CN104186295A - 兜兰种子萌发培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兜兰种子萌发培养基及培养方法。本发明所述的兜兰种子萌发培养基以1/4MS培养基为基础培养基，并添加有抗坏血酸、活性炭、香蕉泥、赤霉素、琼脂粉和白砂糖，能够缩短兜兰种子的萌发时间，提高种子萌发率。

Description

兜兰种子萌发培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及兰花组织培养技术领域，特别是涉及一种兜兰种子萌发培养基及培养方法。

背景技术

兜兰，又称“拖鞋兰”、“仙履兰”，是兰科兜兰属(Paphiopedilum)植物的统称。兜兰是兰科植物中最具特色的一个类群，也是最奇特的观赏兰花，以其独特魅力和许多优异特性而备受世界花卉爱好者的钟爱。

近年来，兰花的组织培养技术及试管苗工厂化生产取得了迅猛的发展，但作为兰科较原始的兜兰属，其种子没有胚乳，存在萌发率极低、萌发时间长等问题。现有的兜兰种子萌发培养基通常在1/4MS培养基的基础上，添加质量浓度10％的椰子汁、0.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、6g/L的琼脂粉、30g/L的蔗糖和2g/L的活性炭。然而，6-BA和NAA为广谱性植物生长调节剂，主要用于生根、生芽和诱导原球茎，对打破种子休眠作用较差。因此，采用现有的兜兰种子萌发培养进行培养，难以实现兜兰的快速繁殖，难以满足规模化种植的需求。

发明内容

基于此，有必要针对兜兰种子萌发率低的问题，提供一种能提高兜兰种子萌发率的培养基。

此外，有必要针对兜兰种子萌发率低的问题，提供一种能提高兜兰种子萌发率的培养方法。

一种兜兰种子萌发培养基，其以1/4MS培养基为基础培养基，并添加有抗坏血酸、赤霉素、活性炭、香蕉泥、琼脂粉和白砂糖。

在其中一个实施例中，抗坏血酸的浓度为80～100mg/L，赤霉素的浓度为40～60mg/L，活性炭的浓度为1.8～2g/L，香蕉泥的浓度为40～50g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L，白砂糖的浓度为25～30g/L。

在其中一个实施例中，抗坏血酸的浓度为100mg/L，赤霉素的浓度为50mg/L，活性炭的浓度为2g/L，香蕉泥的浓度为50g/L，琼脂粉的浓度为6g/L，白砂糖的浓度为30g/L。

在其中一个实施例中，所述兜兰种子萌发培养基的pH值为6.0。

一种兜兰种子萌发培养方法，包括以下步骤：

1)取生长健康、授粉140～150天的果荚，用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，再用质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液消毒18～25分钟，再用无菌水清洗干净后，切开果荚，取出种子；

2)种子用浓度为0.05～0.1mol/L的KOH溶液浸泡处理8～10分钟，用无菌水清洗干净后，再用频率为50～60KHz、功率为80～90W的超声波处理25～30分钟，然后接种到本发明所述的兜兰种子萌发培养基中，于暗培养条件下培养至种子萌发，然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1800～2000lux的条件下培养至长成小苗。

在其中一个实施例中，步骤3)中，所述的兜兰种子萌发培养基上铺设有灭菌滤纸，所述的灭菌滤纸经本发明所述的兜兰种子萌发培养基浸泡处理。

本发明的兜兰种子萌发培养基中，采用1/4MS培养基，通过降低大量元素的离子浓度，有利于兜兰种子萌发，提高萌发率；此外，通过抗坏血酸、赤霉素、活性炭和香蕉泥联合作用于种子，能有效促进种子萌发，提高种子萌发率。其中，抗坏血酸为抗氧化剂，对种子无毒副作用，可与褐化所产生的氧化产物——醌类物质发生作用，使其重新还原为酚类物质，从而降低褐化程度，提高种子萌发率；赤霉素能够调节种子的生理状态，通过转录介导因子影响种子中的α-淀粉酶基因，促进α-淀粉酶mRNA的形成和α-淀粉酶的合成，提高α-淀粉酶的水平，从而促进α-淀粉酶水解淀粉，增加种子萌发所需的碳源，打破种子的休眠，促进种子萌发，显著缩短萌发时间；活性炭能够有效吸附种子产生的酚类、醌类物质，抑制褐化，提高种子萌发率；香蕉泥富含氨基酸、激素和酶等多种种子萌发所需物质，可弥补兜兰种子没有胚乳的缺陷，为其提供营养物质，从而提高萌发率，并使原球茎生长健壮；琼脂作为固体培养平台，为植材提供养分、水分与透气的效用，并以白砂糖作为碳源，在萌发时间和萌发率不受影响的前提下，降低了培养基的制备成本。

本发明的兜兰种子萌发培养基中，抗坏血酸的浓度优选为80～100mg/L，若其用量过少，则抗氧化作用不明显；赤霉素的浓度优选为40～60mg/L，若其用量过少，难以促进种子萌发，若其用量过多，则会造成外植体疯长，玻璃化严重；活性炭的浓度优选为1.8～2g/L，若其用量过少，不能充分吸附酚类和醌类物质，褐化抑制效果差，若其用量过多，则除了吸附酚类和醌类物质外，还会吸附培养基中的营养物质，影响种子萌发和外植体生长；香蕉泥的浓度优选为40～50g/L，若其用量过少，则难以满足兜兰种子萌发所需的营养。

