CN105963389A - 栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，该方法包括以下步骤：⑴将栀子果实水提后，经过滤、浓缩、干燥，即得栀子粉；⑵将栀子粉配制成水溶液；⑶将步骤⑵所得的水溶液注入处理过的聚酰胺柱，再用蒸馏水冲洗，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液；⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后注入处理过的大孔树脂柱，并经洗脱、减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物；⑸先用10~30%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再用30~90%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱，得到30~90%的乙醇洗脱液，该洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。同时，本发明该公开了该栀子黄色素的应用。本发明简单易行、操作方便，可工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及中草药有效成分的富集工艺，尤其涉及栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法及其应用。
背景技术
平原人进入高原后，由于高原地区空气稀薄、大气压低、氧分压低等环境因素，直接影响机体的体力和军事作业能力。其中，高原低氧对机体的影响最为明显，在高原缺氧环境下从事一定的体力或脑力劳动后，极易造成血乳酸及其它代谢物堆积，并且造成机体代谢性酸碱紊乱，从而肌肉张力下降而导致疲劳现象的产生，从而表现出劳动能力普遍下降，严重者丧失作业能力。随着海拔高度的提升，劳动能力明显降低。因此，积极探索具有抗疲劳作用的药是十分重要的，筛选有效的预防和缓解疲劳的产品，对于提高高原环境下机体的体力劳动能力、缓解疲劳对于改善生活质量、提高工作效率和军事作业能力都有积极的意义。
栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实,为临床常用中药。其性寒味苦,无毒,入心、肝、肺、三焦经,具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效。药理学研究表明以栀子的药理作用广泛，具有保肝、利胆、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血糖血脂等多种药理活性，是极其重要而且具有很大开发利用价值的中药材成分。其中栀子主要的活性成分西红花苷，同时也是藏药西红花的主要活性物质，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化及调节血脂的作用，是自然界唯一的一种天然的类胡萝卜素色素，由西红花酸(crocetin)与二分子龙胆二糖结合而成，包括西红花苷-I 与西红花苷- II，具有较高的经济价值，被广泛应用于食品、医药和化妆品领域中。有研究表明，西红花苷和西红花酸具有清除自由基及显著地抗氧化作用，而类胡萝卜素的药理作用机制中 ,其抗氧化活性尤为重要，且有文献报道，具有清除活性氧、自由基和抗氧化作用的药物可提高动物的耐缺氧能力，减轻组织缺氧损伤。
由于西红花产量极低，市场价格偏高，而栀子黄色素和西红花具有相同的活性成分西红花苷，因此，有必要对栀子黄色素进行科学、有效地开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易行的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法。
本发明所要解决的技术问题是提供该栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的应用。
为解决上述问题，本发明所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至20~40目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉；
⑵将所述栀子粉用25℃蒸馏水配制成20~40 mg/mL的水溶液；
⑶将所述步骤⑵所得的水溶液按1.0~3.0倍的柱体积以1.5~15mL/min的流速注入8cm×100 cm处理过的14~30目聚酰胺柱，再按1.0~3.0倍的柱体积以5.0~10.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液；
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按1.0~3.0倍的柱体积以5.0~10.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按2.0~10.0倍的柱体积以1.5~10.0 mL/min的流速用体积浓度为10~70%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到10~70%的乙醇洗脱液，该10~70%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物；
⑸先按1.0~3.0倍的柱体积以5.0~10.0mL mL/min的流速用体积浓度为10~30%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按2.0~10.0倍的柱体积以1.5~10.0 mL/min的流速用体积浓度为30~90%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到30~90%的乙醇洗脱液，该30~90%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
所述步骤⑴中煎煮提取条件是指料液质量比为1:8~10，温度为90~100℃，次数为2~3次，每次时间为1小时。
所述步骤⑴、所述步骤⑷和所述步骤⑸中减压浓缩的条件均是指温度为50℃~80℃。
所述步骤⑴中喷雾干燥的条件是指温度为120~140℃，单位时间进风量20~30 m3，喷雾压力0.1~0.4MPa。
所述步骤⑷和所述步骤⑸中冷冻干燥的条件均是指温度为-55℃~20℃，真空度为0.2MPa~0.5 MPa。
所述步骤⑷中大孔树脂柱是指D-101、HPD100、XDA-6、 DM-130、DA201型大孔树脂中的任意一种。
所述步骤⑶中的处理过的聚酰胺柱和所述步骤⑷中处理过的大孔树脂柱均是指先用体积浓度为95%的乙醇洗脱，直至乙醇洗脱液加蒸馏水不出现浑浊为止，再以蒸馏水洗脱柱子至无醇味，即得。
所述步骤⑶中的处理过的聚酰胺柱的尺寸为8cm×100 cm。
如上所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法所得到的栀子黄色素作为抗缺氧活性成分在医药上的应用，其特征在于：以栀子黄色素为活性成分，配以药用铺料制备成药剂学上的任何一种剂型；或以栀子黄色素为活性成分，添加抗氧化和/或抗疲劳活性成分组成复方，并配以药用辅料制备成药剂学上的任何一种剂型。
