长培养基中以使得回收和纯化容易。
用于制备变体多肽的技术也在WO 2009019314(以引用的方式包括)中公开且这些技术也可以应用于本发明。白蛋白已经在一系列宿主中成功地表达为重组蛋白质,这些宿主包括真菌(包括(但不限于)曲菌属(Aspergillus)(WO06066595)、克氏酵母(Klyveromyces)(Fleer 1991,Bio/technology 9,968-975)、毕赤氏酵母属(PichiaPichia)(Kobayashi 1998Therapeutic Apheresis 2,257-262)和酵母菌属(Saccharomyces)(Sleep1990,Bio/technology 8,42-46))、细菌(Pandjaitab 2000,J.Allergy Clin.Immunol 105,279-285))、动物(Barash 1993,Transgenic Research 2,266-276)和植物(包括(但不限于)马铃薯和烟草(Sijmons 1990,Bio/technology 8,217和Farran 2002,Transgenic Research 11,337-346))。本发明的HSA结构域III衍生物、其片段或变体优选在适合的宿主细胞中重组产生。原则上,可以使用任何能够产生适合量的多肽的宿主细胞且普通从业人员能够根据本发明选择适合的宿主细胞。一种优选的宿主生物体是酵母,优选在酵母菌属(Saccharomycacae)中选择,更优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
可以使用例如过滤、离心、色谱法、亲和力分离技术等已知的分离技术的组合,从生长培养基回收和纯化包含本发明的变体白蛋白、其片段和融合物的融合蛋白。普通从业者能够使用此类已知的分离步骤的特定组合纯化本发明的变体白蛋白、其片段和融合物。作为可以应用于本发明的变体的纯化技术的实例,可以提及WO0044772的教导内容。
在一些实施方案中,使用本领域中已知的分子生物学技术,从融合核酸表达融合蛋白。一种或多种免疫原多肽可以与白蛋白的变体或其片段的N端、C端融合,***白蛋白的变体或其片段结构中的环中,或其任何组合。其可能或其可能不包含将融合多肽的各种组分分开的连接序列,与白蛋白或其片段的融合物有关的教导内容为本领域中已知且技术人员将了解此类教导内容也可以应用于本发明。WO 01/79271A和WO 03/59934A还含有可以与本发明的白蛋白的变体和其片段融合的多肽的实例且这些实例也适用于本发明。
根据本发明的白蛋白的变体或其片段或包含白蛋白的变体或其片段的融合多肽具有其血浆半衰期与亲本白蛋白的变体或其片段或包含白蛋白的变体或其片段的融合多肽相比改变的益处。其益处为:根据本发明的包含白蛋白的变体或其片段的偶联物或包含白蛋白的变体或其片段的融合多肽的血浆半衰期可以根据特定的治疗目的来选择。
在其它实施方案中,白蛋白的变体偶联于免疫原。用于免疫原偶联白蛋白衍生物、其片段或变体的技术为本领域中已知。WO2009019314公开了适于治疗化合物偶联多肽的技术的实例,此项技术也可以应用于本发明。此外,WO2009019314公开了可以偶联于经取代的转铁蛋白的化合物和部分的实例,且这些实例也可以应用于本发明。WO2009019314的教导内容以引用的方式包括在本文中。
HSA在其天然形式中含有可方便用于结合的一个游离硫醇基。作为此方面内特定的实施方案,本发明的变体白蛋白、其片段和融合物可以包含进一步的修改,用以在表面上产生额外的游离硫醇基。其益处为:增加白蛋白衍生物、其片段或变体的有效负荷,使得超过一个分子的免疫原可以偶联于每个白蛋白衍生物、其片段或变体,或两个或超过两个不同的免疫原可以偶联于每个分子的变体白蛋白、其片段和融合物。可以进行修饰以提供表面上其它游离硫醇基的特定残基的教导内容可见于以引用的方式并入的共同待决的专利申请(EP 2009 152 625.1)。
在一些实施方案中,本发明提供了包含本文中描述的白蛋白的变体或野生型白蛋白和免疫原的疫苗组合物。本发明不受包含白蛋白/免疫原融合物的组合物的特定调配限制。实际上,本发明的疫苗组合物可以包含除融合蛋白外的一种或多种不同试剂。这些试剂或辅因子包括(但不限于)佐剂、表面活性剂、添加剂、缓冲剂、增溶剂、螯合剂、油类、盐、治疗剂、药物、生物活性剂、抗菌剂和抗微生物剂(例如抗生素、抗病毒剂等等)。在一些实施方案中,包含融合蛋白的疫苗组合物包含增强免疫原诱导免疫反应的能力的试剂和/或辅因子(例如佐剂)。在一些优选实施方案中,一种或多种辅因子或试剂的存在减少了诱导免疫反应(例如保护性免疫反应(例如保护性免疫接种))所需要的免疫原的量。在一些实施方案中,一种或多种辅因子或试剂的存在可以用于免疫反应向细胞(例如T细胞介导)或体液(例如抗体介导)免疫反应偏移。本发明不受用于本发明治疗剂的辅因子或试剂类型。
佐剂一般描述于Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach,Powell和Newman编辑,Plenum Press,New York,1995中。本发明不受利用的佐剂类型(例如用于组合物(例如药学组合物)中)限制。举例来说,在一些实施方案中,适合的佐剂包括铝盐,例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝。在一些实施方案中,佐剂可以是钙、铁或锌的盐,或可以是酰化酷氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化的多糖或聚磷腈的不溶悬浮液。
一般说来,通过抗原与免疫***的细胞的相互作用,对抗原产生免疫反应。免疫反应可以广泛分类成两个类别:体液和细胞介导的免疫反应(例如传统上特征分别为抗体和细胞效应保护机制)。反应的这些类别已经称为Th1类型反应(细胞介导的反应)和Th2类型免疫反应(体液反应)。
免疫反应的刺激可以由免疫***的细胞或组分对介入(例如暴露于免疫原)的直接或间接反应引起。免疫反应可以用许多方式测量,包括免疫***的细胞(例如B细胞、T细胞、树突状细胞、APC、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等)的活化、增殖或分化;标记物和细胞因子的表达上调或下调;IgA、IgM或IgG效价的刺激;脾肿大(包括脾细胞结构增加);各种器官中增生和混合细胞浸润。本领域中已知可以根据免疫刺激评估的免疫***的其它的反应、细胞和组分。
虽然实践本发明无需理解机制且本发明不限于任何特定的作用机制,但在一些实施方案中,本发明的组合物和方法诱导细胞因子的表达和分泌(例如巨噬细胞、树突状细胞和CD4+T细胞)。特定细胞因子的表达的调节可以局部或全身发生。已知细胞因子型态可以决定免疫反应中T细胞调节和效应功能。在一些实施方案中,可以诱导Th1类型细胞因子,且因此本发明的免疫刺激组合物可以促进Th1类型抗原特异性免疫反应,包括细胞毒性T细胞(例如由此避免不需要的Th2类型免疫反应(例如产生与疾病严重程度增强相关的Th2类型细胞因子(例如IL-13)(例如IL-13诱发粘液形成)))。
细胞因子在引导T细胞反应中起作用。辅助(CD4+)T细胞通过产生作用于其它免疫***细胞(包括B和其它T细胞)的可溶性因子来配合哺乳动物的免疫反应。最成熟的CD4+T辅助细胞表达两种细胞因子型态之一:Th1或Th2。Th1型CD4+T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF和高水平的TNF-α。Th2细胞表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平的TNF-α。Th1型细胞因子促进细胞免疫与特征为免疫球蛋白类别在小鼠中转变成IgG2a且在人类中转变成IgG1的体液免疫。Th1反应也可以与延迟型超敏反应和自体免疫疾病有关。Th2类型细胞因子主要诱导体液免疫并诱导类别转变成IgG1和IgE。与Th1反应相关的抗体同型一般具有中和和调理能力,而与Th2反应相关的抗体同型更多地与过敏性反应相关。
若干因素已经显示影响免疫反应向Th1或者Th2类型反应偏移。最佳表征的调节剂是细胞因子。IL-12和IFN-γ是阳性Th1和阴性Th2调节剂。IL-12促进IFN-γ产生,且IFN-γ为IL-12提供正反馈。IL-4和IL-10似乎对Th2细胞因子型态的建立是重要的,且下调Th1细胞因子的产生。
因此,在优选实施方案中,本发明提供一种刺激受试者中Th1型免疫反应的方法,其包括向受试者施用包含免疫原的组合物。然而,在其它实施方案中,本发明提供一种刺激受试者中Th2型免疫反应(例如是否需要T细胞介导的反应的平衡)的方法,其包括向受试者施用包含免疫原的组合物。在另一优选实施方案中,佐剂可用于(例如可以与本发明的组合物共同施用)将免疫反应向Th1或者Th2型免疫反应偏移。举例来说,诱导Th2或弱Th1反应的佐剂包括(但不限于)明矾、皂角苷和SB-As4。诱导Th1反应的佐剂包括(但不限于)MPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-γ和SB-AS2。
