CN105986015A - 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供基于高通量测序的捕获和标记多样本的一个或多个靶序列的方法或试剂盒。本发明整合了多重扩增技术、连接技术和PCR‑index技术,提供了一种新型标记技术方案,使用特异性捕获引物扩增靶序列,利用连接反应在PCR产物的两端各引入一个带U碱基且序列已知的接头,用USER酶切开U碱基,根据接头已知序列设计PCR引物,并利用PCR反应在PCR产物两端分别引入标签引物,通过PCR产物两端引入的标签引物序列特异地得到PCR产物的样本信息,再根据每个靶序列的捕获引物序列将测序结果对应到样本的每个靶序列上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及捕获和标记多个样本的靶序列的方法和试剂盒,特别是涉及一种基于高通量测序的捕获和标记多样本的一个或多个靶序列的方法或试剂盒。
背景技术
新一代高通量测序仪的出现大大降低了核酸测序成本,其具有高通量、低成本、测序错误率低等特点。应用第二代高通量测序技术,可以对混合的核酸分子进行序列测定,同时分辨和测出每个独立的序列,使得该测序技术在高通量标记开发成为可能。
随着高通量测序技术在人类疾病研究、微生物基因组测序等方面的广泛开展,如何最大限度发挥第二代测序技术的高通量和大数据量等特点,降低单样本测序成本成为下一步测序技术的发展方向,具有很大的市场前景和价值。
然而,常规的PCR-index技术,对于每个PCR产物的index标签都是需要单独进行扩增标记,然后将所有的产物混合测序,当PCR片段较多时,不仅操作繁琐,而且很难控制片段混合的均一性,会导致最终测序结果中片段之间数据量差距巨大。
发明内容
本发明的目的是利用高通量测序技术对大量样本中的靶序列相关序列同时进行测序分析,解决传统方法通量低、测序成本高的问题,扩大第二代测序技术在PCR测序领域的应用。
针对本发明的目的,本发明整合了多重扩增技术、连接技术和PCR-index技术,提供了一种新型标记技术方案,使用特异性捕获引物扩增靶序列(第一轮扩增),利用连接反应在第一轮PCR产物的两端各引入一个带U碱基且序列已知的接头,用USER酶切开U碱基,根据接头已知序列设计标签引物,并利用PCR反应(第二轮扩增)在第二轮PCR产物两端分别引入标签引物序列,通过第二轮PCR产物两端引入的标签引物序列可以特异地得到PCR产物的样本信息,再根据第二轮扩增产物中所含有的捕获引物序列将测序结果对应到样本的每个靶序列上。
根据本发明的一个方面,提供一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的方法,包括以下步骤:
第一轮扩增:使用根据靶序列设计的捕获引物,在适于多重扩增目的核酸的条件下分别对各样本的目标区域进行扩增,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
第二轮扩增:使用第一轮扩增得到的产物作为模板进行第二轮扩增以使第二轮扩增产物上带有可对各样本进行区分的标签;
混合与回收:将各样本的富集扩增产物均一地混合在一起,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
测序:将回收的DNA混合物进行测序;
分析:基于每个样本的扩增产物中独特的标签,将获得的测序结果首先与样本一一对应;根据每个靶序列的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的靶序列上。
优选地,根据本发明的一个方面,提供一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的方法,包括以下步骤:
第一轮扩增:使用根据靶序列设计的捕获引物,在适于多重扩增目的核酸的条件下分别对各样本的目标区域进行扩增,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带,对扩增产物进行末端修复并加A尾;
接头设计:所述接头包含两个回文序列、U碱基和3’T末端,其中,一个回文序列位于所述接头5’端,通过U碱基与另一个回文序列连接,其可稳定形成发卡结构;
连接接头(Adaptor):通过连接反应在第一轮扩增产物的两端加上带U碱基的接头;进行U碱基剪切,并用单链消化酶消化剩余的引物;
标签引物设计:所述标签引物包含标签序列和与所述接头的5’端回文序列互补的序列,其中,所述标签序列位于所述标签引物的5’端,其中,标签序列的数量×接头的数量≥样本数量;
第二轮扩增:使用针对接头和各样本设计的标签(index)引物,以对应样本连接接头后的产物作为模板进行富集扩增,并用单链消化酶消化剩余的引物,以分别给每个样本的扩增产物都加上可以区分的标签引物序列;
混合与回收:将各样本的富集扩增产物均一地混合在一起,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
测序:将回收的DNA混合物进行测序;
分析:基于每个样本的扩增产物中独特的标签引物序列,将获得的测序结果首先与样本一一对应;根据每个靶序列的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的每个靶序列上。
优选地,本发明提供了一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的方法,包括以下步骤:
1)引物和接头设计:
第一轮扩增引物:根据待测的靶序列设计相应的捕获引物,组成第一轮扩增引物组合;
接头序列:设计一个或多个接头序列,所述接头包含两个回文序列、U碱基和3’T末端,其中,一个回文序列位于所述接头5’端,通过U碱基与另一个回文序列连接,其可稳定形成发卡结构;
第二轮扩增引物:根据样本数量设计不同的标签序列,并在其3’端加上与所述接头的5’端回文序列互补的序列组成富集扩增所用的标签引物,组成第二轮扩增引物组合,其中,由于第二轮扩增的靶序列两端连接的接头相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同,设计的标签引物的数量遵循以下规则:标签序列的数量×接头的数量≥样本数量,以及其中,在第二轮扩增引物中,标签序列上添加的序列与第一轮扩增产物中连接的接头的5’端回文序列互补;
2)第一轮扩增(PCR捕获):将扩增靶序列的捕获引物混合,在适于多重扩增目的核酸的条件下分别对各样本进行扩增;回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带,对扩增产物进行末端修复,并将扩增产物的两个末端都加上A尾;
3)连接接头(Adaptor):通过连接反应在扩增产物两端加上带U碱基的接头,使用USER酶打断U碱基,用单链消化酶消化剩余的引物;
4)第二轮扩增(产物富集):根据不同样本和接头设计的标签引物,使用对应样本连接接头处理后的产物作为模板进行富集扩增,以分别给每个样本的扩增引物都加上可以区分的标签引物序列;用单链消化酶消化剩余的引物,并进行纯化;
5)混合与回收:将各样本的富集产物均一地混合在一起;回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
6)测序:将DNA混合物进行测序;
7)分析:基于每个样本独特的标签引物序列,将获得的测序结果首先与样本一一对应;根据每个靶序列的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的每个靶序列上。
优选地,步骤1中,所述标签序列的长度可以为5-20bp,更优选地,所述标签序列的长度可以为6-8bp;所述接头序列中包含两个区域的回文序列,优选地,每个回文序列可以为8-15bp(最优选为15bp)。
优选地,步骤2中,扩增所采用的体系为高保真多重PCR反应体系,以减少扩增所带来的DNA突变,并保证各目的片段能得到有效扩增;
优选地,步骤2中,PCR扩增进行18-20个循环。
优选地,步骤4中,扩增所采用的酶为高保真DNA聚合酶,由此减少扩增带来的DNA突变率。
优选地,步骤2中的末端修复、加A尾反应以及步骤3中的连接反应所用试剂分别为Neb推荐二代建库试剂盒End Repair Module、dA-Tailing Module和Quick Ligation Module。优选地,步骤3和4中所用的单链消化酶为核酸外切酶I(Exonuclease I),该酶是单链特异性3’→5’核酸外切酶,不分解双链DNA及RNA。
优选地,步骤4中第二轮扩增进行15-18个循环。
优选地,步骤6中测序利用二代测序技术,优选的是pair-End技术(例如Illumina Hiseq2000,Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq)进行测序,获得DNA混合物的序列。
另一方面,本发明还提供一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的试剂盒,其中,所述试剂盒包括以下引物:
第一轮扩增引物:根据待测的靶序列设计相应的捕获引物,组成第一轮扩增引物组合;
接头序列:一个或多个接头序列,所述接头包含两个回文序列、U碱基和3’T末端,其中,一个回文序列位于所述接头5’端,通过U碱基与另一个回文序列连接,其可稳定形成发卡结构;和/或
第二轮扩增引物:根据样本数量设计不同的标签序列,并在其3’端加上与所述接头的5’端回文序列互补的序列组成富集扩增所用的标签引物,组成第二轮扩增引物组合,其中,由于第二轮扩增的靶序列两端连接的接头相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同,设计的标签引物的数量遵循以下规则:标签序列的数量×接头的数量≥样本数量,以及其中,在第二轮扩增引物中,标签序列上添加的序列与第一轮扩增产物中连接的接头的5’端回文序列互补。
优选地,在本发明中,所述样本的数量可为:样本数量≤可设计的标签序列的数量×可设计的接头的数量。
更优选地,本发明提供一种基于高通量测序的标记和捕获多个(10个)样本的Wilson综合征相关的ATP7B基因的一个或多个(21个)外显子的试剂盒,其中所述外显子为选自EXON1、EXON2、EXON3、EXON4、EXON5、EXON6、EXON7、EXON8、EXON9、EXON10、EXON11、EXON12、EXON13、EXON14、EXON15、EXON16、EXON17、EXON18、EXON19、EXON20、EXON21中的一种或多种;所述试剂盒包括如下引物和接头:
第一轮扩增引物包括选自下列中的一对或多对:
用于连接在第一轮扩增产物两端的具有如下序列的接头:
ADP1:5'P-AGGACAGAAGCTCGA-U-TCGAGCTTCTGTCCT-s-T-3'
