CN105961205A - 一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养领域，公布了一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，发明的组织培养方法包括以下步骤：(1)培养室消毒；(2)外植体的选择；(3)外植体的灭菌；(4)初始诱导培养；(5)继代培养；(6)炼苗，该方法利用植物处理液对外植体进行消毒，提高了在组织培养过程中外植体的成活率，同时还利用木薯酒精废液替代常用的MS培养基，能有效降低组培成本，利用本发明的组织培养方法，不仅能应用与珍珠番石榴的多种外植体，还能有效的对外植体表面进行消毒，还不会对外植体进行侵害，同时还能有效降低生产成本。
Description
【技术领域】
本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法。
【背景技术】
番石榴是桃金娘科番石榴属植物，原产热带美洲，现在很多热带、亚热带地区广为栽培，在我国主要分布于海南、广西、广东、福建和台湾等地，珍珠番石榴果树的生长对环境的要求很严格，现行番石榴果树的育苗方法多为嫁接培养，嫁接培养周期通常为1-2年才能获得珍珠番石榴幼苗，嫁接培养的培养周期长，而且培养方法复杂，目前，也有一些学者开始研究珍珠番石榴果树的组织培养方法，但是珍珠番石榴果树外植体容易染菌，造成褐化，对灭菌剂敏感，因此根据常规方法培养培养珍珠番石榴不容易成活。
目前，在进行植物的组织培养过程中，我国常用的灭菌消毒剂主要以升汞为主,国内外对汞的毒性作用进行了大量的研究,证实汞对细胞的每一生长过程都有重要影响,所以经过升汞灭菌的外植体,需彻底除去残留的Hg+,以消除微量的残留升汞对外植体的伤害，珍珠番石榴果树外植体不容易进行组织培养繁殖，因此，在珍珠番石榴组织培养过程中有必要提供一种理想的组织培养方法，不仅能应用与珍珠番石榴的多种外植体，还能有效的对外植体表面进行消毒，还不会对外植体进行侵害，同时还能有效降低生产成本。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种理想的组织培养方法，不仅能应用与珍珠番石榴的多种外植体，还能有效的对外植体表面进行消毒，还不会对外植体进行侵害，同时还能有效降低生产成本。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：
(1)培养室消毒：培养前12h-14h向关闭门窗的培养室进行灭菌消毒；
(2)外植体的选择：选择珍珠番石榴果树顶芽为外植体，外植体长1cm-2cm，直径0.4cm-0.8cm；
(3)外植体的灭菌：外植体经过水冲洗、75％的酒精浸泡沥干后，在质量浓度为8％-10％的植物处理液中浸泡20min-25min进行灭菌，所述植物处理液的组成及重量百分比为：30％-50％的灵芝提取液、10％-15％的辣蓼草提取液、5％-15％的大蒜提取液、10％-15％的洋葱提取液、5％-10％的藿香提取液、5％-15％的仙人掌提取液、5％-10％的螺旋藻提取液；
(4)初始诱导培养：将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为24℃-26℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为500Lx-800Lx，光照时间为12h-16h；
(5)继代培养：将步骤(4)中长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为24℃-26℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为700Lx-1400Lx，光照时间为18h-20h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养5-7代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养；
(6)炼苗：将营养杯中的珍珠番石榴幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为22℃-26℃，光照为日光照射。
进一步的，所述外植体选用本地番石榴与良种珍珠番石榴的2-3年嫁接苗。
进一步的，所述诱导培养基组成为：COD含量为300mg/L-800mg/L的15％-20％木薯酒精废液，2g/L-5g/L的蔗糖，3g/L-5g/L的灵芝提取液，8g/L-10g/L的螺旋藻提取液，2g/L-4g/L的辣蓼草提取液，4.0g/L-7.0g/L的琼脂，0.3mg/L-0.6mg/L的萘乙酸。
进一步的，所述继代培养基组成为：COD含量为500mg/L-1000mg/L的15-20％木薯酒精废液，5g/L-8g/L的蔗糖，3g/L-5g/L的灵芝提取液，2g/L-5g/L的螺旋藻提取液，2g/L-4g/L的辣蓼草提取液，6.0g/L-10.0g/L的琼脂。
进一步的，所述营养杯基质的重量百分比组成为：40％-60％的米糠、20％-30％的稻杆，10％-20％的红土，5％-10％的有机肥。