若干其它类型的Th1类型免疫原可以用于(例如作为佐剂)本发明的组合物和方法中。这些包括(但不限于)以下。在一些实施方案中,使用单磷酰脂质A(例如尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL))。3D-MPL是一种由Ribi Immunochem,Montana制造的众所周知的佐剂。化学上其常常呈具有4、5或6酰化链的3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合物供应。在一些实施方案中,使用双磷酰脂质A和其3-O-脱酰化变体。这些免疫原每一个可以通过以引用的方式整体并入本文中的GB 2122204B中描述的方法纯化和制备。已经描述其它的纯化和合成脂多糖(参见例如美国专利号6,005,099和EP 0 729 473;Hilgers等人,1986,Int.Arch.Allergy.Immunol.,79(4):392-6;Hilgers等人,1987,Immunology,60(1):141-6;和EP 0 549 074,这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中,3D-MPL呈微粒调配物形式使用(例如直径上微小粒径小于0.2μm,描述于以引用的方式整体并入本文中的EP 0689 454)。
在一些实施方案中,皂角苷用作本发明组合物中的免疫原(例如Th1型佐剂)。皂角苷是众所周知的佐剂(参见例如Lacaille-Dubois和Wagner(1996)Phytomedicine第2卷第363-386页)。皂角苷的实例包括Quil A(来源于美国南方树皂树肥皂草的树皮)和其部分(参见例如美国专利号5,057,540;Kensil,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2):1-55;和EP 0 362 279,这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)。也涵盖溶血皂角苷QS7、QS17和QS21(Quil A的HPLC纯化部分;参见例如Kensil等人(1991).J.Immunology 146,431-437,美国专利号5,057,540;WO 96/33739;WO 96/11711和EP 0362 279,这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)适用于本发明。也涵盖适用的是QS21与聚山梨酸酯或环糊精的组合(参见例如WO 99/10008,以引用的方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中,含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫原性寡核苷酸用作佐剂。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基元的缩写。CpG为本领域中已知,当通过全身和粘膜途径施用时作为佐剂(参见例如WO 96/02555,EP 468520,Davis等人,J.Immunol,1998,160(2):870-876;McCluskie和Davis,J.Immunol.,1998,161(9):4463-6;和美国专利申请号20050238660,这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)。举例来说,在一些实施方案中,免疫刺激序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶;其中CG基元未甲基化。
虽然实践本发明无需理解机制且本发明不限于任何特定的作用机制,但在一些实施方案中,一种或多种CpG寡核苷酸的存在活化各种免疫子集,包括天然杀伤细胞(其产生IFN-γ)和巨噬细胞。在一些实施方案中,CpG寡核苷酸调配成本发明的组合物以诱导免疫反应。在一些实施方案中,CpG的游离溶液与抗原(溶液内存在)一起共同施用(参见例如WO96/02555;以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中,CpG寡核苷酸共价偶联于抗原(参见例如WO 98/16247、以引用的方式并入本文中),或用例如氢氧化铝等载剂调配(参见Brazolot-Millan等人,Proc.Natl.AcadSci.,USA,1998,95(26),15553-8)。
在一些实施方案中,例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂等佐剂、细胞因子(例如介白素(例如IL-2、IFN-γ、IL-4等)、巨噬细胞群落刺激因子、肿瘤坏死因子等)、细菌ADP核糖基化毒素的解毒突变体(例如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热肠毒素(LT),尤其LT-K63(其中赖氨酸取代位置63的野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸取代位置72的野生型氨基酸)、CT-S109(其中丝氨酸取代位置109的野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中赖氨酸取代位置9的野生型氨基酸和甘氨酸取代位置129的野生型氨基酸))(参见例如WO93/13202和WO92/19265,这些中的每个以引用的方式并入本文中)和其它免疫原性物质(例如其增强本发明的组合物的有效性)与包含本发明的免疫原的组合物一起使用。
用于本发明的佐剂的其它实例包括聚(二(羧酸根基苯氧基)膦腈(PCPP聚合物;Virus Research Institute,USA);脂多糖的衍生物,例如单磷酰脂质A(MPL;RibiImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Mont.)、胞壁酰二肽(MDP;Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi);OM-174(与脂质A相关的葡糖胺双糖;OM Pharma SA,Meyrin,Switzerland);和利什曼虫延伸因子(纯化的利什曼虫蛋白质;Corixa Corporation,Seattle,Wash.)。
佐剂可以添加至包含免疫原的组合物,或在与组合物组合或共同施用前,佐剂可以与载剂,例如脂质体或金属盐(例如铝盐(例如氢氧化铝))一起调配。
在一些实施方案中,包含免疫原的组合物包含单一佐剂。在其它实施方案中,组合物包含两种或超过两种佐剂(参见例如WO 94/00153;WO 95/17210;WO 96/33739;WO 98/56414;WO 99/12565;WO 99/11241;和WO 94/00153,这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中,包含免疫原的组合物包含一种或多种粘膜粘着剂(参见例如美国专利申请号20050281843,以引用的方式整体并入本文中)。本发明不受所利用的粘膜粘着剂的类型限制。实际上,涵盖多种粘膜粘着剂适用于本发明,包括(但不限于)聚(丙烯酸)的交联衍生物(例如卡波普(carbopol)和聚卡波菲)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(例如海藻酸盐和壳聚糖)、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛蛋白和羧甲基纤维素。虽然实践本发明无需理解机制且本发明不限于任何特定的作用机制,但在一些实施方案中,使用粘膜粘着剂(例如包含免疫原的组合物中)增强受试者中免疫反应的诱导(例如施用本发明的组合物),此增强是因为当使用粘膜粘着剂时与未使用粘膜粘着剂下对免疫原的暴露持续时间和量相比,受试者经历的暴露于免疫原的持续时间和/或量增加。
在一些实施方案中,本发明的组合物可以包含无菌水性制剂。可接受的媒剂和溶剂包括(但不限于)水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、磷酸盐缓冲生理食盐水和等张氯化钠溶液。此外,无菌非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此,可以采用任何温和的非挥发性油,包括合成的单酸甘油酯或二酸甘油酯。此外,例如油酸等脂肪酸用于注射剂的制备中。适于粘膜、皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内或经由其它途径施用的载剂调配物可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa。
包含本发明的免疫原的组合物可以治疗性(例如增强免疫反应)或预防性(例如用于免疫接种例如预防疾病征象或症状))使用。包含本发明的免疫原的组合物可以经由大量不同的递送途径和方法施用于受试者。
举例来说,本发明的组合物可以通过多种方法施用于受试者(例如经粘膜(例如鼻粘膜、粘液鞘等)),包括(但不限于):悬浮在溶液中并涂覆于表面;悬浮在溶液中并使用喷雾施加器喷雾至表面上;与粘膜粘着剂混合且施加(例如喷雾或擦拭)至表面上(例如粘膜表面);位于鼻和/或***涂覆器上或浸渗至鼻和/或***涂覆器上且涂覆;通过控制释放机构施加;作为脂质体施加;或在聚合物上施加。
在一些实施方案中,本发明的组合物经粘膜施用(例如使用标准技术;参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第19版,1995(例如关于粘膜递送技术,包括鼻内、肺、***和直肠技术)以及欧洲公布号517,565和Illum等人,J.Controlled Rel.,1994,29:133-141(例如关于鼻内施用的技术),这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)。或者,本发明的组合物可以经真皮或经皮,使用标准技术(参见例如Remington:The Science arid Practice of Pharmacy,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第19版,1995)施用。本发明不受施用途径限制。