ADP2:5'P-ACCTTGAGCGATCGA-U-TCGATCGCTCAAGGT-s-T-3';
第二轮扩增引物包括选自下列标签引物中的一种或多种标签引物组成的引物对,其中划横线部分为与第一轮产物中连接的接头的5’端回文区域互补的序列:
ADP1A:GCTCATTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1B:TAGCCTTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1C:AGAGGCTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1D:TATCCTTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1E:CTCTGATCGAGCTTCTGTCCT
ADP2A:GCTCATTCGATCGCTCAAGGT
ADP2B:TAGCCTTCGATCGCTCAAGGT
ADP2C:AGAGGCTCGATCGCTCAAGGT
ADP2D:TATCCTTCGATCGCTCAAGGT
ADP2E:CTCTGATCGATCGCTCAAGGT
其中,由于第二轮扩增时,靶序列两端连接的接头相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同。
本发明具有如下有益效果:
本发明使用特异性的捕获引物(第一轮扩增引物)扩增靶序列,通过连接反应将带有U碱基的接头(Adaptor)连接到靶序列扩增产物的两端,用USER酶切开U碱基后,通过采用标签序列+接头序列组成的第二轮扩增引物进行扩增,最终在PCR产物的5`末端添加了标签引物序列。通过对每个样本都引入独特的标签引物序列,在第二代高通量测序技术检测时,每个样本的测序结果都可以通过其独特的标签引物序列找回,再根据每个靶序列的捕获引物序列将测序结果对应到样本的每个靶序列上,因此,本发明可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点,大大降低了测序成本。
附图说明
图1是本发明的捕获和标记多个样本的靶序列的方法的示意图。
具体实施方式
现将结合实施例对本发明做进一步详细说明,实施例仅限于说明本发明,而非对本发明的限定。
以下实施例中所使用的设备和试剂如下:End Repair Module、dA-Tailing Module和Quick Ligation Module,核酸外切酶Takara(Exonuclease I(E.coli))。
实施例1
Wilson综合征相关ATP7B基因(NCBI Gene ID:540)的21个外显子(EXON1、EXON2、EXON3、EXON4、EXON5、EXON6、EXON7、EXON8、EXON9、EXON10、EXON11、EXON12、EXON13、EXON14、EXON15、EXON16、EXON17、EXON18、EXON19、EXON20和EXON21)测序,共10例临床样本:
1)引物和接头设计:
针对ATP7B基因的21个外显子分别设计相应的捕获引物,相关参数:Tm值58.0℃-65.0℃,GC值40.0%-60.0%,引物大小23±3bp,目的片段大小为150-300bp,所设计的引物如下:
根据10个样本设计2个接头,接头为单链DNA,序列中包含两个区域(每个区域长度为15bp)的回文序列、一个U碱基和3’T末端,可形成稳定的发卡结构,所设计的接头序列如下:
ADP1:5'P-AGGACAGAAGCTCGA-U-TCGAGCTTCTGTCCT-s-T-3'
ADP2:5'P-ACCTTGAGCGATCGA-U-TCGATCGCTCAAGGT-s-T-3'
按照以下规则设计标签引物:标签引物包含标签序列和与接头的5’端回文序列互补的序列,其中,标签序列的数量×接头序列的数量≥样本数量,在本实施例中,根据10个样本和2个接头设计10条标签引物,即,在与接头的5’端回文序列互补的序列的5’端加上可以区分的标签序列(6bp)构成标签引物,其中,由于第二轮扩增的靶序列(第一轮扩增产物连接接头后的产物)两端连接的接头的回文序列相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同。所设计的标签引物如下,其中划横线部分为与第一轮产物中连接的接头的5’端回文区域互补的序列:
ADP1A:GCTCATTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1B:TAGCCTTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1C:AGAGGCTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1D:TATCCTTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1E:CTCTGATCGAGCTTCTGTCCT
ADP2A:GCTCATTCGATCGCTCAAGGT
ADP2B:TAGCCTTCGATCGCTCAAGGT
ADP2C:AGAGGCTCGATCGCTCAAGGT
ADP2D:TATCCTTCGATCGCTCAAGGT
ADP2E:CTCTGATCGATCGCTCAAGGT
2)第一轮扩增(PCR捕获):