所述剂型是指硬胶囊、软胶囊、普通片、糖衣片、薄膜衣片、异型片、咀嚼片、泡腾片、分散片、颗粒剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂中的任意一种。
如上所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法所得到的栀子黄色素作为抗氧化、抗疲劳功能的活性成分在制备抗氧化或抗疲劳保健品方面的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明提取的栀子黄色素作为抗缺氧活性成分的药效可以从以下4个实验中体现：
实验1 栀子有效部位急性毒性实验
⑴实验目的：筛选栀子有效部位毒性成分。
⑵实验条件：三级动物实验室，室温20~25℃，空调恒温。
⑶实验对象：动物 BalB/C小鼠90只，雌雄各半，体重20±2g，由***兰州总医院动物实验科提供，合格证号：甘肃省医动字第1402-0201号。
⑷药材与仪器：栀子水提取物，栀子多糖，栀子黄色素，栀子苷由实验室自制，临用前制成0.1g/mL水溶液；4%多聚甲醛(批号：20150727北京索莱宝科技有限公司)灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司，批号：M15111005）。
光学显微镜(日本Nikon公司，E200)；组织切片机(德国美康公司，HM340E)；TB-718E型生物组织自动包埋机(湖北泰雅电子技术有限公司)。
⑸实验方法
①将50只BALB/C小鼠（雌雄各半）随机分为空白对照组（0.1mL/10g灭菌注射用水），栀子水提取物（1.0g.kg-1.d-1），栀子黄色素组（1.0g.kg-1.d-1）,栀子多组（1.0g.kg-1.d-1），栀子苷（1.0g.kg-1.d-1），灌胃给药，连续5天。观察小鼠生理现象、体重变化。
②将40只BALB/C小鼠（雌雄各半）随机分为空白对照组（0.1mL/10g灭菌注射用水），栀子苷低剂量组（0.5g.kg-1.d-1），栀子苷中剂量组（1.0g.kg-1.d-1），栀子苷高剂量组（2.0g.kg-1.d-1），连续5天，灌胃给药。观察小鼠生理现象、体重变化。解剖小鼠取半截小肠，用生理盐水冲洗干净后，于5mL EP管中加入4mL 4%多聚甲醛固定小肠，常温放置24h后做病理切片，进行HE染色。
⑹实验结果
给药栀子黄色素组小鼠表现正常，没有任何中毒现象，具有安全性。
给药后栀子苷组小鼠精神萎靡，行动缓慢，表现出严重的拉稀现象，大便颜色为深蓝色，尾巴局部出现蓝色斑点，给药二天后，栀子苷组小鼠已出现死亡现象，给药三天后，栀子苷组雄鼠全部死亡，雌鼠只存活1只。栀子水提取物组小鼠有轻微的拉稀现象。栀子水提取物和栀子苷小鼠体重减轻，其中，栀子苷组小鼠体重变化明显。其他组都比较正常。
栀子苷对小鼠小肠组织病理改变的影响：HE染色结果显示，空白组小鼠小肠组织结构正常，粘液分泌正常（图1A)。栀子苷低剂量组小鼠小肠组织变化明显，粘液分泌亢进（图1B）。栀子苷高剂量组小肠粘液分泌更加明显（图1C)。
⑺讨论
栀子黄色素主要成分是类胡萝卜素类的藏花素(crocin)和藏花酸(crocetin)，具有保护心肌细胞、抗动脉粥样硬化、抗氧化、调血脂、抗凝血和抗血栓等药理作用。上述实验研究发现栀子黄色素没有毒副作用，安全性良好。
栀子苷可以促进大肠的蠕动，具有泻下功效。栀子水提物及栀子苷口服给药，对动物均有显著的泻下作用。上述实验结果表明栀子苷具有毒性，且毒性相当明显，栀子水提取物中会含有部分栀子苷，所以小鼠也会表现出轻微拉稀现象，而栀子苷组小鼠拉稀现象严重，小肠粘液分泌增多，体重变化明显，死亡率极高，具有严重的毒性。
实验2 栀子不同提取部位的体外抗氧化活性试验
⑴实验目的：通过体外抗氧化实验筛选栀子的抗氧化活性成分。
⑵试剂与仪器：
①药材与试剂
栀子，购自兰州黄河中药材市场，全部经甘肃中医药大学杨锡仓主任中药师鉴定为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 ( DPPH，Solarbio公司，批号101029108) ，2,2-联氮基-双-( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐( ABTS，Solarbio公司，批号20151104)，TRIS（Solarbio公司，批号77861）,抗坏血酸( VC，Solarbio公司，批号50817)，焦性没食子酸（Solarbio公司，批号 20151202）,1,10-菲啰啉（Solarbio公司，批号20150916），乙二胺四乙酸( EDTA，Aladdin 公司，批号46631)；亚硝基铁***，硝酸铝，氢氧化钠，亚硝酸钠，铁***，磷酸二氢钠，钼酸铵，硫酸亚铁，硫酸，硫代巴比妥酸，卵磷脂，硫代硫酸钠，碘化钾，30%双氧水，三氯化铁，乙二胺四乙酸二钠，三氯乙酸，磷酸钠，过硫酸钾，冰乙酸等均为市售分析纯试剂；
②仪器
3K15型高速冷冻离心机（美国 Sigma公司）；SpectraMax® i3型全自动荧光酶标仪（美国 Molecular Devices公司）；WD-9403F型紫外-可见分光光度计（美国惠普公司）；BP210S型电子天平（德国 Sartorius公司）；DK-8A型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；冷冻干燥机(西班牙 Telster LyoQuest-55 plus型)。实验温度20~25℃, 空调恒温，相对湿度：40%~70%。
⑶实验方法
①DPPH自由基清除试验
依据文献，将不同质量浓度(0.03~0.5mg/mL)的样品和VC溶液125μL，分别加入125μL0.1mmol /L DPPH 95%乙醇溶液中，暗处室温反应 30min，以 95%乙醇溶剂做空白对照，测量其在波长517nm处的吸光度(Ai)；测定125μL DPPH 95%乙醇溶液与125μL 95% 乙醇混合后在波517nm处的吸光度(A0)；测定125μL 95% 乙醇溶液与 125μL样品溶液在波长517nm处的吸光度(Aj)。按式(1)计算其清除率，并计算其 EC50。
清除率( % ) = ( 1－( Ai－Aj) /A0) × 100
②ABTS自由基清除试验
将等体积的7mmol/L ABTS溶液与2.45mmol/L过硫酸钾混合使之反应并置于暗处12～16h，制备ABTS自由基。用95%乙醇将ABTS自由基溶液稀释至其在波长734nm处吸光度为0.70± 0.02。将100μL不同质量浓度（0.08～2.0mg/mL）样品和VC 溶液加入3.9mL ABTS自由基溶液中，室温放置10min，测量其在波长734nm处的吸光度(Ai)；测定3.9mL ABTS自由基溶液与100μL95%乙醇混合后在波长734nm处的吸光度(A0)；测定3.9mL 95%乙醇溶液与100μL样品溶液在波长734nm处的吸光度(Aj)。按式(1)计算其清除率，并计算其 EC50。
③羟基自由基清除试验
取 0.75 mmol /L的邻二氮菲1.0 mL，pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液2.0mL，40 μg /mL ，0.75 mmol /L 的FeSO41.0 mL，不同质量浓度的样品溶液1.0mL，0.01% H2O2 1. 0 mL(新鲜配制)，混合后在37℃水浴中反应60 min后在520 nm处测定吸光度As。空白组以1.0 mL 蒸馏水代替样品测定吸光度A0，对照组以1.0mL 蒸馏水代替 H2O2 和样品测定光密度 Ac，用4.0mL蒸馏水和2.0mL磷酸盐缓冲溶液调零。按式(2)计算其清除率，并计算其 EC50。