虽然实践本发明无需理解机制且本发明不限于任何特定的作用机制,但在一些实施方案中,粘膜免疫接种是优选的施用途径,因为其已经展示抗原的粘膜施用具有更大的诱导粘膜表面(许多病原体的侵入途径)上保护性免疫反应的功效(例如粘膜免疫性)。另外,例如鼻内免疫接种等粘膜免疫接种不仅可以诱导鼻粘膜中粘膜免疫性,而且也可以诱导例如生殖器粘膜等远端粘膜部位中的粘膜免疫性(参见例如Mestecky,Journal ofClinical Immunology,7:265-276,1987)。更有利地,在其它优选实施方案中,除诱导粘膜免疫反应外,粘膜免疫接种也诱导全身免疫性。在一些实施方案中,非肠胃外施用(例如疫苗的粘膜施用)提供了一种有效并合宜的加强全身免疫性(例如通过肠胃外或粘膜免疫接种诱导(例如在使用多个加强剂维持有力的全身免疫性的情况下))的方式。
在一些实施方案中,借助于经由粘膜途径(例如口腔/食物或鼻途径)施用本发明的组合物,包含本发明的免疫原的组合物可以用于保护或治疗易患或罹患疾病的受试者。替代粘膜途径包括***内和直肠内途径。在本发明的优选实施方案中,使用鼻施用途径,本文中称为“鼻内施用”或“鼻内免疫接种”。鼻内免疫接种的方法是本领域众所周知的,包括施用疫苗的液滴或喷雾形式至有待免疫接种的受试者的鼻咽中。在一些实施方案中,提供一种雾化或气雾化组合物。例如口服的胃耐受胶囊等经肠调配物、直肠或***施用的栓剂也形成本发明的一部分。本发明的组合物也可以经由口腔途径施用。在这些情况下,包含免疫原的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂和/或包括碱性缓冲液或肠溶胶囊。用于经鼻递送的调配物可以包括以葡聚糖或环糊精和皂角苷作为佐剂的调配物。
本发明的组合物也可以经由***腔途径施用。在此类情况下,包含免疫原的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂和/或乳化剂、聚合物(例如CARBOPOL)和***乳膏和栓剂的其它已知的稳定剂。在一些实施方案中,本发明的组合物也可以经由直肠途径施用。在此类情况下,组合物可以包含本领域中已知用于形成直肠栓剂的赋形剂和/或蜡和聚合物。
在一些实施方案中,选择相同的施用途径(例如粘膜施用)用于初始和强化免疫接种。在一些实施方案中,利用多个施用途径(例如同时或连续)以刺激免疫反应。
举例来说,在一些实施方案中,包含免疫原的组合物以初始或者强化免疫接种方案施用于受试者的粘膜表面。或者,在一些实施方案中,组合物以初始或者强化免疫接种方案全身施用。在一些实施方案中,包含免疫原的组合物以初始免疫接种方案经由粘膜施用而施用于受试者,且以强化方案经由全身性施用而施用于受试者。在一些实施方案中,包含免疫原的组合物以初始免疫接种方案经由全身性施用而施用于受试者,且以强化方案经由粘膜施用而施用于受试者。全身性施用途径的实例包括(但不限于)肠胃外、肌肉内、皮内、经皮、皮下、腹膜内或静脉内施用。包含免疫原的组合物可以用于达成预防和治疗的目的。
在一些实施方案中,本发明的组合物通过肺递送施用。举例来说,本发明的组合物可以经由吸入递送至受试者(例如人类)的肺(例如由此横穿肺上皮内层至血流)(参见例如Adjei等人,Pharmaceutical Research 1990;7:565-569;Adjei等人,Int.J.Pharmaceutics 1990;63:135-144;Braquet等人,J.Cardiovascular Pharmacology1989 143-146;Hubbard等人,(1989)Annals of Internal Medicine,Vol.III,第206-212页;Smith等人,J.Clin.Invest.1989;84:1145-1146;Oswein等人,″Aerosolization ofProteins″,1990;Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery IIKeystone,Colorado;Debs等人,J.Immunol.1988;140:3482-3488;和颁予Platz等人的美国专利号5,284,656,这些中的每个以引用的方式整体并入本文中)。用于药物肺递送以达成全身作用的方法和组合物描述于颁予Wong等人的美国专利号5,451,569,以引用的方式并入本文中;又参见颁予Licalsi等人的美国专利号6,651,655,以引用的方式整体并入本文中))。
进一步涵盖用于实践本发明的是各类设计用于药剂经肺和/或鼻粘膜递送的机械装置,包括(但不限于)喷雾器、定剂量吸入器和粉末吸入器,都是本领域的技术人员熟悉的。适于实践本发明的市售装置的一些特定实例是Ultravent喷雾器(Mallinckrodt Inc.,St.Louis,Mo.);Acorn II喷雾器(Marquest Medical Products,Englewood,Colo.);Ventolin定剂量吸入器(Glaxo Inc.,Research Triangle Park,N.C.);和Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.,Bedford,Mass.)。所有此类装置都需要使用适于分配治疗剂的调配物。典型地,每种调配物是采用的装置类型特定的,且除常见的稀释剂、佐剂、表面活性剂、载剂和/或其它适用于疗法的试剂外,可能涉及使用适当的推进材料。此外,涵盖脂质体、微胶囊或微球体、包合络合物或其它类型载剂的使用。
因此,在一些实施方案中,借助于通过粘膜、肌肉内、腹膜内、皮内、经皮、肺、静脉内、皮下或本文中描述的其它施用途径施用组合物,包含本发明的免疫原的组合物可以用于保护和/或治疗易患或罹患疾病的受试者。疫苗制剂的全身性施用方法可以包括常规的注射器和针或设计用于沿弹道递送固体疫苗的装置(看到例如WO 99/27961,以引用的方式并入本文中),或无针压力液体喷射装置(参见例如美国专利号4,596,556;美国专利号5,993,412,这些中的每个以引用的方式并入本文中)或经皮贴片(参见例如WO 97/48440;WO98/28037,这些中的每个以引用的方式并入本文中)。本发明也可以用以增强涂覆于皮肤的抗原的免疫原性(经皮或经皮肤递送,参见例如WO 98/20734;WO 98/28037,这些中的每个以引用的方式并入本文中)。因此,在一些实施方案中,本发明提供了一种全身性施用的递送装置,其预先填充本发明的疫苗组合物。
本发明不受施用本发明的组合物的受试者类型(例如为刺激免疫反应(例如为产生保护性免疫(例如粘膜和/或全身免疫性)))限制。实际上,涵盖多种受试者以受益于本发明组合物的施用。在优选实施方案中,受试者是人类。在一些实施方案中,人类受试者具有各种年龄(例如成年人、儿童、婴儿等),已经或很可能暴露于微生物(例如大肠杆菌)。在一些实施方案中,人类受试者是更可能直接暴露于致病微生物或在暴露于病原体后更可能显示疾病征象和症状的受试者(例如免疫受抑制的受试者)。在一些实施方案中,公众施用(例如免疫接种)本发明的组合物(例如以预防疾病的出现或蔓延)。举例来说,在一些实施方案中,本发明的组合物和方法将用于免疫接种一组人(例如一个地区、城市、州和/或国家的人口)以保护其自身健康(例如预防或治疗疾病)。在一些实施方案中,受试者是非人类哺乳动物(例如猪、牛、山羊、马、绵羊或其它家畜;或小鼠、大鼠、兔或其它动物)。在一些实施方案中,本发明的组合物和方法用于研究背景中(例如研究动物)。
本发明的组合物可以调配用于通过任何途径施用,例如粘膜、口腔、经皮、鼻内、肠胃外或本文中描述的其它途径。组合物可以呈任一种或多种不同形式,包括(但不限于)锭剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、***锭、泡沫剂、乳膏剂或液体制剂。
本发明的局部调配物可以呈例如软膏剂、乳膏剂或洗剂、泡沫剂和气溶胶形式呈现,且在软膏剂和乳膏剂中可含有适当的常规添加剂,例如防腐剂、溶剂(例如帮助渗透)和润滑剂。
局部调配物也可以包括增强活性成分渗透穿过皮肤的试剂。示例性试剂包括N-(羟乙基)吡咯烷酮与细胞包膜紊乱化合物的二元组合、与亚砜或氧化膦组合的糖酯和蔗糖单油酸酯、癸基甲基亚砜和醇。
其它增加皮肤渗透的示例性材料包括表面活性剂或润湿剂,包括(但不限于)聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Polysorbate 80);脱水山梨糖醇单油酸酯(Span 80);对异辛基聚氧乙烯-苯酚聚合物(Triton WR-1330);聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(Tween 85);硫代丁二酸二辛钠;和肌氨酸钠(Sarcosyl NL-97);和其它药学上可接受的表面活性剂。
在本发明的某些实施例中,组合物可以进一步包含以下一种或多种:醇、含锌化合物、润滑剂、润湿剂、增稠和/或胶凝剂、中和剂和表面活性剂。用于调配物中的水优选是具有中性pH值的去离子水。局部调配物中的其它添加剂包括(但不限于)硅酮油、染料、香料、pH值调节剂和维生素。局部调配物也可以含有相容的常规载剂,例如乳膏或软膏基质和用于洗剂的乙醇或油醇。此类载剂含量可以为调配物的约1%至约98%。软膏基质可以包含以下一种或多种:矿脂、矿物油、地蜡、羊毛脂醇、泛醇、甘油、没药醇、可可脂等。