每对捕获引物单独调试合格后,分别针对各临床样本,将21对引物分别稀释到100μM,然后等量混合,按以下体系和条件扩增:
反应组分 | 50μL |
多重扩增PCR预混液(Multiplex PCR Mix) | 25 |
GC增强缓冲液(GC Enhance) | 3 |
引物混合液(Primer Mix) | 1.25 |
模板(10ng/ul) | 2 |
H2O | 18.75 |
反应条件:
95℃10分钟;
95℃30秒;58℃5分钟(20个循环);
72℃7分钟。
产物回收:切胶回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带(150-300bp)。
末端修复:按照以下反应体系和条件对上述回收产物进行末端修复:
反应条件:
20℃30min
65℃20min
将所得产物进行柱纯化,最终50μL洗脱。
加A尾:按照以下反应体系和条件对上述产物片段3’端加A尾:
反应组分 | 50μL |
NEBNext加A反应缓冲液(NEBNext dA-Tailing Reaction Buffer)(10×) | 5 |
Klenow Fragment酶(Klenow Fragment(3’→5′exo–)) | 3 |
纯化产物 | 42 |
反应条件:37℃30min,65℃20min。
将所得产物进行柱纯化,最终30μL洗脱。
3)连接接头
连接反应:按照以下反应体系和条件在上述产物片段两端加上接头:
反应条件:20℃15min,12℃30min,65℃10min。
其中,在第二轮扩增所用的标签引物中,与标签序列3’端连接的序列是与第一轮扩增产物中连接的接头的5’端回文序列互补的序列,每个样本在第一轮产物中连接的接头和在第二轮扩增所用的标签引物如下表一所示。
USER酶和Exonuclease I酶消化:在上述体系中添加1μL USER酶,37℃反应30min,以切开接头中的U碱基,然后加入1μL Exonuclease I酶,37℃反应30min以消化体系中残留的引物单链。对所得产物进行柱纯化,最终50μL洗脱。
4)第二轮扩增(产物富集)使用上述根据样本和接头设计的标签引物,以对应样本连接接头处理后的产物作为模板进行富集扩增,以分别给每个样本的扩增产物再加上可以区分的标签引物序列,反应体系和条件如下:
反应组分 | 50μL |
2×PCR预混液(2×PCR Mix) | 25 |
Index引物(100μM) | 1 |
Taq聚合酶(Taq polymerse) | 1 |
模板 | 23 |
反应条件:95℃10min;95℃1min,50℃5min,72℃1min(15-18个循环);
其中,第一轮产物中连接的接头和第二轮产物中所使用的标签引物如下表一所示:
表一
样本编号 | 接头 | 标签引物 |
1# | ADP1 | ADP1A |
2# | ADP1 | ADP1B |
3# | ADP1 | ADP1C |
4# | ADP1 | ADP1D |
5# | ADP1 | ADP1E |
6# | ADP2 | ADP2A |
7# | ADP2 | ADP2B |
8# | ADP2 | ADP2C |
9# | ADP2 | ADP2D |
10# | ADP2 | ADP2E |
引物消化和产物回收:扩增产物用单链消化酶消化剩余的引物,并进行纯化,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
5)混合与回收:将针对各临床样本的带有标记序列的第二轮PCR扩增产物根据浓度均一的混合在一起,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
6)测序:将回收的DNA混合物,采用Illumina Miseq,PE300进行测序,获得DNA混合物的序列。
7)分析:Illumina Miseq产物的测序结果是一系列DNA序列,通过查找测序结果中10个样本各自独特的标签引物序列(接头序列和标签序列的组合),将获得的测序结果首先与样本一一对应,然后根据21个外显子的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的每个靶序列上。所有的10个样本的21个外显子都能够在测序结果中找到对应的数据,每个样本对应的reads数如下表二所示,10个样本之间reads数差异最大在3倍左右,21个外显子序列对应的reads差异最大在10倍左右(数据参见表三,以1-2#样本为例),表明我们的多样本标记方法能够有效的区分每个标签对应的DNA序列。
表二每个样本对应的reads数和GC数
表三21个外显子序列对应的reads数(以1-2#样本为例)
1# | 2# | |
Exon 1 | 14231 | 10272 |
Exon 2 | 9831 | 6098 |
Exon3 | 17246 | 11428 |
Exon 4 | 13888 | 9649 |
Exon 5 | 25132 | 16094 |
Exon 6 | 8032 | 10857 |
Exon 7 | 16989 | 8565 |
Exon 8 | 7564 | 5826 |
Exon 9 | 15789 | 20667 |
Exon 10 | 13476 | 10758 |
Exon 11 | 17428 | 12633 |
Exon 12 | 13085 | 9964 |
