CN103173441A

CN103173441A - 线粒体全基因组dna扩增、引物、测序及突变检测

Info

Publication number: CN103173441A
Application number: CN 201310046250
Authority: CN
Inventors: 费凌娜; 尉姗姗; 高景红; 叶李莉; 田玉娇; 易鑫
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明公开了一种用于线粒体全基因组扩增的引物对组、试剂盒。还公开了线粒体全基因组DNA的扩增方法、测序方法及突变检测方法。本发明利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法，能够得到线粒体全基因组序列，可以一次性检测线粒体基因的全部突变，能够应用于大多数线粒体基因突变引起的疾病的检测。

Description

线粒体全基因组DNA扩增、引物、测序及突变检测

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及可用于线粒体全基因组DNA扩增的引物对组、试剂盒、扩增方法、测序方法以及线粒体DNA突变检测方法。

背景技术

线粒体基因组（mitochondrial DNA,mtDNA）呈闭合双链环状结构，长度为16569bp，分为编码区和非编码区。编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸（tRNA）、2个编码核糖体核糖核酸（12S和16S rRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有内含子。

mtDNA的分子结构特点决定其具有以下独特的遗传特性：

（1）高拷贝数，一般来说，人类体细胞的细胞核内仅有两个染色体DNA拷贝，而大多数细胞质内却有1000至数千个mtDNA拷贝；

（2）表现为严格的母性遗传特点，mtDNA随母本的***传递给后代；

（3）具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上；

（4）异质性，突变的mtDNA与野生型的mtDNA以不同比例共存于一个细胞质内。

由于mtDNA的高突变率和mtDNA的高度进化保守性，多数mtDNA新突变都为有害突变，并且mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，许多病人并不出现典型症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊。故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。

目前临床上对于mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（MELAS）常见突变A3243G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。此外，这些位点的选择都是基于其他人种（主要是白种人）的实验数据，中国人的基因突变位点与欧洲人的突变位点在规律上有很大的区别。目前最常用的mtDNA的检测方法是应用聚合酶链式反应（PCR）扩增出目的DNA片段，然后采用荧光标记序列分析仪（如3730DNA序列分析仪）对扩增产物直接进行测序。由于荧光标记序列分析仪对测序片段长度的限制，需要用26对甚至更多对引物对线粒体基因组进行多重PCR，将其分割成26段甚至更多片段来进行测序，操作过于繁琐，并且无法检测拷贝数很低的变异。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

扩增线粒体基因组，可通过设计最少2对PCR引物来完成，但是，引物对数目少对DNA模板的质量要求高，基因组模板不能有过多降解，并且对Taq酶的要求也更高，需要能扩增出10kb长片段的Taq酶进行PCR，扩增片段太长同时也会增加碱基的错配率，降低检测的准确性。而设计更多对的引物来扩增线粒体基因组，如26对、43对，PCR和后续的纯化操作繁琐，PCR产物片段短，适用于线粒体基因选择部分区域做sanger测序。选用引物对数量适中，如本发明方案的8对，其优势在于，对模板的要求低，PCR产物错配率低，检测准确性高，更适用于后续的高通量测序平台。

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可用于线粒体全基因序列扩增的引物对组。

本发明的另一目的在于提供一种线粒体全基因组DNA扩增方法。

本发明的再一目地在于提供一种线粒体全基因组的测序方法。

本发明的还一目的在于提供一种线粒体DNA的突变检测方法。

本发明的再一目的在于提供一种可用于线粒体全基因组DNA扩增的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了用于扩增线粒体全基因组序列的引物对组，所述引物对组包括以下a-h中的至少一对引物，优选含有A-H中的所有八对引物，