在一些实施方案中,本发明的药学组合物可以调配为泡沫且使用。药学泡沫包括调配物,例如(但不限于)乳液、微乳液、乳膏、胶状物和脂质体。虽然基本上类似,但实际上这些调配物在最终产物的组分和稠度上不同。本发明的组合物可以另外含有药学组合物中通常发现的其它辅助组分。因此,举例来说,组合物可以含有其它相容的药学上活性物质,例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂,或可以含有适用于物理调配本发明组合物的各种剂型的其它物质,例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、乳浊剂、增稠剂和稳定剂。然而,此类物质在添加时优选不过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。调配物可以进行杀菌且必要时与不有害地与免疫原或调配物的其它组分相互作用的助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香族物质等)混合。在一些实施方案中,本发明的免疫刺激组合物呈药学上可接受的盐形式施用。当使用时,盐应所述是药学上可接受的,但非药学上可接受的盐宜用以制备其药学上可接受的盐。此类盐包括(但不限于)由以下酸制备的盐:盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、顺丁烯二酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外,此类盐可以制备为碱金属或碱土金属盐,例如羧酸基的钠、钾或钙盐。
适合的缓冲剂包括(但不限于)乙酸和盐(1-2%w/v);柠檬酸和盐(1-3%w/v);硼酸和盐(0.5-2.5%w/v);以及磷酸和盐(0.8-2%w/v)。适合的防腐剂可以包括氯化苯甲烃铵(0.003-0.03%w/v);氯代丁醇(0.3-0.9%w/v);对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25%w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。
在一些实施方案中,疫苗组合物与一种或多种抗生素共同施用。举例来说,一种或多种抗生素可以与组合物一起、在其施用前和/或后施用。本发明不受共同施用的抗生素的类型限制。实际上,多种抗生素可以共同施用,包括(但不限于)β-内酰胺抗生素、青霉素(例如天然青霉素、氨基青霉素、耐青霉素酶的青霉素、羧基青霉素、脲基青霉素)、头孢菌素(第一代、第二代和第三代头孢菌素)和其它β-内酰胺(例如亚胺培南、单酰胺环类)、β-内酰胺酶抑制剂、万古霉素、氨基糖苷类和放线壮观素、四环素、氯胺苯醇、红霉素、林肯霉素、氯林肯霉素、利福平、甲硝哒唑、多粘菌素、强力霉素、喹诺酮(例如环丙沙星)、磺酰胺、三甲氧苄二氨嘧啶和喹啉。
存在大量抗微生物剂现用于治疗细菌、真菌和病毒感染。关于此类药物的一般类别和其作用机制的综论,熟练技工参考Goodman&Gilman的″The Pharmacological Basisof Therapeutics″编辑Hardman等人,第9版,Pub.McGraw Hill,第43章至第50章,1996,(以引用的方式整体并入本文中)。一般地,这些试剂包括抑制细胞壁合成的试剂(例如青霉素、头孢菌素、环丝氨酸、万古霉素、杆菌肽);和咪唑抗真菌剂(例如霉康唑、酮康唑和克霉唑);直接起作用以破坏微生物细胞膜的试剂(例如清洁剂,例如多粘菌素B和甲磺酸粘菌素,和抗真菌剂制霉菌素和两性霉素B);影响核蛋白体亚单位以抑制蛋白质合成的试剂(例如氯胺苯醇、四环素、红霉素和氯林肯霉素);改变蛋白质合成并引起细胞死亡的试剂(例如氨基糖苷类);影响核酸代谢的试剂(例如利福霉素和喹诺酮);抗代谢物(例如三甲氧苄二氨嘧啶和磺酰胺);以及用以抑制对DNA合成而言不可或缺的病毒性酶的核酸类似物,例如叠氮胸苷、根赛洛韦(gangcyclovir)、阿糖腺苷和无环鸟苷。可以采用抗微生物的各种组合。
本发明还包括涉及共同施用疫苗组合物的方法,疫苗组合物包含免疫原与一种或多种其它活性和/或免疫刺激剂(例如包含不同免疫原、抗生素、抗氧化剂等的组合物)。实际上,本发明的另一个方面提供通过共同施用本发明的组合物,用于增强现有技术免疫刺激方法(例如免疫接种方法)和/或药学组合物的方法。在共同施用程序中,试剂可以同时或连续施用。在一个实施方案中,本文中描述的组合物在其它活性剂之前施用。药学调配物和施用模式可以是本文中描述的任一调配物和模式。另外,两种或超过两种共同施用药剂可以各使用不同的模式(例如途径)或不同调配物施用。有待共同施用的其它药剂(例如抗生素、佐剂等)可以是本领域中众所周知的任一药剂,包括(但不限于)目前临床使用中的药剂。
在一些实施方案中,包含免疫原的组合物经由超过一个途径施用于受试者。举例来说,将得益于具有对病原微生物的保护性免疫反应(例如免疫性)的受试者可以得益于接受粘膜施用(例如鼻施用或本文中描述的其它粘膜途径)和另外得益于接受一种或多种其它施用途径(例如肠胃外或肺施用(例如经由喷雾器、吸入器或本文中描述的其它方法))。在一些优选实施方案中,经由粘膜途径施用足以诱导对免疫原或免疫原所来源于的生物体的粘膜免疫性以及全身免疫性。在其它实施方案中,经由多个途径施用用来提供粘膜免疫性与全身免疫性。因此,虽然实践本发明无需理解机制且本发明不限于任何特定的作用机制,但在一些实施方案中,预期经由多个施用途径(例如免疫接种(例如粘膜以及气道或肠胃外施用组合物))施用本发明组合物的受试者可以比仅仅经由一个途径施用组合物的受试者具有更强的对免疫原的免疫反应。
其它递送***可以包括时间释放、延迟释放或持续释放的递送***。此类***可以避免重复施用组合物,增加受试者和医师的便利。许多类型释放递送***可为一般技术者使用和已知。其包括基于聚合物的***,例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚乙二酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有上述聚合物的药物的微胶囊描述于例如以引用的方式并入本文中的美国专利号5,075,109。递送***还包括非聚合物***,即:脂质,包括固醇,例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪,例如单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯;水凝胶释放***;sylastic***;基于肽的***;蜡质涂层;使用常规的粘合剂和赋形剂的压制片;部分融合的植入物等等。特定实例包括(但不限于):(a)侵蚀***,其中本发明的药剂呈基质内的形式,例如各以引用的方式并入本文中的美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中描述的***;和(b)扩散***,其中活性组分以控制速率自聚合物渗透,例如各以引用的方式并入本文中的美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686中描述。另外,可以使用基于泵的硬件递送***,其中一些适宜植入。
在一些实施方案中,本发明的疫苗组合物以浓缩剂量调配,可以在施用于受试者前稀释。举例来说,浓缩组合物的稀释液可以施用于受试者,使得受试者接受本文中提供的特定剂量的任一个或更多个。在一些实施方案中,浓缩组合物的稀释可以使得向受试者施用(例如单剂)包含0.5%-50%纳米乳液和存在于浓缩组合物中的免疫原的组合物。涵盖浓缩组合物适用于大量受试者可以施用本发明组合物的背景中(例如免疫接种门诊、医院、学校等)。在一些实施方案中,包含本发明的免疫原的组合物(例如浓缩组合物)在室温下稳定超过1周,在一些实施方案中,超过2周,在一些实施方案中,超过3周,在一些实施方案中,超过4周,在一些实施方案中,超过5周,且在一些实施方案中,超过6周。
在一些实施方案中,初始施用本发明的组合物(例如初始免疫接种)后,受试者可以在第一次、第二次、第三次、第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次和/或超过第十次施用后接受一或多次加强施用(例如约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约10周、约3个月、约4个月、约6个月、约9个月、约1年、约2年、约3年、约5年、约10年)。虽然实践本发明无需理解机制且本发明不限于任何特定的作用机制,但在一些实施方案中,加强剂量中免疫原的再次引入使受试者中能够具有有力的全身免疫性。强化可以用针对初次免疫反应所给的相同调配物,或可以用含有免疫原的不同调配物。给药方案还将至少部分地由受试者的需要确定并取决于从业者的判断。
剂量单位可以基于若干因素(包括(但不限于)受试者的体重、年龄和健康状态)成比例地增加或减少。另外,随后施用(例如加强施用)的剂量单位可以增加或减少。
预期本发明的组合物和方法将用于各种背景,包括研究背景。举例来说,本发明的组合物和方法还用于免疫***的研究(例如适应性免疫反应例如保护性免疫反应(例如粘膜或全身免疫性))的表征)。本发明提供的组合物和方法的用途涵盖人类和非人类受试者和来自那些受试者的样品,以及涵盖使用这些受试者的研究应用。本发明的组合物和方法还适用于研究和最佳化白蛋白的变体、免疫原和其它组分以及用于筛选新的组分。因此,不意图本发明限于任何特定的受试者和/或应用背景。