Exon 13 | 15714 | 7234 |
Exon 14 | 10857 | 8574 |
Exon 15 | 11428 | 9771 |
Exon 16 | 13308 | 10034 |
Exon 17 | 18571 | 11241 |
Exon 18 | 14330 | 12571 |
Exon 19 | 10094 | 8143 |
Exon 20 | 22455 | 13215 |
Exon 21 | 11500 | 10428 |
总计 | 300,948 | 224,022 |
Claims (10)
1.一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的方法,包括以下步骤:
第一轮扩增:使用根据靶序列设计的捕获引物,在适于多重扩增目的核酸的条件下分别对各样本的目标区域进行扩增,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
第二轮扩增:使用第一轮扩增得到的产物作为模板进行第二轮扩增以使第二轮扩增产物上带有可对各样本进行区分的标签;
混合与回收:将各样本的富集扩增产物均一地混合在一起,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
测序:将回收的DNA混合物进行测序;
分析:基于每个样本的扩增产物中独特的标签,将获得的测序结果首先与样本一一对应;根据每个靶序列的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的每个靶序列上。
2.一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的方法,包括以下步骤:
第一轮扩增:使用根据靶序列设计的捕获引物,在适于多重扩增目的核酸的条件下分别对各样本的目标区域进行扩增,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带,对扩增产物进行末端修复并加A尾;
接头设计:所述接头包含两个回文序列、U碱基和3’T末端,其中,一个回文序列位于所述接头5’端,通过U碱基与另一个回文序列连接,其可稳定形成发卡结构;
连接接头:通过连接反应在第一轮扩增产物的两端加上带U碱基的接头;进行U碱基剪切,并用单链消化酶消化剩余的引物;
标签引物设计:所述标签引物包含标签序列和与所述接头的5’端回文序列互补的序列,其中,所述标签序列位于所述标签引物的5’端,其中,标签序列的数量×接头的数量≥样本数量;
第二轮扩增:使用针对接头和各样本设计的标签引物,以对应样本连接接头后的产物作为模板进行富集扩增,并用单链消化酶消化剩余的引物,以分别给每个样本的扩增产物都加上可以区分的标签引物序列;
混合与回收:将各样本的富集扩增产物均一地混合在一起,回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
测序:将回收的DNA混合物进行测序;
分析:基于每个样本的扩增产物中独特的标签引物序列,将获得的测序结果首先与样本一一对应;根据每个靶序列的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的靶序列上。
3.一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的方法,包括以下步骤:
1)引物和接头设计:
第一轮扩增引物:根据待测的靶序列设计相应的捕获引物,组成第一轮扩增引物组合;
接头序列:设计一个或多个接头序列,所述接头包含两个回文序列、U碱基和3’T末端,其中,一个回文序列位于所述接头5’端,通过U碱基与另一个回文序列连接,其可稳定形成发卡结构;
第二轮扩增引物:根据样本数量设计不同的标签序列,并在其3’端加上与所述接头的5’端回文序列互补的序列组成富集扩增所用的标签引物,组成第二轮扩增引物组合,其中,由于第二轮扩增的靶序列两端连接的接头相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同,设计的标签引物的数量遵循以下规则:标签序列的数量×接头的数量≥样本数量,以及其中,在第二轮扩增引物中,标签序列上添加的序列与第一轮扩增产物中连接的接头的5’端回文序列互补;
2)第一轮扩增:将扩增靶序列的捕获引物混合,在适于多重扩增目的核酸的条件下分别对各样本进行扩增;回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带,对扩增产物进行末端修复,并将扩增产物的两个末端都加上A尾;
3)连接接头(Adaptor):通过连接反应在扩增产物两端加上带U碱基的接头,使用USER酶打断U碱基,用单链消化酶消化剩余的引物;
4)第二轮扩增:根据不同样本和接头设计的标签引物,使用对应样本连接接头处理后的产物作为模板进行富集扩增,以分别给每个样本的扩增引物都加上可以区分的标签引物序列;用单链消化酶消化剩余的引物,并进行纯化;
5)混合与回收:将各样本的富集产物均一地混合在一起;回收所设计的目标区域范围之内的所有DNA条带;
6)测序:将DNA混合物进行测序;
7)分析:基于每个样本独特的标签引物序列,将获得的测序结果首先与样本一一对应;根据每个靶序列的捕获引物序列,再将测序结果对应到样本的靶序列上。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中,所述标签序列的长度为5-20bp,优选地,所述标签序列的长度为6-8bp;所述接头中包含两个区域的回文序列,每个回文序列为8-15bp,最优选为15bp。