清除率（%）=（As-A0）/（Ac- A0）
④抗脂质过氧化试验
将300 mg卵磷脂溶解于30 mL 10 mmol/L、pH=7.40的磷酸盐缓冲溶液中,冰浴震荡,制得卵磷脂溶液。取卵磷脂溶液0.20 mL，加入pH 7.40的磷酸缓冲溶液1.0 mL，不同浓度（0.08～2.0mg/mL）的样品溶液 0.50 mL,2.5 mmol /L EDTA-Fe(Ⅱ) 1.0 mL，混匀后于37℃水浴中反应45 min，再加入28% ( m /V) 的三氯乙酸2.0 mL，1% ( m /V) 的硫代巴比妥酸1.0 mL，混匀后置于100 ℃沸水浴中加热10 min，冷却后在523nm处测定吸光度A样,用磷酸盐缓冲液调零，空白管用磷酸盐缓冲液代替样品测光密度A0。根据式(3)计算相应的抑制率并与Vc进行比较。
抑制率（%）=（A0－A样）/ A0
⑤总还原能力的测定
将不同质量浓度的样品溶液 (0.25～10.0 mg/mL ) 1.0 mL，加入2.5 mL pH =6.6的磷酸盐缓冲液，2.5 mL 1%的铁***溶液，得混合溶液，置于50℃水浴保温20 min，再加入2. 5 mL10%三氯乙酸溶液，将所得混合溶液离心(3 000 r·min-1，10 min)，倾取上清液，精密吸取2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% 的三氯化铁溶液，在700 nm处检测吸光度A并与Vc进行比较。
⑥总抗氧化能力的测定
将不同质量浓度的样品溶液(0.08～2.0 mg/mL) 0. 1 mL，加入1.0 mL试剂溶液(试剂溶液中包括 0.6mol/L的硫酸，28 mmol/L的磷酸钠，4mmol/L的钼酸铵)。混合液置于95℃水浴孵育90 min。放冷至室温,以蒸馏水为空白，于波长695 nm处测吸光度A并与Vc进行比较。
⑷栀子不同提取部位体外抗氧化结果
①栀子不同提取部位对DPPH自由基的清除作用
由图2可知，栀子的不同提取部位对DPPH自由基的清除能力存在明显差异，Vc、栀子黄色素和栀子粗提物具有明显的清除自由基的能力。其中，Vc和栀子黄色素对DPPH自由基的清除作用显著，且随着浓度的增加，栀子黄色素对DPPH自由基的清除作用增强，在0.03-0.5mg/mL浓度范围内呈明显的量效关系，计算得出栀子黄色素对DPPH自由基的IC50为0.188mg/mL。栀子苷和多糖对DPPH自由基的清除能力相当，活性较小。
②栀子不同提取部位对ABTS自由基的清除作用
由图3可知，栀子的不同提取部位对ABTS自由基的清除能力存在明显差异，Vc、栀子黄色素和栀子粗提物具有明显的清除自由基的能力。其中，Vc和栀子黄色素对ABTS自由基的清除作用显著，Vc的清除能力显著高于栀子各提取物。且随着浓度的增加，Vc、栀子黄色素和栀子粗提物对ABTS自由基的清除作用增强，在0.08～2.0mg/mL浓度范围内呈明显的量效关系，计算得出Vc、栀子黄色素对ABTS自由基的IC50分别为0.078 mg/mL、0.510 mg/mL。栀子苷和多糖部分对ABTS自由基的清除能力均较弱，且随着浓度的增加没有显著变化。
③栀子不同提取部位对羟基自由基的清除作用
由图4可知，栀子的不同提取部位均表现出对羟基自由基的不同程度的清除能力，Vc、栀子黄色素和栀子粗提物具有明显的清除羟基自由基的能力。其中，栀子黄色素和栀子粗提物对羟基自由基有明显的清除作用，Vc的清除能力显著高于栀子各提取物。且随着浓度的增加，栀子黄色素和栀子粗提物对羟基自由基的清除作用增强，在0.09～0.5mg/mL浓度范围内呈明显的量效关系，计算得出栀子黄色素和栀子粗提物对羟基自由基的IC50分别为0.198mg/mL、0.327mg/mL。栀子苷和多糖部分对羟基自由基的清除能力均较弱，且随着浓度的增加没有显著变化。
④栀子不同提取部位对脂质过氧化的抑制作用
由图5可知，栀子的不同提取部位均表现出不同程度的抗脂质过氧化的能力，在相同浓度范围0.08～2.0mg/mL内，栀子黄色素的抗脂质过氧化能力最强且明显高于栀子粗提物，且随浓度的增大，其抗脂质过氧化能力逐渐增强。栀子苷和多糖类成分的脂质抗氧化能力最弱且明显低于栀子黄色素和栀子粗提物，浓度增大时，二者的抗脂质过氧化能力随浓度增加没有明显变化。
⑤栀子不同提取部位总还原能力的测定
各物质的还原能力在一定程度上反应了其抗氧化活性，铁***被抗氧化物质还原成亚铁***，亚铁***与三价铁离子生成的物质在700nm处有最大吸收峰。吸光度越大物质的还原能力越强。如图6，在相同浓度范围0.25～10.0 mg/mL内，栀子各提取部位随浓度的增大吸光度提高，其中，栀子黄色素和栀子粗提物的吸光度值随浓度的增大而明显增大，栀子黄色素尤为显著，与Vc作用趋势相近。
⑥栀子不同提取部位总抗氧化能力的测定
如图7，栀子各提取部位和Vc在相同浓度范围0.08～2.0 mg/mL内，在695nm下测定总抗氧化能力得到的吸光度随着浓度的增大而升高。其中，栀子黄色素的作用趋势比较明显，栀子苷和多糖类成分的吸光度值几乎不随浓度的增加而改变。
⑸结论：
本实验对栀子各提取物体外清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的能力及脂质过氧化抑制能力、总还原能力、总抗氧化能力进行了研究，结果表明，栀子各提取物对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基及脂质过氧化抑制能力、总还原能力、总抗氧化能力均表现出一定的抗氧化能力，且相关性基本一致，其中栀子黄色素对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的IC50分别为0.188 mg/mL、0.510 mg/mL、0.198mg/mL，并且具有一定的脂质过氧化抑制能力、还原能力和总抗氧化能力，在一定浓度范围内，随着栀子黄色素浓度的增加，其抗氧化活性增强。因此栀子黄色素可以有效地清除自由基，具有良好的抗氧还能力。
实验3 小鼠常压密闭实验
⑴实验目的：通过小鼠常压密闭实验筛选栀子有效部位抗缺氧活性成分。
⑵实验条件：三级动物实验室，室温20～25℃，空调恒温。
⑶实验对象：动物 BalB/C小鼠60只，体重20±2g，由***兰州总医院动物实验科提供，合格证号：甘肃省医动字第1402-0201号。
⑷药材与仪器：栀子水提取物，栀子多糖，栀子黄色素，栀子苷由实验室自制，临用前制成0.05g/mL水溶液。红景天胶囊（中国人民解放军西藏军区红景天研制中心，批号：130604）临用前制成0.05g/mL。灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司，批号：M15111005）。
电热鼓风干燥箱（101A,上海实验仪器厂）；BP210S 电子天平(德国 Sartorius 公司)。
⑸实验方法