a、seq ID No.1:5’-CACTCCCATACTACTAATCTC-3’,

seq ID No.2:5’-TAGCATGTACTGCTCGGAGGT-3’,

b、seq ID No.3:5’-GTCCTAAACTACCAAACCTGC-3’,

seq ID No.4:5’-GTGTTAGTCATGTTAGCTTG-3’,

c、seq ID No.5:5’-ATCTCTCCCTCACTAAACGTAAG-3’,

seq ID No.6:5’-ATGAGGGCGTGATCATGAAAGGT-3’,

d、seq ID No.7:5’-GCATACACCACATGAAACATC-3’,

seq ID No.8:5’-ATGCCGTCGGAAATGGTGAAG-3’,

e、seq ID No.9:5’-TCCCACTCCTAAACACATCC-3’,

seq ID No.10:5’-AAACCCGGTAATGATGTCGG-3’,

f、seq ID No.11:5’-GCCCACGGGCTTACATC-3’,

seq ID No.12:5’-GATTGTTAGCGGTGTGGTCG-3’,

g、seq ID No.13:5’-GCCTTCTTACGAGCCAAAACC-3’,

seq ID No.14:5’-TCCAGCGTCTCGCAATGCTAT-3’,

h、seq ID No.15:5’-TTCGCCTACACAATTCTCCG-3’,

seq ID No.16:5’-TTTATGGGGTGATGTGAGCC-3’。

本发明还公开了一种线粒体全基因组DNA扩增方法，所述方法包括，采用上述的引物对组，以线粒体DNA为模板，进行PCR扩增。

所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为52-56℃，优选为56℃。

本发明进一步公开了一种线粒体全基因组测序方法，所述方法包括，采用上述的方法扩增得到线粒体全基因组DNA，构建测序文库，采用高通量测序平台进行全基因组测序。

所述高通量测序平台选自Illumina solexa/Hiseq、ABI SOLiD、Roche454和单分子测序装置之一；在本发明一个优选的实施方式中，所述高通量测序平台为Illumina Miseq测序仪。

具体地，所述测序方法包括，将PCR扩增得到的产物分别纯化并混合后，制备DNA Paired-End PCR Free文库，***片段为100~1000bp，优选为400～600bp，更优选500bp，制备好的文库质检合格后在Miseq测序仪上直接测序检测，读长150bp。

在本发明一个具体的实施方式中，制备DNA Paired-End PCR Free文库具体包括

i、将PCR产物打断，使打断后DNA主带大小集中在***片段大小，回收所需大小的目的片段；

ii、将步骤i的产物进行末端修复；

iii、将步骤ii的产物进行3’端加A碱基；

iv、将步骤iii的产物片段加上测序接头；

v、选择并回收目的DNA片段，获得所述DNA文库；

任选地，所述目的片段为100~1000bp，优选为400～600bp，更优为500bp。

构建好的文库优选进一步进行文库质量检测，可以使用例如Agilent2100Bioanalyzer和ABI StepOnerPlus Real-Time PCR System进行质量和产量的检测。

本发明还公开了一种线粒体DNA的突变检测方法，所述方法包括，采用上述的方法进行线粒体全基因组测序，获得线粒体全基因组DNA序列，将测序结果与线粒体参考序列比对。

所述线粒体参考序列优选为修正后的剑桥参考序列NC_012920.1。

本发明还公开了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物对组。

所述试剂盒用于线粒体全基因组DNA扩增。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法，能够得到线粒体全基因组序列，可以一次性检测线粒体基因的全部突变，能够应用于大多数线粒体基因突变引起的疾病的检测。其中Miseq测序仪是在单个仪器上整合了扩增、测序和数据分析的新一代测序仪，在简单、快速、灵活和低成本方面占据优势，特别适用于线粒体基因组测序。本发明可应用于辅助线粒体疾病临床诊断，发病机理的研究，遗传学研究以及不同人群单倍型分型。

附图说明

图1为本发明线粒体基因PCR产物电泳图。

注：1：引物a PCR产物；2：引物b PCR产物；3：引物c PCR产物；4：引物d PCR产物；5：引物e PCR产物；6：引物f PCR产物；7：引物g PCR产物；8：引物h PCR产物；M：DNA MarkerⅢ

图2为本发明测序文库制备流程图。

图3为本发明实施例的检测样本3243位点的reads图。

具体实施方式

临床上重要的变异散布于mtDNA基因组中，而mtDNA全基因组很难被扩增。本发明开发出一种用8对引物多重PCR扩增出mtDNA全基因组的测序***，以解决上述问题。

本发明合成了能够扩增出线粒体全基因组碱基的8对高特异性PCR引物。本发明所涉及的这8对PCR引物经实验证明，能够对线粒体全基因组进行特异性扩增，并通过直接测序的方法得到真实可靠的线粒体全基因组序列资料。

本发明提供了的线粒体测序用8对PCR引物，覆盖了线粒体基因组全长，以下表1列出了该8对PCR引物序列。

表1 PCR引物序列

选用上述线粒体全基因组测序用8对PCR引物，将上下游引物稀释成10μmol/L，作为工作液。

PCR反应体系：体系总体积为25μl，其中含DNA模板1μl（含至少50ng全基因组DNA），目的片段的相应上下游引物（10μmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，10×PCR buffer（Mg²⁺ Plus）2.5μl，dNTP Mixture（2.5mmol/L）4μl，ddH₂O15.25μl。