本发明进一步提供包含本文中包含的疫苗组合物的试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包括施用疫苗必需、足够或适用的所有组分。举例来说,在一些实施方案中,试剂盒包含用于施用疫苗的装置(例如针或其它注射装置)、温度控制组件(例如冷冻或其它冷却组件)、卫生组件(例如用于卫生处理注射部位的酒精拭子)以及用于施用疫苗的说明书。
实施例1
白蛋白的变体的工程化
材料与方法
编码白蛋白的变体的表达载体的构建
pcDNA3载体(Invitrogen)用于克隆与编码GST的cDNA区段融合的编码小鼠和人类白蛋白的变体的cDNA。如先前描述,所有载体还编码埃-巴二氏病毒复制起点(OriP)(Andersen等人,Clinical biochemistry 43,367-372(2010);Berntzen,等人Journal ofimmunological methods 298,93-104(2005))。编码MSA和HSA基因(表1)的cDNA片段均排序且在来自GenScript Inc(NJ,USA)的pUC57载体中获得。pUC57载体侧接限制性位点HindIII和XhoI。编码氨基酸((GGS)4GG)的甘氨酸-丝氨酸(GS)段的DNA序列在N端融合GST序列。先前已经描述载体pcDNA3-HSAwt-GST-OriP和pcDNA3-HSAbartin-GST-OriP(Andersen等人,2010,上文)。
白蛋白的变体的产生
使用聚乙烯亚胺(PEIMax;MW 4000;Polysciences,Inc,Warrington)将附着HEK293E细胞瞬时转染。在转染前,细胞在T175瓶子(50ml)中生长至95%汇合。将62.5μg质粒DNA与3.75ml OptiMEM培养基(Invitrogen)(溶液1)和25μl PEI-MAX(6.45mg/ml)和3.75ml dH2O混合。接着混合溶液1和2,接着在室温下培育30分钟,接着混合物添加至接种细胞中。每隔一天收获上清液,多达转染后12天。
GSTrap FF柱(GE Healthcare,UK)用以纯化GST标记的MSA和HSA变体。柱与BioLogic工作站和记录仪(BIO-RAD)耦接,且根据制造商的方案进行纯化。简单地说,100ml1x PBS/0.05%叠氮化钠(pH 7.2)用以预先平衡柱,接着上清液用0.22μm真空过滤器(Corning)无菌过滤,其中0.05%叠氮化钠以1-2ml/min的流速施加。接着,200ml 1x PBS/0.05%叠氮化物用于冲洗非特异性结合。用在50mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀释的50ml 10mM还原麸胱甘肽(Sigma-Aldrich)洗脱结合的GST融合物。使用Amicon Ultra-10管柱(Millipore),收集洗脱部分,浓缩,且缓冲液转变为1x PBS/0.05%叠氮化物。所有洗脱份储存在-20℃下,浓度为0.5-1mg/ml。将柱洗涤且储存在20%乙醇中4℃下。
小鼠和人类FcRn的产生
基本上如先前描述,截短的单体的His标记的小鼠和人类FcRn(mFcRn和hFcRn)使用杆状病毒表达载体***产生(Kim等人,European journal of immunology 29,2819-2825(1999);Popov,S.等人Molecular immunology 33,521-530(1996))。使用供有Ni2+离子的HisTrap HP柱(GE Healthcare,UK)纯化受体。在使用前,柱用含有0.05%叠氮化钠的1xPBS预先平衡。上清液的pH值用1x PBS/0.05%叠氮化钠(pH 10.9)调整至pH 7.2,接着以5ml min-1的流速施加于HisTrap HP柱。用200ml 1x PBS和50ml 25mM咪唑/1x PBS先后洗涤后,用50ml 250mM咪唑/1x PBS(pH 7.2-7.4)洗脱结合的受体。使用Amicron Ultra-10柱(Millipore),将蛋白质浓缩且缓冲液转变为1x PBS,接着遵循制造方案,施加在HiLoad26/600Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上。将洗脱份汇集并使用Amicon Ultra柱(Millipore)浓缩且储存在4℃下。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
兔IgG(10μg/ml)(Southern Biotech)涂布在微量滴定孔(Nunc)中,且在4℃下培育过夜。接着在室温下将孔用PBS/4%脱脂乳阻断1小时,且在PBS/0.005%Tween20(PBS/T)pH 6.0中洗涤4次。可溶mFcRn或hFcRn(20μg/ml)在PBS/T/4%脱脂乳pH 6.0中稀释,添加至孔且在室温下培育1.5小时,接着如上所述洗涤。随后,在室温下GST标记的白蛋白的变体(5μg/ml)在PBS/T/4%脱脂乳pH 6.0中稀释且添加至孔,历时2小时。如上洗涤后,添加在PBS/T/4%脱脂乳pH 6.0中稀释(1∶4000)的辣根过氧化酶结合的抗-GST抗体(GE Healthcare)且培育1小时。随后,如上洗涤孔且使用四甲基对联苯胺底物(Calbiochem)检测结合的白蛋白的变体。添加100μl 1M HCl后使用Sunrise光谱仪(TECAN),在450nm下测量吸光度。
表面等离子体共振(SPR)
在BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)上进行SPR实验,且胺偶合(GEHealthcare)用于固定CM5芯片上GST融合的白蛋白的变体。基本上如制造商描述,注射10mM乙酸钠pH 5.0(GE Healthcare)中2μg/ml的每一个。芯片表面上未反应的部分用1M乙醇胺阻断。用磷酸盐缓冲液(67mm磷酸盐缓冲液、0.15M NaCl、0.005%Tween 20,在pH 6.0或7.4下)进行实验,以操作或稀释样品。通过在25℃下在pH 6.0或7.4下将单体His标记的hFcRn(1.0-0.015μM)注射在固定的白蛋白的变体上进行动力学测量,流速为50μL/min。动力学速率数值使用BIAevaluation 4.1软件提供的简单的朗缪尔1∶1配体结合模型计算。在所有亲和力估计中,通过统计数值χ2(表示平均平方)描述的拟合密集度低于2.0。为校正非特异性结合和整体缓冲作用,每个相互作用曲线减去从对照CM5表面和空白注射中获得的结合反应。
T84转胞吞分析
人类上皮细胞系T84(ATCC)维持于达伯克改良伊格尔培养基DMEM(Invitrogen)和HAM的F-12培养基(1∶1)(Invitrogen)中,供有10%热失活FBS、2mM Lg和50U/ml PS(均来自Bio-Wittaker)。细胞在37℃下在湿润的5%CO2、95%空气培育箱中培育。具有PTFE膜和0.4μm孔径的Transwell过滤器(1.12cm2)(Corning Costar,MA,USA)在生长培养基中培育过夜,接着1.0×106个细胞/孔接种。每日使用MILLICELL-ERS伏特欧姆仪(MILLIPORE)测量跨膜电阻(TER)。细胞培养4-6天,接着到达1000-1500Ω×cm2的TER值。生长培养基每日交换。
在实验前,洗涤T84单层,且在汉氏HBSS缓冲液(Invitrogen)中培育1小时。为测量顶部至基底外侧输送,200μl标准化的HSA变体(20-30μg/ml)添加至顶面,接着在0和4小时从具有500μl HBSS缓冲液的基底外侧储集器取样400μl培养基。
表1.编码白蛋白的变体的构建载体
结果
制备一系列在C端DIII内具有单点突变的与hFcRn的结合增加或减少的工程化HSA变体。此类HSA变体基于对hFcRn-HSA复合物的对接模型的检查构建(Andersen等人,Naturecommunications 3,610 2012)。这里,将突变选择引入HSA的DIII中以研究单点突变或者突变组合如何影响与hFcRn的结合。另外,一些突变变体与I523G组合(WO201211218A1;以引用的方式整体并入本文中)。
将以下5个单一突变体以及10个这些突变(如表1中列出)引入HSA的DIII中;E505Q(EQ)、T527M(TM)、I523G(IG)、K573Y(KY)和K573P(KP)。除制备WT HSA外,基于先前显示极大地减少与hFcRn结合的两点突变的组合,制备双重突变体K500A/H510Q(KA/HQ)(Andersen等人,2012,上述)。突变氨基酸在图2中HSA的晶体结构图解中突出显示。
图2展示HSA的晶体结构。HSA的DIII内突变的氨基酸位置的结构位置。该图展示HSA的整个结构构造。DI-DII和DIII分别以灰色和浅灰色展示,而突变的位置以有色球突出显示,K500A(KA)、H510Q(HQ)(KA/HQ)、E505Q(EQ)、T527M(TM)I523G(IG)、K573Y(KY)和K573P(KP)。使用关于HSA5的结晶学数据和程序PyMOL制成图解。
图3展示用于构建具有C端融合抗原的白蛋白的克隆卡匣的示意性概述。编码全长白蛋白的cDNA亚克隆至限制性位点HindIII和XhoI中,而仅仅编码DIII区段的cDNA片段亚克隆至限制性位点BamHI和XhoI上。BamHI限制性位点通过沉默突变引入白蛋白cDNA序列中以允许DIII亚克隆。在cDNA编码白蛋白与融合GST蛋白质之间引入GS-连接子序列。编码抗原的cDNA亚克隆至限制性位点XhoI和ApaI上。