①将60只BALB/C小鼠（雌雄各半）随机分为空白对照组（0.1mL/10g蒸馏水），红景天组（0.5g.kg-1.d-1）栀子乙醇提取物组（0.5g.kg-1.d-1），栀子黄色素组（0.5g.kg-1.d-1），栀子多糖组（0.5g.kg-1.d-1），栀子苷组（0.5g.kg-1.d-1），灌胃给药，连续5天。末次给药1h后将小鼠放入盛有5 g钠石灰（吸收二氧化碳和水）的200 mL磨口广口瓶内，每瓶放1只小鼠，并且用凡士林涂抹瓶口，盖严防止漏气,立即计时。以小鼠呼吸停止(小鼠胸部不起伏)时间为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。
②将60只BALB/C小鼠（雌雄各半）随机分为空白对照组（0.1mL/10g蒸馏水），模型组（0.1mL/10g蒸馏水），红景天组（1.0g.kg-1.d-1），栀子黄色素低剂量组（(0.25g.kg-1.d-1)，栀子黄色素中剂量组（(0.5g.kg-1.d-1)，栀子黄色素高剂量组(1.0g.kg-1.d-1)，灌胃给药，连续5天。末次给药1h后将小鼠放入盛有5 g钠石灰的200 mL磨口广口瓶内，每瓶放1只小鼠，用凡士林涂抹瓶口，盖严防止漏气,立即计时。以小鼠呼吸停止(小鼠胸部不起伏)时间为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。取脑组织和肺组织测定湿质量，并与55℃电热鼓风干燥箱中干燥3天，测脑组织和肺组织的干质量，通过公式（湿质量-干质量）/湿质量×100 计算脑肺组织含水量。
⑹实验结果
①栀子有效部位对常压密闭小鼠抗缺氧时间的影响与空白组(NG)比较，抗缺氧时间增长，栀子黄色素组(Crocin)小鼠抗缺氧时间明显增加(P<0.01)。与阳性药红景天组(Rhodiola)比较，栀子黄色素组(crocin)小鼠抗缺氧时间明显增加。结果见表1：
表1栀子有效部位各组小鼠常压密闭抗缺氧时间（，n＝10）
Tab. 1 The time of mice sustaining anoxia at common atmosphere in eachgroup of the effective-part of Gardenia（，n＝10）
注：*p<0.05,**p<0.01,给药组vs空白组。
Note: *p<0.05,**p<0.01,medicated group compared with NG
②栀子黄色素低中高各剂量组(Crocin-L,Crocin-M,Crocin-H)小鼠常压密闭抗缺氧时间与模型组相比有所增加，栀子黄色素高剂量组(Crocin-H)与模型组(MG)抗缺氧时间相比具有显著性（P<0.05）。结果见表2：
表2栀子黄色素各组小鼠常压密闭抗缺氧时间（，n＝10）
Tab. 2 The time of mice sustaining anoxia at common atmosphere in eachgroup of crocin
（，n＝10）
注：*p<0.05,**p<0.01,给药组vs模型组。
Note:Note: *p<0.05,**p<0.01,medicated group compared with NG
③栀子黄色素(Crocin)对小鼠肺组织和脑组织含水量的影响：与空白组比较，模型组(MG)小鼠肺组织含水量明显增加（P<0.01），脑组织含水量也明显增加（P<0.05)。红景天组(Rhodiola)和栀子黄色素低中高各组(Crocin-L,Crocin-M,Crocin-H)小鼠肺组织和脑组织含水量与模型组相比明显减少（P<0.05或P<0.01），与空白组(NG)相比无明显变化。结果见表3：
表3栀子黄色素对小鼠肺组织和脑组织含水量的影响（，n＝10）
Tab. 3 Effect of Crocin on the water content of lung and brain in mice (x±s, n=10)
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，给药组vs模型组。
Note： **P＜0.01,*P＜0.05，MG compared with NG group;## P＜0.01，# P＜0.05，medicated group compared with NG group
⑺讨论
组织缺血缺氧主要表现为细胞氧化过程障碍、能量生成不足、无氧代谢产物蓄积 、细胞功能紊乱、甚至细胞结构改变。常压缺氧为非特异性缺氧，小鼠在密闭容器中受缺氧因素损害，主要反映在心和脑缺氧。有研究报道反式西红花酸钠盐能降低急性缺氧大鼠死亡率，表明西红花酸能够提高动物的耐缺 氧能力。红景天有抗缺氧的作用， 能明显提高小鼠心肌的耐缺氧能力。本实验以红景天作为阳性药，研究栀子黄色素（Crocin）抗缺氧活性，结果表明：栀子黄色素（Crocin）对小鼠常压缺氧条件的存活时间有显著的延长作用。缺氧引起肺动脉压增高和血流动力学的改变；炎症介质会导致血管内皮受损，通透性升高，大量液体进入肺间质，而进入肺间质的液体不能被有效吸收后会进入肺泡，从而形成肺泡性肺水肿。缺氧可以引起血脑屏障（BBB）通透性增加，而BBB通透性增加会应发血管性脑水肿。本实验研究发现栀子黄色素（Crocin）能显著减轻常压密闭小鼠肺组织和脑组织含水量，即能减轻脑水肿和肺水肿。
实验4 低压低氧环境下小鼠力竭游泳实验
⑴实验目的：通过模拟低压低氧环境研究栀子黄色素的抗疲劳活性。
⑵实验条件：三级动物实验室，室温20～25℃, 空调恒温，相对湿度: 40%～70%。
⑶实验对象：动物 BalB/C小鼠60只，体重20±2g，由***兰州总医院动物实验科提供，合格证号：甘肃省医动字第1402-0201号。
⑷试剂与仪器：
①试剂：红景天胶囊（中国人民解放军西藏军区红景天研制中心，批号：130604）；大孔吸附树脂(D101 净品型，天津市海光化工有限公司，批号: 070305)；75%乙醇（山东利尔康消毒科技股份有限公司，批号：130619）；CK测试盒（生产批号：20151201）、肝/肌糖原试剂盒（生产批号：20151202）、超微量ATP(Na+K+)测试盒（生产批号：20151203）、超微量ATP(生产批号：Ca2+Mg2+)、测试盒（生产批号：20151203）、 琥珀酸脱氢酶（生产批号：SDH）测试盒（20151203）、丙酮酸激酶（PK）试剂盒（生产批号：20151203）、丙二醛（生产批号：MDA）测试盒（20151202）、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒(生产批号：20151203)、 丙酮酸试剂盒（生产批号：20151203）、考马斯亮兰（生产批号：20151218）、SOD试剂盒（测总）（生产批号：20151130）、BCA测定试剂盒（生产批号：20151203）、乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（生产批号：20151006）、乳酸（LD）测试盒（生产批号：20151014）均由南京建成生物技术研究所提供；10×PBS（批号：20140807）购自北京索莱宝科技有限公司。电热鼓风干燥箱（101A,上海实验仪器厂）；BP210S 电子天平(德国 Sartorius 公司)。