5.根据权利要求2或3所述的方法,其中,第一轮扩增所采用的体系为高保真多重PCR反应体系;第二轮扩增所采用的酶为高保真DNA聚合酶,所述的单链消化酶为核酸外切酶I。
6.根据权利要求2或3所述的方法,其中,第一轮扩增进行18-20个循环,第二轮扩增进行15-18个循环。
7.根据权利要求2或3所述的方法,其中,末端修复、加A尾反应以及连接反应所用试剂分别为Neb推荐二代建库试剂盒End RepairModule、dA-Tailing Module和Quick Ligation Module。
8.根据权利要求2或3所述的方法,其中,测序利用二代测序技术,优选的是pair-End技术(例如Illumina Hiseq2000,Illumina Hiseq2500和IlluminaMiseq)进行测序,获得DNA混合物的序列。
9.一种基于高通量测序的捕获和标记多个样本的一个或多个靶序列的试剂盒,其中,所述试剂盒包括以下引物和接头:
第一轮扩增引物:根据待测的靶序列设计相应的捕获引物,组成第一轮扩增引物组合;
接头序列:一个或多个接头序列,所述接头包含两个回文序列、U碱基和3’T末端,其中,一个回文序列位于所述接头5’端,通过U碱基与另一个回文序列连接,其可稳定形成发卡结构;和/或
第二轮扩增引物:根据样本数量设计不同的标签序列,并在其3’端加上与所述接头的5’端回文序列互补的序列组成富集扩增所用的标签引物,组成第二轮扩增引物组合,其中,由于第二轮扩增的靶序列两端连接的接头相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同,设计的标签引物的数量遵循以下规则:标签序列的数量×接头的数量≥样本数量,以及其中,在第二轮扩增引物中,标签序列上添加的序列与第一轮扩增产物中连接的接头的5’端回文序列互补。
10.一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的Wilson综合征相关的ATP7B基因的一个或多个外显子的试剂盒,其中所述外显子为选自EXON1、EXON2、EXON3、EXON4、EXON5、EXON6、EXON7、EXON8、EXON9、EXON10、EXON11、EXON12、EXON13、EXON14、EXON15、EXON16、EXON17、EXON18、EXON19、EXON20、EXON21中的一种或多种;所述试剂盒包括如下引物和接头:
第一轮扩增引物包括选自下列中的一对或多对:
E1-F CTTCCCCGGTCCCAAATGAAG
E1-R CCTCCTGGTGGGAGTGAGCAC
E2-F TGCCAGAGAAGCTGGGATGTTG
E2-R GCAAACCTGTTGCAGGCACAC
E3-F GAGCCCTGAAACCTCTTGTTCTG
E3-R CGAGGTCTATACGCAGCATTCCT
E4-F GCCCTGCCCACCCAGAGTG
E4-R CAAAGATGGATGTGTCCAAAATGC
E5-F CTGGCTTTCACAGGCTTTCCT
E5-R TTACTTACCTCAATAATTTTGATAATATCC
E6-F CTGCCAATGCATATTTTAACCAAGT
E6-R GAAGGGACTTAGATGAGAGCTGGAG
E7-F AATCCAGGTGACAAGCAGCATC
E7-R GCATGGAAGGGAGAGGTCTGC
E8-F ACTTGCTGGCAGCCTTCACTG
E8-R GATTTGTTTACTGAAGGAGCAGCTC
E9-F CGATAGCTCTCATTTCACATTCTGG
E9-R CACACAGATTGATAGATACCAACCAC
E10-F TGACCCGGTGACCGAATGAGT
E10-R ATGATATCCTCCTGAGGGAACATG
E11-F CAAGTGACAGTTGTCTCTTTCCTACG
E11-R TTCCCAGAACTCTTCACATAATTTCT
E12-F CCATGGTCTTGGTGTTTTATTTTC
E12-R TGAAAGAACAGGATCAATGTCAGTAG
E13-F TGGGAGCTTCCTTATTGAACTCTC
E13-R CATCTCTCAGGATGGGGAAAGC
E14-F CCTCCATCTGTATTGTGGTCAGTG
E14-R GGTGAGGAATAAAAGAGCATTGGC
E15-F TCTTGGCTTACAGTTTCCTCTTCC
E15-R CGTGGTGCTCTCTGTGGTTTGA
E16-F GGACCATTTAGAAATAACCACAGCC
E16-R TTTGCCTGATATCTGCAGAAAACTG
E17-F CCAACTTGTGTAGCTGCTGATGC
E17-R TGGTGCTTACTTTTGTCTCTAACTGC
E1819-F TGATACCTTTTGCCAACACTAGGC
E1819-R TGGGAGACAGAAGCCTTTCTGG
E20F TGGCTCCTCTCCCCAGACCTA
E20-R ACTGTGCTAAGCATGCAGAATGAC
E21-F GAGAGGCCTTCACCAGGCTTAG