进一步的，所述提取液的提取方法采用索氏提取器回流提取法。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明选用植物处理液替代常用的化学消毒剂，该植物处理液的组成及重量百分比为：30％-50％的灵芝提取液、10％-15％的辣蓼草提取液、5％-15％的大蒜提取液、10％-15％的洋葱提取液、5％-10％的藿香提取液、5％-15％的仙人掌提取液、5％-10％的螺旋藻提取液，灵芝提取液具有强烈的抑制细菌作用，能对外植体进行有效消毒，但是灵芝浸出液含量过高会抑制外植体的生长，可以使用辣蓼草配合进行杀菌，辣蓼草能有促进植物生长的作用，但是仅用辣蓼草和灵芝并不能达到杀菌浓度，发明人经过研究发现可以添加大蒜汁和藿香进行杀毒，大蒜汁性质不稳定及易失去活性，但是大蒜汁的杀菌能力很强，与藿香进行配合利用藿香散发的气味进行消毒，形成一个相对无菌无毒的生长环境，仙人掌可促进植物的切口的愈合，外植体经过刀片切割后会导致营养物质的流失，而仙人掌可加速外植体形成愈伤组织，促进外植体的诱导培养，螺旋藻也可促进切口愈合，同时藻类细胞很小可渗透到外植体中，其中螺旋藻的叶绿素可以促进外植体的光合作用加快切口愈合，利用上述的植物处理液与植物间不会造成拮抗作用，对外植体表面进行消毒不会对外植体造成侵害。
2、本发明的诱导培养基选用COD含量为300mg/L-800mg/L的15％-20％木薯酒精废液为培养基主要成分，木薯酒精废液在经过发酵、厌氧处理含有丰富的无机盐离子，同时含有丰富的有机质能促进外植体的生长，对废液的二次利用能降低组培成本，但是发酵液中含有较高浓度的菌群，发明人通过研究发现可以通过添加灵芝提取液、辣蓼草提取液来抑制细菌的生长，螺旋藻提取液中含有丰富的叶绿素，可促进外植体的光合作用，萘乙酸能促进外植体生根，本发明人发现在此配方下的培养基中能充分促进外植体的诱导培养；外植体在诱导培养之后，生长能力较强，在继代培养时不需要添加萘乙酸进行生根，发明人发现在此继代培养基配方下能充分促进外植体的继代培养；为了提高炼苗效率，发明人经过不断试验发现40％-60％的米糠、20％-30％的稻杆，10％-20％的红土，5％-10％的有机肥最接近外界生长环境，同时含有丰富的有机肥可做为营养杯的基质可提高炼苗效率。
3、番石榴果树的生长对环境要求比较苛刻，本地番石榴能适应本地生长环境，但是果品不够良好，因此，常用本地番石榴和良种番石榴果树进行嫁接，为了提高番石榴果树的成活率和提高果品质量在选用外植体时应该选择本地番石榴与良种珍珠番石榴的2-3年生嫁接苗，番石榴果树容易褐化，植物需要进行酒精提取才能达到杀菌浓度。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
1、组织培养步骤：
在组织培养前12h向关闭门窗的培养室地面喷洒石灰粉，向空气中喷洒浓度为75％的医用酒精，进行灭菌消毒；选择本地番石榴与良品珍珠番石榴嫁接后的2年生、枝叶粗大、无病害的果树顶芽为外植体，切去顶端尖部，将顶芽切成长1cm，直径0.4cm；将外植体用自来水对进行流动冲洗5min，捞出后用浓度为75％的酒精溶液浸泡3min，沥干后在质量浓度为8％的植物处理液中浸泡20min进行灭菌；将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为24℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为500Lx，光照时间为12h；将长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为24℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为700Lx，光照时间为18h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养5代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养(营养杯基质的重量百分比组成为：40％的米糠、30％的稻杆，20％的红土，10％的有机肥)；将营养杯中的珍珠番石榴幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为22℃，光照为日光照射。
2、培养基、植物处理液配置方法：
(1)植物处理液配置方法：
①称取100g洗净晾干的灵芝切块放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
②称取100g洗净晾干的新鲜辣蓼草剪碎放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
③称取100g洗净晾干的新鲜大蒜切块放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
④称取100g洗净晾干的新鲜洋葱剪碎放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
⑤称取100g洗净晾干的新鲜仙人掌切块放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
⑥称取100g洗净晾干的新鲜藿香剪碎放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
⑦称取100g洗净晾干的新鲜螺旋藻装了滤纸筒的索氏提取器内，向容量为500ml的圆底烧瓶内添加300ml-350ml的酒精溶液，安装好索氏提取器后进行水浴加热，待提取器内的提取液被灌满后停止加热，将滤纸取出，将提取液放入锥形瓶中备用。
将上述的①-⑦的各植物提取液用蒸馏水进行配置，植物处理液的组成及重量百分比为：30％的灵芝提取液、10％的辣蓼草提取液、15％的大蒜提取液、10％的洋葱提取液、10％的藿香提取液、15％的仙人掌提取液、10％的螺旋藻提取液。