②仪器：DYC-9070型模拟高原低压低氧动物实验舱（贵州风雷航空军械有限责任公司）； 3K15型高速冷冻离心机（美国 Sigma公司）； SpectraMax® i3型全自动荧光酶标仪（美国 Molecular Devices公司）；动物全血细胞分析仪（XT-2000i, 日本 希森美康）；WD-9403F型紫外-可见分光光度计（美国惠普公司）； BP210S型电子天平（德国 Sartorius公司）； DK-8A型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）； TB-718E型生物组织自动包埋机（湖北泰雅电子技术有限公司）； E200型光学显微镜（日本 Nikon公司）； HM340E型组织切片机 （德国 美康公司）；电动匀浆器（Polytron@PT 1200E, Kinematica AG公司），冷冻干燥机(西班牙 Telster LyoQuest-55 plus型)。
⑸实验方法
①小鼠力竭游泳时间检测
72只BALB/C小鼠，随机分为6组，即常氧对照组，模型组、红景天胶囊阳性对照组及栀子黄色素低、中、高剂量组，每组12只。常氧对照组及模型组灌胃灭菌注射用水（0.2mL/20g），剩余各组分别灌胃给予相应试药。除常氧对照组外其余各组均置于大型低压氧舱中模拟海拔8000 m高原环境（舱内压力：35.9 kPa，氧分压：7.4 kPa），每天上午9：00以10 m•s-1流速下降至4000 m（舱内压力：62.1 kPa，氧分压：13.8 kPa），实验人员进舱，在舱里灌胃给药，换水食和垫料，连续5 d，每天给药完毕后，将舱内高度以10 m•s-1的流速匀速上升到预定海拨8000 m，在此期间动物自由摄食及进水。常氧对照组大鼠于动物房同时饲养。末次给药1h后，在海拔4000 m实验，以小鼠体质量7%的负荷(铅丝）系于1/3尾巴处，放入水深18 cm的水槽（50 cm×40 cm×30 cm）中，水温控制在（25±1）℃，进行负重游泳，记录小鼠从放入水槽至小鼠沉入水7 s未能浮在水面上的时间，即为小鼠力竭游泳时间。
②小鼠血清水平检测
力竭游泳后，立即取出，摘眼球取血，静置1 h后3500 r/min离心10 min，分离得到血清。
③血常规
取20 μl EDTA抗凝血，加入180 μl 血液稀释液后，在动物全血细胞分析仪上检测血常规指标。
④小鼠肌肉及肝组织活性检测
颈椎脱臼处死后，取两后肢的股四头肌及肝脏，用冰生理盐水洗净擦干，称取140-150mg组织，冷的PBS制成10%匀浆，3500 r/min离心10 min, 取上清液。
⑤统计学处理
应用 SPSS 17.0 统计软件进行统计学处理。结果以表示，组间比较采用方差分析和t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
⑹动物实验结果
①各组小鼠游泳力竭时间检测
与常氧对照组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素低、中、高剂量组能显著的延长小鼠力竭游泳时间，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。各组小鼠力竭游泳时间见表4。
表4 小鼠力竭游泳时间结果（，n＝12）
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
②各组小鼠代谢产物检测 与常氧组比较， 缺氧模型组小鼠血尿素氮的含量显著的升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与缺氧模型组比较红景天胶囊组及栀子黄色素高、中剂量组能显著降低血尿素氮的含量，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与常氧组比较，模型组小鼠肝脏、肌肉及血清中的丙酮酸含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素高剂量组能显著的提高肝脏、肌肉 及血清中丙酮酸的含量，栀子黄色素中剂量组也能提高血清中丙酮酸的含量，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与常氧组比较，缺氧模型组小鼠肝脏、肌肉及血清中乳酸含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素高剂量组能显著降低小鼠肝脏、肌肉及血清中乳酸含量，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）栀子黄色素中、低剂量组也能降低血清中乳酸的含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。各组小鼠肝脏、肌肉、血清中BUN、丙酮酸及LD的检测结果见表5：
表5 各组小鼠肝脏、肌肉、血清中BUN、丙酮酸及LD的检测（，n＝12）
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
③各组小鼠氧化指标检测 与常氧组比较， 缺氧模型组小鼠肝脏、肌肉中GSH显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素高剂量组能显著的提高GSH含量，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），栀子黄色素中剂量组也能提高肝脏中GSH的含量，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与常氧组比较，缺氧模型组小鼠肝脏、肌肉中MDA含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素中、高剂量组能显著的降低小鼠肝脏及肌肉组织中MDA含量，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；与常氧组比较，缺氧模型组小鼠肝脏、肌肉及血清中SOD活性显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与缺氧组比较，红景天胶囊剂栀子黄色素高剂量组能显著的提高小鼠肝脏、肌肉及血清中SOD活性，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），且栀子黄色素中、低剂量组也能提高肝脏和肌肉中SOD的含量，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。各组小鼠肝脏、肌肉、血清中GSH、 MDA、 SOD检测结果见表6。
表6各组小鼠肝脏、肌肉、血清中GSH、 MDA、 SOD检测结果
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
④各组小鼠代谢调节酶检测
与常氧组比较，缺氧模型组小鼠肝脏、肌肉、血清中LDH活性减弱，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素组高剂量组小鼠肝脏、肌肉、血清中LDH活性增强，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），栀子黄色素中剂量组也能提高血清中LDH的含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。各组小鼠肝脏、肌肉、血清中LDH检测结果见表7。
表7 各组小鼠肝脏、肌肉、血清中LDH检测结果
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
⑤各组小鼠能量代谢酶检测