E21-R GCCTGCCTGAAGTCATCAGATG
用于连接在第一轮扩增产物两端的具有如下序列的接头:
ADP1:5'P-AGGACAGAAGCTCGA-U-TCGAGCTTCTGTCCT-s-T-3'
ADP2:5'P-ACCTTGAGCGATCGA-U-TCGATCGCTCAAGGT-s-T-3';
第二轮扩增引物包括选自下列标签引物中的一种或多种标签引物组成的引物对,其中划横线部分为与第一轮产物中连接的接头的5’端回文区域互补的序列:
ADP1A:GCTCATTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1B:TAGCCTTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1C:AGAGGCTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1D:TATCCTTCGAGCTTCTGTCCT
ADP1E:CTCTGATCGAGCTTCTGTCCT
ADP2A:GCTCATTCGATCGCTCAAGGT
ADP2B:TAGCCTTCGATCGCTCAAGGT
ADP2C:AGAGGCTCGATCGCTCAAGGT
ADP2D:TATCCTTCGATCGCTCAAGGT
ADP2E:CTCTGATCGATCGCTCAAGGT
其中,由于第二轮扩增时,靶序列两端连接的接头相同,用于同一样本的正向标签引物和反向标签引物相同。
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Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106554999A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-04-05 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建方法、试剂盒及其用途 |
CN106554955A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-04-05 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 |
WO2019114146A1 (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-20 | 格诺思博生物科技南通有限公司 | 基因目标区域富集方法及建库试剂盒 |
CN110468179A (zh) * | 2018-05-10 | 2019-11-19 | 北京大学 | 选择性扩增核酸序列的方法 |
CN110468188A (zh) * | 2019-08-22 | 2019-11-19 | 广州微远基因科技有限公司 | 用于二代测序的标签序列集及其设计方法和应用 |
CN110603334A (zh) * | 2017-06-20 | 2019-12-20 | 深圳华大智造科技有限公司 | Pcr引物对及其应用 |
CN111118127A (zh) * | 2019-12-28 | 2020-05-08 | 郑州大学 | 二代dna测序样本的特异性标签防错试剂盒 |
CN111748611A (zh) * | 2019-03-28 | 2020-10-09 | 深圳华大基因科技服务有限公司 | Pcr引物及其在dna片段连接中的应用 |
CN112458195A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-03-09 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 |
EP3752614A4 (en) * | 2018-02-14 | 2021-11-10 | Deep Genomics Incorporated | OLIGONUCLEOTIDE THERAPY FOR WILSON'S DISEASE |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120244525A1 (en) * | 2010-07-19 | 2012-09-27 | New England Biolabs, Inc. | Oligonucleotide Adapters: Compositions and Methods of Use |
CN104153004A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-19 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于扩增子测序的建库方法 |
-
2015
- 2015-02-05 CN CN201510061690.6A patent/CN105986015B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120244525A1 (en) * | 2010-07-19 | 2012-09-27 | New England Biolabs, Inc. | Oligonucleotide Adapters: Compositions and Methods of Use |