图4展示纯化的白蛋白-GST变体的SDS-PAGE分析。(A)HSA-GST变体和(MSA-GST变体)的代表性非还原SDS-PAGE凝胶分析。3μg每种变体施加在凝胶上。HSA和MSA变体通过HEK293E细胞瞬时转染产生。除全长变体外,包括先前展示不结合hFcRn1的缺乏几乎全部DIII的截短HSA变体(Bartin)。在施加至GSTrap FF柱前将收获的上清液汇集和过滤。使用非还原SDS-PAGE,接着考马斯染色,分析纯化变体的完整性。除在约70kDa的分子量下迁移的HSA Bartin外,所有变体都迁移为对应于100-110kDa的主要色带,都与预期分子量一致。
为比较在酸性pH值下白蛋白融合物的结合能力,将滴定量的标准化HSA GST变体添加至捕捉在兔IgG上的hFcRn,且结合的白蛋白的变体使用来自山羊的HRP结合的抗-GST抗体检测(图5A至图5D)。计算与hFcRn的结合,其中WT HSA的结合被设定成1.0(图5C)。在单点突变体中,EQ、IG和TM展示结合中度改善,比WT多2-3倍,接着为KP和KY,其比WT结合强烈5倍。组合两或三个突变引起结合进一步增加,其中突变体KP/IG、KY/EQ/TM和KY/IG/TM展示与KY/IG和KP/IG/TM之后KY相比,结合略微提高,而检测到KY/TM、KP/TM和KP/EQ/TM结合最强烈,展示结合强度提高6倍。因此,在单一突变体中,KY和KP结合最强烈,而这些与TM和EQ的组合得到最佳结合剂。
为比较在酸性pH值下白蛋白融合物的结合能力,将滴定量的标准化MSA和HSA-GST变体添加至捕捉在兔IgG上的hFcRn(图6A)和mFcRn(图6B至图6D),且结合的白蛋白的变体使用来自山羊的HRP结合的抗-GST抗体检测。
计算与hFcRn(图6A)和mFcRn(图6B至图6D)的结合,其中WT MSA的结合被设定成1.0(图7)。KP展示与hFcRn的结合比MSA强烈3倍,且该受体与MSA结合比与HSA结合更强烈。HSA和MSA KA/HQ突变体不结合于hFcRn或mFcRn。另外,未检测到mFcRn对HSA的结合。在单点突变体中,它们中无一个与mFcRn的结合比MSA强,而KP与IG的组合引起结合中度提高,比WTMSA多2倍。此外,以下组合KP/TM、KP/IG/TM和KP/EQ/TM与WT MSA相比,相对结合提高4-6倍。
感测器图谱(图8)展示在酸性pH值下与hFcRn的结合差异大。结合曲线与1∶1结合模型拟合且推导的结合动力学在表2中列出。这里,与GST的融合展示对与hFcRn的结合的负面影响极小,与先前结果一致(Andersen等人,J Biol Chem.2013年8月16日;288(33):24277-85)。EQ和IG突变体展示与hFcRn的结合超过WT对应物6倍,而IA结合几乎与这些突变体一样好。此外,KP突变体结合提供14倍,而三重突变体EQ/TM/KP展示最大提高,对应于超过180倍。
完全确定FcRn跨越上皮屏障输送IgG的能力(Dickinson等人,1999;McCarthy等人,2000)。然而,尚未证明在上皮细胞中表达的FcRn是否可以输送HSA。因此,为研究HSA是否可以通过FcRn依赖性方式跨越表达内源性hFcRn的上皮层输送,使用Tanswell***测量FcRn介导的IgG输送。首先,将WT HSA与KA/HQ比较,且将等量的这些添加至Transwell***的顶部储集器,其中人类上皮细胞系T84生长为极化单层。在添加至顶面后的时间点0和4小时从基底外侧储集器处收集样品。使用ELISA定量输送的HSA融合物,其中融合物捕捉在抗-GST抗体上且使用HRP结合的抗-HSA抗体检测结合的融合物。检测到输送功效的显著差异,因为WT融合物输送比缺乏与hFcRn的结合的双重突变体多5倍(图9)。因此,这些数据强烈支持在人类上皮中表达的FcRn能够跨越细胞层将HSA转胞吞。
接着,评估与hFcRn的结合提高的HSA变体是否比其WT对应物转胞吞更有效。发现与WT相比,单一KP突变的引入增加输送功效几乎3倍(图9)。
表2.
实施例2
制备在C端DIII内具有单点突变的各与hFcRn的结合增加的工程化HSA变体。HSA变体基于对hFcRn-HSA复合物1和V547的对接模型的检查构建(如ElevenBiopharmaceuticals(WO 2013075066A2)描述)。这里,将突变组合引入HSA的DIII中以研究其如何影响与hFcRn的结合。
材料与方法
编码白蛋白的变体的表达载体的构建
pcDNA3载体(Invitrogen)用于克隆与编码GST的cDNA融合的编码人类血清白蛋白的变体的cDNA。所有载体还编码埃-巴二氏病毒复制起点(OriP),如先前描述(Andersen等人,2010,上文;Berntzen等人,上文)。编码HSA基因的cDNA片段均排序且在来自GenScriptInc(NJ,USA)的pUC57载体中获得。pUC57载体侧接限制性位点HindIII和XhoI。编码氨基酸((GGS)4GG)的甘氨酸-丝氨酸(GS)段的DNA序列在N端融合GST序列。先前已经描述载体pcDNA3-HSAwt-GST-OriP(Andersen等人,2010,上文)。
白蛋白的变体的产生
使用聚乙烯亚胺(PEIMax;MW 4000;Polysciences,Inc,Warrington)将附着HEK293E细胞瞬时转染。在转染前,细胞在T175瓶子(50ml)中生长至95%汇合。将62.5μg质粒DNA与3.75ml OptiMEM培养基(Invitrogen)(溶液1)和25μl PEI-MAX(6.45mg/ml)和3.75ml dH2O混合。接着混合溶液1和2,接着在室温下培育30分钟,接着混合物添加至接种细胞中。每隔一天收获上清液,多达转染后12天。
GSTrap FF柱(GE Healthcare,UK)用以纯化GST标记的HSA变体。柱与BioLogic工作站和记录仪(BIO-RAD)耦接,且根据制造商的方案进行纯化。简单地说,100ml 1x PBS/0.05%叠氮化钠(pH 7.2)用以预先平衡柱,接着上清液用0.22μm真空过滤器(Corning)无菌过滤,其中0.05%叠氮化钠以1-2ml/min的流速施加。接着,200ml 1x PBS/0.05%叠氮化物用于冲洗非特异性结合。用在50mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀释的50ml 10mM还原麸胱甘肽(Sigma-Aldrich)洗脱结合的HSA GST融合物。使用Amicon Ultra-10管柱(Millipore),收集洗脱部分,浓缩,且缓冲液转变为1x PBS/0.05%叠氮化物。所有洗脱份储存在-20℃下,浓度为0.5-1mg/ml。将柱洗涤且储存在20%乙醇中4℃下。
人类FcRn的产生
基本上如先前描述,截短的单体的His标记的人类FcRn(hFcRn)使用杆状病毒表达载体***产生(Kim等人,上文;Popov等人,上文)。使用供有Ni2+离子的HisTrap HP柱(GEHealthcare,UK)纯化受体。在使用前,柱用含有0.05%叠氮化钠的1x PBS预先平衡。上清液的pH值用1x PBS/0.05%叠氮化钠(pH 10.9)调整至pH 7.2,接着以5ml min-1的流速施加于HisTrap HP柱。用200ml 1x PBS和50ml 25mM咪唑/1x PBS先后洗涤后,用50ml 250mM咪唑/1x PBS(pH 7.2-7.4)洗脱结合的受体。使用Amicron Ultra-10柱(Millipore),将蛋白质浓缩且缓冲液转变为1x PBS,接着遵循制造方案,施加在HiLoad 26/600Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上。将洗脱份汇集并使用Amicon Ultra柱(Millipore)浓缩且储存在4℃下。
表面等离子体共振(SPR)
在BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)上进行SPR实验,且胺偶合(GEHealthcare)用于固定CM5芯片上GST融合的HSA。基本上如制造商描述,注射10mM乙酸钠pH5.0(GE Healthcare)中2μg/ml的每一个。芯片表面上未反应的部分用1M乙醇胺阻断。用磷酸盐缓冲液(67mm磷酸盐缓冲液、0.15M NaCl、0.005%Tween 20,在pH 6.0或7.4下)进行实验,以操作或稀释样品。通过在25℃下在pH 6.0下将单体His标记的hFcRn(1.0-0.015μM)注射在固定的HSA上进行动力学测量,流速为50μl/min。动力学速率数值使用BIAevaluation4.1软件提供的简单的朗缪尔1∶1配体结合模型计算。在所有亲和力估计中,通过统计数值χ2(表示平均平方)描述的拟合密集度低于2.0。为校正非特异性结合和整体缓冲作用,每个相互作用曲线减去从对照CM5表面和空白注射中获得的结合反应。
结果
表3. HSA DII突变体对于hFcRn的结合动力学
HSA变体固定(约500RU)在芯片上并注射hFcRn的连续稀释液。使用简单的一阶(1∶1)双分子相互作用模型,获得动力学速率常数。动力学值表示三个值的平均值。结果展示于表3和图10中。
在pH 6.0下,与K573P组合的V547A与WT HSA相比,KD提高超过200倍,且其结合很依赖于pH值。
与E505Q、T527M和K573P组合的V547A与WT HSA相比,KD提高超过1400倍,但其结合不太依赖于pH值。
靶向的氨基酸残基在图2中HSA的晶体结构图解中突出显示。
实施例3
具有改变的与hFcRn的结合的HSA变体的设计