引物的PCR扩增基础参数为：94℃变性45s，根据PCR引物不同确定退火温度进行30s，72℃延伸3min，共计35个循环（表2列出PCR扩增条件）。

用DNA纯化回收试剂盒纯化PCR反应产物。

纯化后的PCR产物混合，制备DNA Paired-End PCR Free文库，***片段为500bp，文库制备流程如图2所示。此外，在实际操作过程中，为了提高测序效率，本领域技术人员熟知，可以通过增加index序列，制备成DNA Paired-End PCRFree Index文库，实现与其他样品文库混合上机。

文库质检合格后，在Miseq测序仪上直接测序检测，读长150bp，测序深度5000×，每个样本产生约83M的数据量。

测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列（修正后的剑桥序列NC_012920.1）比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、微缺失和微重复。

利用本发明的8对引物对可以制备试剂盒，用于线粒体全基因组序列的扩增。

本发明采用8对引物对线粒体全基因组进行多重PCR反应扩增，PCR产物经过纯化后构建PCR-free文库，最后采用Miseq测序仪进行高通量测序。测序操作灵活、简单、快速，深度可达几千甚至上万乘，在检测mtDNA低频突变方面占有优势，可以检测mtDNA上的任一点突变和微缺失、微重复，辅助临床医生提高线粒体病疑似患者的确诊率。除在基因检测方面的应用，还可应用于人类学、遗传学以及mtDNA突变和疾病相关性研究等领域。线粒体全基因组Miseq测序为个体临床和群体遗传学研究检测mtDNA变异提供了一个尤其合适的平台，不仅能够重点关注mtDNA的关键变异，缩短分析时间和提高流量，同样也能够将注意力集中到检测到的mtDNA上的任一未知致病突变。跟传统测序相比，该测序方法在检测分析成千上万的mtDNA碱基时表现出重要优势。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例：

本发明线粒体全基因组测序用PCR引物见表1。

本发明基于所述线粒体全基因组测序用PCR引物多重PCR扩增的方法，利用覆盖线粒体基因组全长的8对PCR引物扩增目的片段，然后构建DNAPaired-End PCR Free Index文库，Miseq测序检测线粒体全基因组序列，经数据分析比对获得样本线粒体序列变异信息。

PCR扩增

选用线粒体全基因组测序用8对PCR引物（表1），将上下游引物稀释成10μmol/L，作为工作液。PCR反应体系总体积25μl，其中含DNA模板1μl（含至少50ng全基因组DNA），该DNA模板来自一位线粒体脑肌病患者的血液基因组。目的片段的相应上下游引物（10μmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，10×PCR buffer（Mg²⁺ Plus）2.5μl，dNTP Mixture（2.5mmol/L）4μl，ddH2O 15.25μl。

本实验PCR反应所用试剂均为通用试剂，PCR产物的检测采用常规的方法。PCR扩增参数见表2。

表2 PCR扩增条件

引物名称	变性温度/时间	退火温度/时间	延伸温度/时间	循环次数
					a	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
b	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
					c	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
d	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
					e	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
f	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
					g	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35
h	94℃ 45s	56℃ 30s	72℃ 3min	35

PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

PCR扩增产物1.5%q琼脂糖凝胶电泳检测，确保PCR产物扩增成功并且条带单一，特异性好，电泳鉴定结果如图1。

PCR扩增产物的纯化

使用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）纯化PCR扩增产物。

DNA Paired-End PCR Free Index文库制备

将纯化后的PCR产物混合，制备DNA Paired-End PCR Free Index文库，***片段为500bp，文库制备流程见图2。

样品打断：用Covaris S2或Covaris E210将PCR产物打断，要求打断后DNA主带大小集中在500bp左右。对打断后的DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格的打断产物用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）试剂盒进行纯化回收。

末端修复：配置200μl末端修复反应体系：DNA样品60μl，T4 PNK buffer20μl，dNTP Mixture（10mMOL/L）8μl，T4 DNA polymerase 10μl，Klenow Fragment2μl，T4 PNK 10μl，ddH2O 90μl。在Thermo mixer中20℃反应30min。修复产物用试剂盒进行纯化回收。

3’端加A碱基：配置100μl3’端加A碱基反应体系：DNA样品64μl，10×bluebuffer 10μl，1mM dATP 20μl，Klenow exo(3’to5’exo minus)6μl。在Thermo mixer中37℃反应30min。加A产物用试剂盒进行纯化回收。

片段加solexa接头：配置100μl接头连接反应体系：DNA样品20μl，2×DNAligase buffer 50μl，PE Index adapter oligo mix 20μl，T4 DNA ligase 10μl。在Thermomixer中16℃反应过夜。连接产物用试剂盒进行纯化回收。

本申请中，本领域技术人员熟知，可以根据实际测序平台或其他相关条件，选择合适的测序接头。在本实施例中，所加入的测序接头序列如下Seq ID No.17所示：

5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTC-3’