CN104153004A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-19 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于扩增子测序的建库方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ANNU AGGARWAL1 ET AL.: "Wilson Disease Mutation Pattern with Genotype-Phenotype Correlations from Western India: Confirmation of p.C271* as a Common Indian Mutation and Identification of 14 Novel Mutations", 《ANNALS OF HUMAN GENETICS》 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106554955B (zh) * | 2016-10-25 | 2020-07-14 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 |
CN106554955A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-04-05 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 |
CN106554999A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-04-05 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建方法、试剂盒及其用途 |
CN106554999B (zh) * | 2016-10-25 | 2020-03-17 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建方法、试剂盒及其用途 |
CN110603334B (zh) * | 2017-06-20 | 2024-01-16 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | Pcr引物对及其应用 |
CN110603334A (zh) * | 2017-06-20 | 2019-12-20 | 深圳华大智造科技有限公司 | Pcr引物对及其应用 |
WO2019114146A1 (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-20 | 格诺思博生物科技南通有限公司 | 基因目标区域富集方法及建库试剂盒 |
EP3752614A4 (en) * | 2018-02-14 | 2021-11-10 | Deep Genomics Incorporated | OLIGONUCLEOTIDE THERAPY FOR WILSON'S DISEASE |
US11578327B2 (en) * | 2018-02-14 | 2023-02-14 | Deep Genomics Incorporated | Oligonucleotide therapy for Wilson disease |
CN110468179B (zh) * | 2018-05-10 | 2021-03-05 | 北京大学 | 选择性扩增核酸序列的方法 |
CN110468179A (zh) * | 2018-05-10 | 2019-11-19 | 北京大学 | 选择性扩增核酸序列的方法 |
CN111748611A (zh) * | 2019-03-28 | 2020-10-09 | 深圳华大基因科技服务有限公司 | Pcr引物及其在dna片段连接中的应用 |
CN110468188A (zh) * | 2019-08-22 | 2019-11-19 | 广州微远基因科技有限公司 | 用于二代测序的标签序列集及其设计方法和应用 |
CN110468188B (zh) * | 2019-08-22 | 2023-08-22 | 广州微远医疗器械有限公司 | 用于二代测序的标签序列集及其设计方法和应用 |
CN111118127A (zh) * | 2019-12-28 | 2020-05-08 | 郑州大学 | 二代dna测序样本的特异性标签防错试剂盒 |
CN111118127B (zh) * | 2019-12-28 | 2023-05-02 | 郑州大学 | 二代dna测序样本的特异性标签防错试剂盒 |
CN112458195A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-03-09 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 |
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Publication number | Publication date |
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