(2)诱导培养基配置方法：
将COD含量为300mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为15％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照2g/L加入蔗糖，按照3g/L加入上述步骤①提取的灵芝提取液，按照2g/L加入上述步骤②提取的辣蓼草提取液，按照8g/L加入上述步骤⑦提取的螺旋藻提取液，按照0.3mg/L的质量分数加入萘乙酸，充分搅拌后按照4.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置。
(3)继代培养基配置方法：
将COD含量为500mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为15％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照5g/L加入蔗糖，按照3g/L加入上述实施例1的步骤①提取的灵芝提取液，按照2g/L加入上述实施例1的步骤②提取的辣蓼草提取液，按照2g/L加入上述步骤⑦提取的螺旋藻提取液，充分搅拌后按照6.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置。
实施例2：
1、组织培养步骤：
在组织培养前14h向关闭门窗的培养室地面喷洒石灰粉，向空气中喷洒浓度为75％的医用酒精，进行灭菌消毒；选择本地番石榴与良品珍珠番石榴嫁接后的3年生、枝叶粗大、无病害的果树顶芽为外植体，切去顶端尖部，将顶芽切成长2cm，直径0.8cm；将外植体用自来水对进行流动冲洗8min，捞出后用浓度为75％的酒精溶液浸泡5min，沥干后在质量浓度为10％的植物处理液中浸泡25min进行灭菌；将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为26℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为800Lx，光照时间为16h；将长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为26℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为1400Lx，光照时间为20h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养7代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养(营养杯基质的重量百分比组成为：60％的米糠、20％的稻杆，15％的红土，5％的有机肥)；将营养杯中的珍珠番石榴幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为26℃，光照为日光照射。
2、培养基、植物处理液配置方法：
(1)植物处理液配置方法：
将上述实施例1的步骤①-⑦各植物提取液用蒸馏水进行配置，植物处理液的组成及重量百分比为：50％的灵芝提取液、15％的辣蓼草提取液、5％的大蒜提取液、15％的洋葱提取液、5％的藿香提取液、5％的仙人掌提取液、5％的螺旋藻提取液。
(2)诱导培养基配置方法：
将COD含量为800mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为20％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照5g/L加入蔗糖，按照5g/L加入上述步骤①提取的灵芝提取液，按照4g/L加入上述步骤②提取的辣蓼草提取液，按照10g/L加入上述实施例1的步骤⑦提取的螺旋藻提取液，按照0.6mg/L的质量分数加入萘乙酸，充分搅拌后按照7.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置。
(3)继代培养基配置方法：
将COD含量为1000mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为20％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照8g/L加入蔗糖，按照5g/L加入上述实施例1的步骤①提取的灵芝提取液，按照4g/L加入上述实施例1的步骤②提取的辣蓼草提取液，按照5g/L加入上述实施例1的步骤⑦提取的螺旋藻提取液，充分搅拌后按照10.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置。
实施例3：
1、组织培养步骤：