已经制备一系列在C端DIII内具有单点突变的与hFcRn的结合增加或减少的工程化HSA变体。此类HSA变体基于对hFcRn-HSA复合物的对接模型的检查构建(Andersen等人,Nature communications 3,610 2012)。这里,将突变选择引入HSA的DIII中以研究单点突变或者突变组合如何影响与hFcRn的结合。另外,一些突变变体与I523G或V547A组合(WO201211218A1和WO 2013075066A2;以引用的方式整体并入本文中)。
将以下六个单一突变体以及这些突变的10个组合(如表4中列出)引入HSA的组合DIII中:E505Q(EQ)、T527M(TM)、I523G(IG)、V547A(VA)、K573Y(KY)和K573P(KP)。除制备WTHSA外,基于先前显示极大地减少与hFcRn结合的两点突变的组合,制备双重突变体K500A/H510Q(KA/HQ)(Andersen等人,2012,上文)。突变氨基酸在图2中HSA的晶体结构图解中突出显示。
表4.编码白蛋白GST变体的构建载体
编码HSA变体的表达载体的构建
pcDNA3载体(Invitrogen)用于克隆与编码GST标签的cDNA融合的编码HSA变体的cDNA。所有载体还编码埃-巴二氏病毒复制起点(OriP),如先前描述(Andersen等人,Clinical biochemistry 43,367-372;Berntzen等人,(2005)Journal of immunologicalmethods 298,93-104)。编码HSA基因的cDNA片段均排序且在来自GenScript Inc(NJ,USA)的pUC57载体中获得。pUC57载体侧接限制性位点HindIII和XhoI。编码氨基酸((GGS)4GG)的甘氨酸-丝氨酸(GS)段的DNA序列在N端融合GST序列。先前已经描述载体pcDNA3-HSAwt-GST-OriP和pcDNA3-HSAbartin-GST-OriP(Anderson等人,2010,上文)。
HSA融合物变体的产生
使用聚乙烯亚胺(PEIMax;MW 4000;Polysciences,Inc,Warrington)将附着HEK293E细胞瞬时转染。在转染前,细胞在T175瓶子(50ml)中生长至95%汇合。将62.5μg质粒DNA与3.75ml OptiMEM培养基(Invitrogen)(溶液1)和25μl PEI-MAX(6.45mg/ml)和3.75ml dH2O混合。接着混合溶液1和2,接着在室温下培育30分钟,接着混合物添加至接种细胞中。每隔一天收获上清液,多达转染后12天。
GSTrap FF柱(GE Healthcare,UK)用以纯化GST标记的HSA变体。柱与BioLogic工作站和记录仪(BIO-RAD)耦接,且根据制造商的方案进行纯化。简单地说,100ml 1x PBS/0.05%叠氮化钠(pH 7.2)用以预先平衡柱,接着上清液用0.22μm真空过滤器(Corning)无菌过滤,其中0.05%叠氮化钠以1-2ml/min的流速施加。接着,200ml 1x PBS/0.05%叠氮化物用于冲洗非特异性结合。用在50mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀释的50ml 10mM还原麸胱甘肽(Sigma-Aldrich)洗脱结合的HSA GST融合物。使用Amicon Ultra-10管柱(Millipore),收集洗脱部分,浓缩,且缓冲液转变为1x PBS/0.05%叠氮化物。所有洗脱份储存在-20℃下,浓度为0.5-1mg/ml。将柱洗涤且储存在20%乙醇中4℃下。
人类FcRn的产生
基本上如先前描述,截短的单体的His标记的人类FcRn使用杆状病毒表达载体***产生(Kim等人,(1999)European journal of immunology 29,2819-2825;Popov等人,(1996)Molecular immunology 33,521-530)。使用供有Ni2+离子的HisTrap HP柱(GEHealthcare,UK)纯化受体。在使用前,柱用含有0.05%叠氮化钠的1x PBS预先平衡。上清液的pH值用1x PBS/0.05%叠氮化钠(pH 10.9)调整至pH 7.2,接着以5ml min-1的流速施加于HisTrap HP柱。用200ml 1x PBS和50ml 25mM咪唑/1x PBS先后洗涤后,用50ml 250mM咪唑/1x PBS(pH 7.2-7.4)洗脱结合的受体。使用Amicron Ultra-10柱(Millipore),将蛋白质浓缩且缓冲液转变为1x PBS,接着遵循制造方案,施加在HiLoad 26/600Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上。将洗脱份汇集并使用Amicon Ultra柱(Millipore)浓缩且储存在4℃下。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
通过在微量滴定孔(Nunc)中用4-羟基-3-碘-5-硝基苯基乙酸(10μg/ml)特异性涂布抗人类IgG1突变变体,进行GST融合的HSA变体(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)的筛选。盘在4℃下培育过夜,接着在室温下孔用PBS/4%脱脂乳阻断1小时,接着在PBS/T pH6.0中洗涤4次。在室温下恒定量的His标记的hFcRn(20μg/ml)在PBS/T/4%脱脂乳pH 6.0中稀释,添加至孔,且培育2小时,接着如上洗涤孔。随后,在室温下5μg/ml GST标记的WT HSA和突变变体在PBS/T/4%脱脂乳pH 6.0中稀释,且添加至孔,历时2小时。如上洗涤后,接着添加在PBS/T/4%脱脂乳pH 6.0中稀释(1∶3000)的辣根过氧化酶结合的抗-GST抗体(GEHealthcare)且培育1小时。洗涤后,使用四甲基对联苯胺底物(Calbiochem)检测结合的HSA变体。使用Sunrise光谱仪(TECAN),在620nm下测量吸光度。
表面等离子体共振(SPR)
在BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)上进行SPR实验,且胺偶合(GEHealthcare)用于固定CM5芯片上GST融合的HSA变体。基本上如制造商描述,注射10mM乙酸钠pH 5.0(GE Healthcare)中2μg/ml的每一个。芯片表面上未反应的部分用1M乙醇胺阻断。用磷酸盐缓冲液(67mm磷酸盐缓冲液、0.15M NaCl、0.005%Tween 20,在pH 6.0或7.4下)进行实验,以操作或稀释样品。通过在25℃下在pH 6.0下将单体His标记的hFcRn(1.0-0.015μM)注射在固定的HSA变体上进行动力学测量,流速为50μl/min。动力学速率数值使用BIAevaluation 4.1软件提供的简单的朗缪尔1∶1配体结合模型计算。在所有亲和力估计中,通过统计数值χ2(表示平均平方)描述的拟合密集度低于5.0。为校正非特异性结合和整体缓冲作用,每个相互作用曲线减去从对照CM5表面和空白注射中获得的结合反应。
HSA变体与羧基涂布的Molday ION的偶合。
用100MWCO离心柱(Millipore),将1.5ml CL-30Q02-CA(5mg Fe/ml)(BioPal)缓冲液转变为50mM MES(pH 5.5)。通过分别添加600μl和900μl EDC和NHS溶液(GE healthcare)来活化羧基,接着在室温下在转轮上培育20分钟。为去除未反应的试剂,遵循管柱制造商的指导,活化粒子通过经50mM MES缓冲液(pH 5.5)平衡的NAP-G-25柱(GE healthcare)。使用每毫升CL-30Q02-CA 2mg HSA变体(溶于0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)),且在混合后在室温下在转轮上培育120分钟。随后,用100MWCO离心管柱(Millipore),将偶合粒子缓冲液转变为1x PBS/0.05%叠氮化物,且储存在4℃。
T84转胞吞分析
人类上皮细胞系T84(ATCC)维持于达伯克改良伊格尔培养基DMEM(Invitrogen)和HAM的F-12培养基(1∶1)(Invitrogen)中,供有10%热失活FBS、2mM Lg和50U/ml PS(均来自Bio-Wittaker)。细胞在37℃下在湿润的5%CO2、95%空气培育箱中培育。具有PTFE膜和0.4μm孔径的Transwell过滤器(1.12cm2)(Corning Costar,MA,USA)在生长培养基中培育过夜,接着1.0×106个细胞/孔接种。每日使用MILLICELL-ERS伏特欧姆仪(MILLIPORE)测量跨膜电阻(TER)。细胞培养4-6天,接着到达1000-1500Ω×cm2的TER值。生长培养基每日交换。
在实验前,洗涤T84单层,且在汉氏HBSS缓冲液(Invitrogen)中培育1小时。为测量顶部至基底外侧输送,与Molday ION(100ml/ml,用1M MES调整,pH 6.0)偶合的200μl标准化的HSA变体(20-30μg/ml)或HSA变体添加至顶面,接着在0和4小时从具有500μl HBSS缓冲液的基底外侧储集器取样400ml培养基。在测量相反方向上输送的分析中,500μl HSA(8μg/ml)添加至基底外侧面,接着在0和4小时从具有200μl HBSS缓冲液的顶部储集器取样150μl培养基。