与常氧组比较，缺氧模型组小鼠肝脏、肌肉及血清中MDH、SDH、PK、Ca-Mg-ATP酶及Na-K-ATP酶活性显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素中、高剂量组能显著的增强小鼠肌肉组织中MDH、SDH、PK、Ca-Mg-ATP酶及Na-K-ATP酶活性，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），栀子黄色素低剂量组也能提高肌肉中SDH、血清中PK及肝脏中Na-K-ATP酶活性，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结果见表8、表9：
表8 各组小鼠肝脏、肌肉、血清中MDH、SDH、PK、Ca-Mg-ATP酶及Na-K-ATP酶检测结果
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
表9 各组小鼠Ca-Mg-ATP酶、Na-K-ATP及CK酶检测结果
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
⑥各组小鼠储能物质检测
与常氧组比较，缺氧模型组小鼠糖原含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与缺氧模型组比较，红景天胶囊组及栀子黄色素各剂量组能显著增加糖原储备量，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。各组小鼠糖原检测结果见表10。
表10各组小鼠糖原检测结果
注： **P＜0.01,*P＜0.05模型组vs 空白对照组；## P＜0.01，# P＜0.05，模型组vs给药组。
⑺讨论：
结果表明，栀子黄色素具有良好的抗疲劳效果。栀子黄色素可以增强乳酸脱氢酶的活力，减少乳酸堆积，降低BUN的浓度，可见栀子黄色素能够减轻肌肉组织损伤，从而减少能源物质的消耗，延缓疲劳；肝糖原存储量作为体内能源物质的评价指标，栀子黄色素能够通过升高肌糖元和肝糖元水平，运动时增加 ATP 的释放, 促进能量代谢；通过减少因剧烈运动引起的膜结构损伤，降低CK酶活性，维持内环境稳态，进而增加运动强度及运动时间，实现其抗运动疲劳功效；SOD 广泛存在于机体细胞中，可清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基，保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭超氧自由基的破坏，MDA可直接反映出自由基水平, 其含量高低是组织细胞损伤的重要标志，可知栀子黄色素在清除自由基、抗氧化方面效果显著，从而达到抗疲劳的效果；SDH 活性的变化可反映细胞能量代谢情况，栀子黄色素能增强SDH 和MDH 活性 , 促进机体有氧氧化代谢；PK是糖酵解途径的限速酶，在酵解过程中起着决定性作用，栀子黄色素能增加PK含量，促进糖酵解，增加ATP，从而达到抗疲劳的效果。
2、本发明可有效分离富集高色价栀子黄色素，同时也将栀子苷进行了富集和纯化，从而提高了药材的利用率，为将栀子黄色素科学、有效地开发，进而应用于运动营养食品领域奠定了基础。
3、本发明简单易行、操作方便、安全、重复性好，可工业化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明的小鼠小肠病理切片图。
图2为本发明栀子不同提取部位对DPPH自由基的清除率。
图3为本发明栀子不同提取部位对ABTS自由基的清除率。
图4为本发明栀子不同提取部位对羟基自由基的清除率。
图5为本发明栀子不同提取部位的脂质抗氧化能力。
图6 为本发明栀子不同提取部位的总还原能力。
图7 为本发明栀子不同提取部位的总抗氧化能力。
具体实施方式
实施例1 栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至20目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉。
其中：煎煮提取条件是指料液质量比（g/g）为1：8，温度为90℃，次数为2次，每次时间为1小时。
减压浓缩的条燥的件是指温度为50℃。
喷雾干燥的条件是指温度为120℃，单位时间进风量20 m3，喷雾压力0.1MPa。
⑵将栀子粉用25℃蒸馏水配制成20 mg/mL的水溶液。
⑶将步骤⑵所得的水溶液按1.0倍的柱体积以1.5mL/min的流速注入处理过的14目聚酰胺柱，再按1.0倍的柱体积以5.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液。
其中：处理过的聚酰胺柱是指将尺寸为8cm×100 cm的聚酰胺柱先用体积浓度为95%的乙醇洗脱，直至乙醇洗脱液加蒸馏水不出现浑浊为止，再以蒸馏水洗脱柱子至无醇味，即得。
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按1.0倍的柱体积以5.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按2.0倍的柱体积以1.5 mL/min的流速用体积浓度为30%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到30%的乙醇洗脱液，该30%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物。
其中：大孔树脂柱是指D-101型大孔树脂。
减压浓缩的条件是指温度为50℃。
冷冻干燥的条件是指温度为-55℃，真空度为0.5MPa。
处理过的大孔树脂柱是指将大孔树脂先用体积浓度为95%的乙醇洗脱，直至乙醇洗脱液加蒸馏水不出现浑浊为止，再以蒸馏水洗脱柱子至无醇味，即得。
⑸先按1.0倍的柱体积以5.0mL mL/min的流速用体积浓度为10%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按2.0倍的柱体积以1.5 mL/min的流速用体积浓度为75%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到75%的乙醇洗脱液，该75%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
其中：减压浓缩的条件是指温度为50℃。
冷冻干燥的条件是指温度为-55℃，真空度为0.5MPa。
实施例2 栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至30目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉。
其中：煎煮提取条件是指料液质量比（g/g）为1：10，温度为100℃，次数为3次，每次时间为1小时。
减压浓缩的条件是指温度为80℃。
喷雾干燥的条件是指温度为140℃，单位时间进风量30 m3，喷雾压力0.4MPa。
⑵将栀子粉用25℃蒸馏水配制成30 mg/mL的水溶液。
⑶将步骤⑵所得的水溶液按3.0倍的柱体积以15mL/min的流速注入处理过的30目聚酰胺柱，再按3.0倍的柱体积以10.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液。
其中：处理过的聚酰胺柱同实施例1。