在组织培养前13h向关闭门窗的培养室地面喷洒石灰粉，向空气中喷洒浓度为75％的医用酒精，进行灭菌消毒；选择本地番石榴与良品珍珠番石榴嫁接后的3年生、枝叶粗大、无病害的果树顶芽为外植体，切去顶端尖部，将顶芽切成长1.5cm，直径0.6cm；将外植体用自来水对进行流动冲洗6min，捞出后用浓度为75％的酒精溶液浸泡4min，沥干后在质量浓度为9％的植物处理液中浸泡22min进行灭菌；将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为25℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为600Lx，光照时间为14h；将长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为25℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为1000Lx，光照时间为19h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养6代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养(营养杯基质的重量百分比组成为：50％的米糠、28％的稻杆，15％的红土，7％的有机肥)；将营养杯中的珍珠番石榴幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为24℃，光照为日光照射。
2、培养基、植物处理液配置方法：
(1)植物处理液配置方法：
将上述实施例1的步骤①-⑦各植物提取液用蒸馏水进行配置，植物处理液的组成及重量百分比为：37％的灵芝提取液、13％的辣蓼草提取液、12％的大蒜提取液、13％的洋葱提取液、7％的藿香提取液、10％的仙人掌提取液、8％的螺旋藻提取液。
(2)诱导培养基配置方法：
将COD含量为500mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为17％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照3g/L加入蔗糖，按照4g/L加入上述步骤①提取的灵芝提取液，按照3g/L加入上述步骤②提取的辣蓼草提取液，按照9g/L加入上述实施例1的步骤⑦提取的螺旋藻提取液，按照0.5mg/L的质量分数加入萘乙酸，充分搅拌后按照6.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置。
(3)继代培养基配置方法：
将COD含量为800mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为17％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照7g/L加入蔗糖，按照4g/L加入上述实施例1的步骤①提取的灵芝提取液，按照3g/L加入上述实施例1的步骤②提取的辣蓼草提取液，按照4g/L加入上述实施例1的步骤⑦提取的螺旋藻提取液，充分搅拌后按照8.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置。
实验对比及分析：
1、植物浸泡液对不同的珍珠番石榴果树外植体的出芽率及褐化率的影响，对比分析结果见表1。
试验例1：
选择3年生嫁接生长的番石榴果树的顶芽、幼嫩腋芽、较成熟腋芽、茎干做为外植体各30个，按照实施例1的步骤进行组织培养，统计并计算诱导培养后的出芽率以及褐化率。
试验例2：
选择3年生嫁接生长的番石榴果树的果树顶芽、幼嫩腋芽、较成熟腋芽、茎干做为外植体各30个，按照实施例1的步骤进行组织培养，省去植物提取液灭菌步骤，统计并计算诱导培养后的出芽率以及褐化率，形成植物浸泡液的空白试验，统计并计算在继代培养前外植体成活情况。
2、植物提取液对诱导培养和继代培养的影响，对比分析结果见表2。
试验例3：
按照实施例1的步骤进行组织培养，将诱导培养基、继代培养基的植物提取液成分省去，即诱导培养基配置过程为：将COD含量为300mg/L的木薯酒精废液用蒸馏水稀释配置成质量分数为15％，进行加热沸腾后冷却到80℃左右，按照2g/L加入蔗糖，按照0.3mg/L的质量分数加入萘乙酸，充分搅拌后按照4.0g/L的质量分数加入琼脂粉，搅拌后将诱导培养基加入培养瓶中放入灭菌箱进行灭菌冷却至室温即完成配置；形成培养基中植物浸出液的空白试验，统计并计算外植体诱导培养后成活率、继代培养后5cm生根苗成活率、定植后10d、20d、30d珍珠番石榴苗成活率。
3、木薯酒精废液对组织培养成活率的影响，对比分析结果见表3。
试验例4：
按照实施例1的步骤进行组织培养，将诱导培养基、继代培养基的主要成分替换成常用的MS培养基，并向其中加入实施例2的植物提取物，即诱导培养基成分为：MS培养基，质量分数为2g/L的蔗糖，3g/L的灵芝提取液，2g/L的辣蓼草提取液，8g/L的螺旋藻提取液，0.3mg/L萘乙酸，4.0g/L的琼脂粉；继代培养基成分为：MS培养基，3g/L的灵芝提取液，2g/L的辣蓼草提取液，2g/L的螺旋藻提取液，6.0g/L的琼脂粉；形成木薯酒精废液培养基的空白试验，统计并计算外植体诱导培养后成活率、继代培养后5cm生根苗成活率、定植后10d、20d、30d珍珠番石榴苗成活率。
上述成活率计算公式：
表1植物提取液对外植体褐化率及出芽率的影响
由上表统计计算结果可知：在无植物提取液灭菌的组织培养中，较成熟的腋芽褐化率只有3.11％出芽率达到了90.21％。由此可知，对于番石榴的组织培养而言，较成熟的腋芽为最佳的组织培养外植体。然而在有植物提取液灭菌的组织培养中，果树的顶芽、幼嫩腋芽、较成熟腋芽、茎干做为外植体进行培养的褐化率和出芽率基本一致，而且褐化率明显降低，出芽率明显提高，由此可知，在植物提取液进行灭菌后能大大提高珍珠番石榴外植体的出芽率，而且适用于珍珠番石榴的各部分外植体。
表2植物提取液对诱导培养和继代培养的影响
实施例1-3的外植体成活率、5cm生根苗成活率比试验例3高，说明使用植物提取液进行消毒可提高植物外植体成活率；实施例1-3的成活率与试验例3的10d苗木成活率、20d苗木成活率、30d苗木成活率无多大差别，说明植物提取液对苗木质量无多大影响。