使用ELISA定量跨越T84细胞的HSA变体和偶联物的输送。浓度已知的HSA变体用作标准。来自山羊的抗-GST抗体(1∶5000稀释)(GE healthcare)或来自山羊的抗-HSA抗体(1∶2000稀释)(Sigma)在1x PBS中涂布于96孔NUNC盘中且在4℃下培育隔夜。接着,孔使用200μl 4%S/PBS阻断1小时,接着用PBS/T洗涤4次,接着添加滴定量的在S/T/PBS中稀释的收获培养基。盘在室温下培育1小时,接着如上洗涤。随后,添加来自小鼠的HRP结合的抗-HSA抗体(Abcam),在S/T/PBS中稀释1∶5000,且在室温下培育1小时。盘如上洗涤,接着添加100μl3,3′,5,5′-四甲基对联苯胺溶液(Merck)。使用Sunrise光谱仪(TECAN)在620nm下测量吸光度。
结果
为比较在中性pH值下HSA融合物的结合能力,将滴定量的标准化HSA-GST变体添加至捕捉在人类IgG突变体上的hFcRn,且结合的HSA-GST变体使用来自山羊的HRP结合的抗GST抗体检测(图11F),其展示突变变体中无一个在中性pH值下结合受体(图11)。
为比较在酸性pH值下HSA融合物的结合能力,将滴定量的标准化HSA-GST变体添加至捕捉在人类IgG突变体上的hFcRn,且结合的HSA-GST变体使用来自山羊的HRP结合的抗-GST抗体检测。KP和VA同等结合且显著比WT多,而KP/VA的组合进一步提高,而KP/EQ/TM/VA在所有突变体中在pH 6.0下结合最强。在中性pH下,除强烈结合的KP/EQ/TM/VA外,突变变体中无一个展示可检测的结合。
为研究HSA是否可以通过FcRn依赖性方式跨越表达内源性hFcRn的上皮层输送,使用Transwell***测量FcRn介导的IgG输送。首先,测量两个方向上的未融合的WT HSA和KP的输送。仅仅测量到从顶部至基底外侧方向的有效输送,其中展示KP输送比WT多(图15)。在基底外侧至顶部方向上,展示仅仅输送微量的KP变体,而WT未检测到(图13)。
此外,WT HSA-GST与KA/HQ-GST比较,且将等量的这些添加至Transwell***的顶部储集器。在添加至顶面后的时间点0和4小时从基底外侧储集器处收集样品。使用ELISA定量输送的HSA融合物,其中融合物捕捉在抗-GST抗体上且使用HRP结合的抗-HSA抗体检测结合的融合物。检测到输送功效的显著差异,因为WT融合物输送比缺乏与hFcRn的结合的双重突变体(KA/HQ)多5倍(图14)。因此,这些数据强烈支持在人类上皮中表达的FcRn能够跨越细胞层将HSA转胞吞。接着,评估与hFcRn的结合提高的HSA变体(KP)是否比WT对应物转胞吞更有效(图14)。发现与WT相比,单一KP突变的引入增加输送功效几乎3倍(图16)。单一突变体EQ和TM输送比WT更有效,远胜KP,而与KP相比,KP/TM/EQ的组合引起输送增强大致2倍(图14)。
接着,VA的从顶部至基底外侧面的转胞吞作用与KP/VA和KP/TM/EQ/VA比较,且发现KP/VA输送比VA更有效3倍(图15),而在两种pH条件下强烈结合的KP/TM/EQ/VA不输送(图15)。
接着解决偶联于HSA的NP是否可以跨越极化细胞层穿梭。WT HSA和KA/HQ经由FcRn结合位点远端的DI内的游离半胱氨酸残基,位点特异性偶联于NP。将NP添加至顶面且将跨越细胞输送且在基底外侧释放的量定量并展示偶联于WT HSA的NP比KA/HQ多2倍(图16)。
以上说明书中所提及的所有出版物和专利以引用的方式并入本文中。在不脱离本发明的精神和范围下本领域技术人员显而易见本发明所描述的方法和***的各种修改和变化。虽然本发明已经结合特定优选的实施方案描述,应了解如要求的本发明不应过度局限于此类特定实施方案。实际上,相关领域技术人员显而易见的用于进行本发明的所述模式的各种修改意图在以下权利要求书范围内。
序列表
<110> University of Oslo
<120> 白蛋白的变体及用途
<130> INVEN-33582/WO-1/ORD
<150> US 61/936,442
<151> 2014-02-06
<150> US 61/898,823
<151> 2013-11-01
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
Claims (43)
1.一种变体人类血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白多肽(MSA),其以相对于野生型HSA或MSA增加的亲和力结合于FcRn,其中所述多肽包含至少一个变体氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽,其中所述多肽以10nM或更小的Kd结合于HSA或MSA。
3.如权利要求2所述的多肽,其中所述多肽以5nM或更小的Kd结合于HSA或MSA。
4.如权利要求2所述的多肽,其中所述多肽以1nM或更小的Kd结合于HSA或MSA。
5.如权利要求2至4中任一项所述的多肽,其中所述Kd在酸性pH值下测量。
6.如权利要求1至5中任一项所述的多肽,其中所述多肽以高于野生型白蛋白的水平跨越极化人类细胞输送。
7.如权利要求6所述的多肽,其中所述输送水平在极化人类细胞分析中4小时后以ng/ml测量。
8.如权利要求7所述的多肽,其中所述较高水平比野生型白蛋白高至少两倍。
9.如权利要求7所述的多肽,所述较高水平为比野生型白蛋白高至少三倍。
10.如权利要求7所述的多肽,其中所述较高水平为比野生型白蛋白高至少5倍。
11.如权利要求1至10中任一项所述的多肽,其中所述变体多肽与SEQ ID NO:1至少80%一致。
12.如权利要求1至10中任一项所述的多肽,其中所述变体多肽与SEQ ID NO:1至少90%一致。
13.如权利要求1至10中任一项所述的多肽,其中所述变体多肽与SEQ ID NO:1至少95%一致。
14.如权利要求1至13中任一项所述的多肽,其中所述取代在SEQ ID NO:1的氨基酸547、573、523、253、527、500和505或MSA的位置500或510中的一个或多个。
15.如权利要求14所述的多肽,其中所述取代选自由以下组成的组:SEQ ID NO:1的K573Y、I523G、I523A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M或K500A/H510Q、HAS的结构域III的缺失或野生型MSA的K500A/H510Q。
16.一种变体人类血清白蛋白(HSA)多肽,其中所述多肽包含在选自由以下组成的组的SEQ ID NO:1的位置的一个或多个取代:547、573、523、253、527、500和505。
17.如权利要求16所述的多肽,其中所述取代选自由以下组成的组:K573Y、I523G、I523A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M和K500A/H510Q。
18.一种变体人类血清白蛋白多肽,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的结构域III的缺失。
19.一种变体小鼠血清白蛋白(MSA)多肽,其中所述多肽包含在野生型MSA的位置500和/或510的取代。
20.如权利要求19所述的多肽,其中所述取代是野生型MSA的K500A/H510Q。
21.一种融合蛋白,其包含a)白蛋白的变体、其片段或其融合物;和b)偶联物。
22.如权利要求21所述的融合蛋白,其中所述白蛋白的变体以与野生型白蛋白相比,以增加的结合亲和力结合于FcRn。
23.如权利要求22所述的融合蛋白,其中所述白蛋白的变体为如权利要求1至20中任一项所述的白蛋白的变体。
24.如权利要求21所述的融合蛋白,其中所述偶联物共价附接于包含硫醇基的氨基酸。
25.如权利要求21至24中任一项所述的融合蛋白,其中所述偶联物为免疫原。
26.如权利要求25所述的融合蛋白,其中所述免疫原在受试者中诱导免疫反应。
27.一种核酸,其编码如权利要求1至26中任一项所述的多肽或融合蛋白。
28.一种宿主细胞,其包含如权利要求27所述的核酸。
29.一种疫苗组合物,其包含如权利要求21至26中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂。
30.一种在受试者中诱导免疫反应的方法,其包括在使得所述受试者产生免疫反应的条件下向所述受试者施用如权利要求29所述的疫苗组合物。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述疫苗被递送至受试者的粘膜表面。
32.如权利要求30所述的方法,其中所述疫苗鼻内或通过吸入递送。
33.一种如权利要求29所述的疫苗组合物的用途,其用于在受试者中引起免疫反应。
34.一种如权利要求21至26中任一项所述的融合蛋白的用途,其用于疫苗组合物中。
35.一种疫苗组合物,其包含:
a)包含野生型白蛋白多肽和偶联物的融合蛋白;和
b)药学上可接受的载剂。
36.如权利要求35所述的疫苗组合物,其中所述偶联物是免疫原。
37.如权利要求35所述的疫苗组合物,其中所述疫苗进行气雾化。
38.一种在受试者中诱导免疫反应的方法,其包括在使得所述受试者对所述免疫原产生免疫反应的条件下向所述受试者施用如权利要求34至36中任一项所述的疫苗组合物。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述疫苗组合物被递送至所述受试者的粘膜表面。
40.如权利要求38所述的方法,其中所述疫苗组合物鼻内递送。
41.一种如权利要求35至37中任一项所述的疫苗组合物的用途,其用于在受试者中对所述免疫原产生免疫反应。
42.如权利要求40所述的用途,其中所述疫苗组合物被递送至所述受试者的粘膜表面。
43.如权利要求40所述的用途,其中所述疫苗组合物鼻内递送。
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