方框位置为Index标签序列，在实际应用过程中，也可以根据需要换用其他5-11个碱基替代。

所加入的测序接头将形成如下的两链不完全互补的Y型树叉状结构：

DNA片段大小选择：对上一步的连接产物通过2%琼脂糖凝胶100V电压电泳2h，进行DNA片段大小的选择。DNA片段两端分别加上接头后片段长度为630bp左右，但因所加接头为树叉状接头（两链不完全互补），电泳过程中跑得比一般630bp的慢，大致在700bp marker的位置，因此选择700bp大小的电泳条带切胶回收，切下的胶块用试剂盒进行纯化回收。

文库质量检测：构建好的文库使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABIStepOnerPlus Real-Time PCR System进行质量和产量的检测。

Miseq测序

文库质检合格后，在Miseq测序仪上直接测序检测，读长150bp，要求测序深度达到5000×，每个样本产生约83M的数据量。

信息分析

测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列（修正后的剑桥序列NC_012920.1）比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括SNP和Indel。

信息分析结果如下：

测序得到的序列与参考序列比对，覆盖度达到100%，共检测到34个SNP和5个Indel。其中包括3243A→G的致病突变（图3），3243位点的信息分析结果见表3。

表3 3243位点信息分析结果

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.用于扩增线粒体全基因组序列的引物对组，其特征在于：所述引物对组包括以下A-H中的至少一对引物，优选含有A-H中的所有八对引物，

a、seq ID No.1:5’-CACTCCCATACTACTAATCTC-3’,

seq ID No.2:5’-TAGCATGTACTGCTCGGAGGT-3’,

b、seq ID No.3:5’-GTCCTAAACTACCAAACCTGC-3’,

seq ID No.4:5’-GTGTTAGTCATGTTAGCTTG-3’,

c、seq ID No.5:5’-ATCTCTCCCTCACTAAACGTAAG-3’,

seq ID No.6:5’-ATGAGGGCGTGATCATGAAAGGT-3’,

d、seq ID No.7:5’-GCATACACCACATGAAACATC-3’,

seq ID No.8:5’-ATGCCGTCGGAAATGGTGAAG-3’,

e、seq ID No.9:5’-TCCCACTCCTAAACACATCC-3’,

seq ID No.10:5’-AAACCCGGTAATGATGTCGG-3’,

f、seq ID No.11:5’-GCCCACGGGCTTACATC-3’,

seq ID No.12:5’-GATTGTTAGCGGTGTGGTCG-3’,

g、seq ID No.13:5’-GCCTTCTTACGAGCCAAAACC-3’,

seq ID No.14:5’-TCCAGCGTCTCGCAATGCTAT-3’,

h、seq ID No.15:5’-TTCGCCTACACAATTCTCCG-3’,

seq ID No.16:5’-TTTATGGGGTGATGTGAGCC-3’。

2.一种线粒体全基因组DNA扩增方法，所述方法包括，采用权利要求1所述的引物对组，以线粒体DNA为模板，进行PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的线粒体全基因组DNA扩增方法，其特征在于：所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为52-56℃，优选为56℃。

4.一种线粒体全基因组测序方法，所述方法包括，采用权利要求2或3所述的方法扩增得到线粒体全基因组DNA，构建测序文库，采用高通量测序平台进行全基因组测序。

5.根据权利要求4所述的线粒体全基因组测序方法，其特征在于：所述高通量测序平台为Miseq测序仪。

6.根据权利要求5所述的线粒体全基因组测序方法，其特征在于：所述测序方法包括，将PCR扩增得到的产物分别纯化并混合后，制备DNAPaired-End PCR Free文库，制备好的文库质检合格后在Miseq测序仪上直接测序检测。

7.根据权利要求6所述的测序方法，其特征在于：所述制备DNAPaired-End PCR Free文库具体包括，

i、将所述PCR产物打断，使打断后DNA主带集中在目的片段大小范围；

ii、将步骤i的产物进行末端修复；

iii、将步骤ii的产物进行3’端加A碱基；

iv、将步骤iii的产物片段加上测序接头；

v、选择并回收目的DNA片段，获得所述DNA文库；

任选地，所述目的片段为100～1000bp，优选为400～600bp，更优为500bp。

8.一种线粒体DNA的突变检测方法，所述方法包括，采用权利要求4-6任意一项所述的方法进行线粒体全基因组测序，获得线粒体全基因组DNA序列，将测序结果与线粒体参考序列比对。

9.根据权利要求8所述的突变检测方法，其特征在于：所述线粒体参考序列为修正后的剑桥参考序列NC_012920.1。

10.一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对组。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于线粒体全基因组DNA扩增。