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按3.0倍的柱体积以10.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按10.0倍的柱体积以10.0 mL/min的流速用体积浓度为10%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到10%的乙醇洗脱液，该10%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物。
其中：大孔树脂柱是指HPD100型大孔树脂。
减压浓缩的条件是指温度为80℃。
冷冻干燥的条件是指温度为20℃，真空度为0.2 MPa。
处理过的大孔树脂柱同实施例1。
⑸先按3.0倍的柱体积以10.0mL mL/min的流速用体积浓度为30%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按10.0倍的柱体积以10.0 mL/min的流速用体积浓度为30%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到30%的乙醇洗脱液，该30%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
其中：减压浓缩的条件是指温度为80℃。
冷冻干燥的条件是指温度为20℃，真空度为0.2 MPa。
实施例3 栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至40目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉。
其中：煎煮提取条件是指料液质量比（g/g）为1：9，温度为95℃，次数为2次，每次时间为1小时。
减压浓缩的条件是指温度为60℃。
喷雾干燥的条件是指温度为130℃，单位时间进风量25 m3，喷雾压力0.2MPa。
⑵将栀子粉用25℃蒸馏水配制成40 mg/mL的水溶液。
⑶将步骤⑵所得的水溶液按2.0倍的柱体积以5mL/min的流速注入处理过的20目聚酰胺柱，再按2.0倍的柱体积以8.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液。
其中：处理过的聚酰胺柱同实施例1。
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按2.0倍的柱体积以8.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按6.0倍的柱体积以5.0 mL/min的流速用体积浓度为30%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到30%的乙醇洗脱液，该30%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物。
其中：大孔树脂柱是指XDA-6型大孔树脂。
减压浓缩的条件是指温度为60℃。
冷冻干燥的条件是指温度为-30℃，真空度为0.3 MPa。
处理过的大孔树脂柱同实施例1。
⑸先按2.0倍的柱体积以8.0mL mL/min的流速用体积浓度为15%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按6.0倍的柱体积以5.0 mL/min的流速用体积浓度为50%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到50%的乙醇洗脱液，该50%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
其中：减压浓缩的条件是指温度为60℃。
冷冻干燥的条件是指温度为-30℃，真空度为0.3 MPa。
实施例4 栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至20目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉。
其中：煎煮提取条件是指料液质量比（g/g）为1：8.5，温度为92℃，次数为3次，每次时间为1小时。
减压浓缩的条件是指温度为70℃。
喷雾干燥的条件是指温度为125℃，单位时间进风量20 m3，喷雾压力0.3MPa。
⑵将栀子粉用25℃蒸馏水配制成20 mg/mL的水溶液。
⑶将步骤⑵所得的水溶液按1.5倍的柱体积以10mL/min的流速注入处理过的25目聚酰胺柱，再按1.5倍的柱体积以6.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液。
其中：处理过的聚酰胺柱同实施例1。
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按1.5倍的柱体积以6.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按4.0倍的柱体积以3.0 mL/min的流速用体积浓度为50%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到50%的乙醇洗脱液，该50%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物。
其中：大孔树脂柱是指DM-130型大孔树脂。
减压浓缩的条件是指温度为70℃。
冷冻干燥的条件是指温度为-10℃，真空度为0.4 MPa。
处理过的大孔树脂柱同实施例1。
⑸先按1.5倍的柱体积以6.0mL mL/min的流速用体积浓度为20%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按4.0倍的柱体积以3.0 mL/min的流速用体积浓度为75%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到75%的乙醇洗脱液，该75%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
其中：减压浓缩的条件是指温度为70℃。
冷冻干燥的条件是指温度为-10℃，真空度为0.4 MPa。
实施例5 栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至40目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉。
其中：煎煮提取条件是指料液质量比（g/g）为1：9.5，温度为98℃，次数为2次，每次时间为1小时。
减压浓缩的条件是指温度为80℃。
喷雾干燥的条件是指温度为140℃，单位时间进风量25 m3，喷雾压力0.1MPa。
⑵将栀子粉用25℃蒸馏水配制成40 mg/mL的水溶液。
⑶将步骤⑵所得的水溶液按2.5倍的柱体积以12mL/min的流速注入处理过的30目聚酰胺柱，再按2.5倍的柱体积以9.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液。
其中：处理过的聚酰胺柱同实施例1。
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按2.5倍的柱体积以9.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按6.0倍的柱体积以8.0 mL/min的流速用体积浓度为70%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到70%的乙醇洗脱液，该70%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物。