表3木薯酒精废液对诱导培养和继代培养的影响
实施例1-3的外植体成活率、5cm生根苗成活率比试验例4无多大差别，说明木薯酒精废液对组织培养过程中外植体成活率无多大影响；实施例1-3的成活率比验例4的10d苗木成活率、20d苗木成活率、30d苗木成活率高，说明酒精废液可有效提高苗木质量提高珍珠番石榴的组培苗成活率。
2、组培苗生长情况：
随机抽取100个珍珠番石榴生根苗为样本，将实施例1-3和试验例3、试验例4的生根苗的根系生长情况进行对比，统计生根苗的根数、测量生根苗的根长和根粗具体情况见表4。
表4组培苗生长情况表
| 样本源 | 平均根长cm | 最长跟cm | 平均根粗mm | 最粗根mm | 根数 |
| 实施例1 | 6.12 | 8.11 | 0.45 | 0.61 | 8.14 |
| 实施例2 | 6.05 | 8.21 | 0.48 | 0.62 | 8.16 |
| 实施例3 | 6.33 | 7.12 | 0.45 | 0.63 | 8.02 |
| 试验例3 | 6.01 | 8.01 | 0.46 | 0.62 | 8.13 |
| 试验例4 | 2.15 | 3.25 | 0.12 | 0.32 | 3.01 |
实施例1-3、试验例3的根长、根粗、根数明显大于试验例4，说明木薯酒精废液能明显提高珍珠番石榴幼苗的质量。
综上所述，本发明的组织培养方法是一种理想的组织培养方法，不仅能应用与珍珠番石榴的多种外植体，还能有效的对外植体表面进行消毒，还不会对外植体进行侵害，同时还能有效降低生产成本。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围。
Claims (6)
1.一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，其特征在于，该组织培养方法包括以下步骤：
(1)培养室消毒：培养前12h-14h向关闭门窗的培养室进行灭菌消毒；
(2)外植体的选择：选择珍珠番石榴果树顶芽为外植体，外植体长1cm-2cm，直径0.4cm-0.8cm；
(3)外植体的灭菌：外植体经过水冲洗、75％的酒精浸泡沥干后，在质量浓度为8％-10％的植物处理液中浸泡20min-25min进行灭菌，所述植物处理液的组成及重量百分比为：30％-50％的灵芝提取液、10％-15％的辣蓼草提取液、5％-15％的大蒜提取液、10％-15％的洋葱提取液、5％-10％的藿香提取液、5％-15％的仙人掌提取液、5％-10％的螺旋藻提取液；
(4)初始诱导培养：将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为24℃-26℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为500Lx-800Lx，光照时间为12h-16h；
(5)继代培养：将步骤(4)中长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为24℃-26℃，用白色的LED光灯进行光照，光照强度为700Lx-1400Lx，光照时间为18h-20h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养5-7代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养；
(6)炼苗：将营养杯中的珍珠番石榴幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为22℃-26℃，光照为日光照射。
2.根据权利要求1所述的一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(2)的外植体选用本地番石榴与良种珍珠番石榴的2-3年嫁接苗。
3.根据权利要求1所述的一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(4)的诱导培养基组成为：COD含量为300mg/L-800mg/L的15％-20％木薯酒精废液，2g/L-5g/L的蔗糖，3g/L-5g/L的灵芝提取液，8g/L-10g/L的螺旋藻提取液，2g/L-4g/L的辣蓼草提取液，4.0g/L-7.0g/L的琼脂，0.3mg/L-0.6mg/L的萘乙酸。
4.根据权利要求1所述的一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(5)的继代培养基组成为：COD含量为500mg/L-1000mg/L的15-20％木薯酒精废液，5g/L-8g/L的蔗糖，3g/L-5g/L的灵芝提取液，2g/L-5g/L的螺旋藻提取液，2g/L-4g/L的辣蓼草提取液，6.0g/L-10.0g/L的琼脂。
5.根据权利要求1所述的一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，其特征在于，所述营养杯基质的重量百分比组成为：40％-60％的米糠、20％-30％的稻杆，10％-20％的红土，5％-10％的有机肥。
6.根据权利要求4或5所述的一种提高珍珠番石榴成活率的组织培养方法，其特征在于，所述提取液的提取方法采用索氏提取器回流提取法。
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