其中：大孔树脂柱是指DA201型大孔树脂。
减压浓缩的条件是指温度为80℃。
冷冻干燥的条件是指温度为10℃，真空度为0.4MPa。
处理过的大孔树脂柱同实施例1。
⑸先按2.5倍的柱体积以9.0mL mL/min的流速用体积浓度为25%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按8.0倍的柱体积以8.0 mL/min的流速用体积浓度为90%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到90%的乙醇洗脱液，该90%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
其中：减压浓缩的条件是指温度为80℃。
冷冻干燥的条件是指温度为10℃，真空度为0.4MPa。
上述实施例1~5中提取的栀子黄色素作为抗缺氧活性成分在医药上的应用是指：以栀子黄色素为活性成分，配以药用铺料制备成药剂学上的任何一种剂型；或以栀子黄色素为活性成分，添加抗氧化和/或抗疲劳活性成分组成复方，并配以药用辅料制备成药剂学上的任何一种剂型。剂型是指硬胶囊、软胶囊、普通片、糖衣片、薄膜衣片、异型片、咀嚼片、泡腾片、分散片、颗粒剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂中的任意一种。
实施例6 将实施例1~5所得栀子黄色素与肉苁蓉提取物按照1:1的比例进行混合，采用药剂学方法做成胶囊，用于预防和治疗高原缺氧型疲劳。
实施例7 将实施例1~5所得栀子黄色素与肉苁蓉提取物按照3:1的比例进行混合，采用药剂学方法做成分散片，用于预防和治疗高原缺氧型疲劳。
实施例8 将实施例1~5所得栀子黄色素与肉苁蓉提取物按照5:1的比例进行混合，采用药剂学方法做成颗粒剂，用于预防和治疗高原缺氧型疲劳。
实施例9 将实施例1~5所得栀子黄色素与肉苁蓉提取物按照7:1的比例进行混合，采用药剂学方法做成丸剂，用于预防和治疗高原缺氧型疲劳。
实施例10 将实施例1~5所得栀子黄色素与肉苁蓉提取物按照1:3的比例进行混合，采用药剂学方法做成溶液剂，用于预防和治疗高原缺氧型疲劳。
上述实施例1~5中所得到的栀子黄色素可作为抗氧化、抗疲劳功能的活性成分在制备抗氧化或抗疲劳保健品方面的应用。
Claims (10)
1.栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，包括以下步骤：
⑴将干燥、粉碎至20~40目的栀子果实用蒸馏水煎煮提取后，经过滤、减压浓缩、喷雾干燥，即得栀子粉；
⑵将所述栀子粉用25℃蒸馏水配制成20~40 mg/mL的水溶液；
⑶将所述步骤⑵所得的水溶液按1.0~3.0倍的柱体积以1.5~15mL/min的流速注入8cm×100 cm处理过的14~30目聚酰胺柱，再按1.0~3.0倍的柱体积以5.0~10.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗聚酰胺柱，分别得到聚酰胺柱上样流出液、水洗脱液；
⑷将聚酰胺上样流出液和水洗脱液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入处理过的大孔树脂柱，先按1.0~3.0倍的柱体积以5.0~10.0 mL/min的流速用蒸馏水冲洗大孔树脂柱，再按2.0~10.0倍的柱体积以1.5~10.0 mL/min的流速用体积浓度为10~70%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱，得到10~70%的乙醇洗脱液，该10~70%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子苷产物；
⑸先按1.0~3.0倍的柱体积以5.0~10.0mL mL/min的流速用体积浓度为10~30%的乙醇溶液冲洗聚酰胺柱除杂，再按2.0~10.0倍的柱体积以1.5~10.0 mL/min的流速用体积浓度为30~90%的乙醇溶液冲洗所述聚酰胺柱，得到30~90%的乙醇洗脱液，该30~90%的乙醇洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥后，即得栀子黄色素产物。
2.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，其特征在于：所述步骤⑴中煎煮提取条件是指料液质量比为1:8~10，温度为90~100℃，次数为2~3次，每次时间为1小时。
3.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，其特征在于：所述步骤⑴、所述步骤⑷和所述步骤⑸中减压浓缩的条件均是指温度为50℃~80℃。
4.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，其特征在于：所述步骤⑴中喷雾干燥的条件是指温度为120~140℃，单位时间进风量20~30 m3，喷雾压力0.1~0.4MPa。
5.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，其特征在于：所述步骤⑷和所述步骤⑸中冷冻干燥的条件均是指温度为-55℃~20℃，真空度为0.2MPa~0.5MPa。
6.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，其特征在于：所述步骤⑷中大孔树脂柱是指D-101、HPD100、XDA-6、 DM-130、DA201型大孔树脂中的任意一种。
7.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法，其特征在于：所述步骤⑶中的处理过的聚酰胺柱和所述步骤⑷中处理过的大孔树脂柱均是指先用体积浓度为95%的乙醇洗脱，直至乙醇洗脱液加蒸馏水不出现浑浊为止，再以蒸馏水洗脱柱子至无醇味，即得。
8.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法所得到的栀子黄色素作为抗缺氧活性成分在医药上的应用，其特征在于：以栀子黄色素为活性成分，配以药用铺料制备成药剂学上的任何一种剂型；或以栀子黄色素为活性成分，添加抗氧化和/或抗疲劳活性成分组成复方，并配以药用辅料制备成药剂学上的任何一种剂型。
9.如权利要求8所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法所得到的栀子黄色素作为抗缺氧活性成分在医药上的应用，其特征在于：所述剂型是指硬胶囊、软胶囊、普通片、糖衣片、薄膜衣片、异型片、咀嚼片、泡腾片、分散片、颗粒剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂中的任意一种。
10.如权利要求1所述的栀子中抗高原缺氧疲劳活性成分的分离方法所得到的栀子黄色素作为抗氧化、抗疲劳功能的活性成分在制备抗氧化或抗疲劳保健品方面的应用。
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