本发明的兜兰种子萌发培养基，将pH值控制在6.0，呈弱酸性环境，有利于兜兰种子的萌发，从而提高萌发率，缩短萌发时间。

本发明所述的兜兰种子萌发培养基，通过生化手段，在培养基中添加抗坏血酸，阻止酚类物质氧化成褐色的醌类物质；通过生理手段，在培养基中添加赤霉素和香蕉泥，调节种子生理状况，打破种子休眠，促进种子萌发；并通过物理手段，在培养基中添加活性炭，吸收酚类、醌类物质，减少组织褐化，从而提高种子萌发率。本发明的兜兰种子萌发培养基，通过生化、生理和物理三方面的协同作用，能显著提高兜兰种子的萌发率。

本发明所述的兜兰种子萌发培养方法，采用了本发明的兜兰种子萌发培养基，再通过化学、生理等多方面的同时作用，相互促进，能够显著提高兜兰种子萌发率，种子萌发率高达60％，缩短兜兰种子萌发时间，并降低外植体褐化率。在获取无菌种子后对种子进行KOH溶液浸泡和超声波处理，以打破种子休眠，促进种子萌发。其中，化学方面，采用KOH溶液浸泡，能溶解抑制种子萌发的物质、腐蚀种皮，使种子更容易萌发，提高萌发率，采用KOH溶液而非常用的NaOH溶液，因为KOH的吸水性比NaOH低，能更好地保持种子的水分；而生理方面，采用超声波处理，则可使酶的活性增加，破除种子的休眠。种子经KOH溶液浸泡和超声波处理后，接种到本发明所述的兜兰种子萌发培养基中进行暗培养，能够调节种子生理活动，打破种子休眠，促进种子萌发。种子发芽后及时转移到光暗交替环境下进行培养，以避免原球茎生长膨大、颜色变白，而不能转绿成苗。此外，采用酒精和氯化汞对果荚进行灭菌处理，能够同时杀灭细菌和真菌，达到最佳灭菌效果。

本发明的兜兰种子萌发培养方法中，采用KOH溶液对种子作浸泡处理时，KOH溶液的浓度优选为0.05～0.1mol/L，浸泡时间优选为8～10分钟，若KOH溶液浓度过高或浸泡时间过长，会对兜兰种子造成伤害甚至使之失活，若KOH溶液浓度过低或浸泡时间过短，则促进种子萌发的效果不明显；对种子进行超声波处理时，频率优选为50～60KHz，功率优选为80～90W，处理时间优选为25～30分钟，若超声波处理的频率、功率过高或处理时间过长，会造成种子生理紊乱，破坏种子生理结构，影响种子萌发甚至造成种子失活，若超声波处理的频率、功率过低或处理时间过短，则促进种子萌发的效果不明显；种子暗培养至种子萌发，若暗培养时间过长，会导致外植体黄化，生长不正常和外植体玻璃化，若暗培养时间过短，则促进种子萌发的效果不明显。

此外，通过在种子萌发培养基上铺设经培养基浸泡的灭菌滤纸，能够防止种子陷入培养基中窒息而降低种子萌发率。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的兜兰种子萌发培养基的制备

根据表1所示的1/4MS培养基配方以及表2所示的兜兰种子萌发培养基配方，制备本发明所述的兜兰种子萌发培养基。

按配制1100mL培养基的量，分别称取1/4MS培养基中的各成分以及活性炭、香蕉泥、琼脂粉、白砂糖，置于三角瓶中，加入适量纯化水，搅拌溶解，定容至1000mL，并调节pH值至6.0。将三角瓶封口，置于高压灭菌锅中，于121℃灭菌20min，然后置于超净工作台中自然冷却，得到灭菌培养基母液，备用。

按配制1100mL培养基的量，分别称取抗坏血酸和赤霉素，加入适量纯化水溶解，混匀，定容至100mL，在超净工作台中过滤灭菌，备用。

在超净工作台中，待灭菌培养基母液冷却至60℃后，加入灭菌后的抗坏血酸和赤霉素溶液，混匀，制得1100mL兜兰种子萌发培养基。

取滤纸，裁剪成与组织培养瓶相匹配的大小，置于高压灭菌锅在121℃下灭菌20min，灭菌后放到超净工作台中，并用所制得的兜兰种子萌发培养基浸泡，备用。

取所制得的兜兰种子萌发培养基，分装至组织培养瓶中，晾凉，待其凝固后在其表面铺设经培养基浸泡后的无菌滤纸，然后将组织培养瓶封口，备用。

表1 1/4MS培养基的成分及其用量

备注：1/4MS培养基中的大量元素用量为标准MS培养基的大量元素用量的1/4。

表2 兜兰种子萌发培养基的成分及其用量

成分

终浓度

1/4MS培养基	-
		抗坏血酸	100mg/L
赤霉素	50mg/L
		活性炭	2g/L
香蕉泥	50g/L
		琼脂粉	6g/L
白砂糖	30g/L

实施例二：本发明所述的兜兰种子萌发培养方法

选取生长健康、授粉140天的果荚，用质量浓度为75％的酒精浸泡30秒，再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒20分钟，再用无菌水清洗干净后，切开果荚，取出种子，备用。

取实施例一制备的组织培养瓶备用，该组织培养瓶装有固态的兜兰种子萌发培养基，培养基的表面铺设有经培养基浸泡后的无菌滤纸。

取消毒处理后得到的无菌种子，用浓度为0.1mol/L的KOH溶液浸泡处理10分钟，用无菌水清洗干净后，再用频率为60KHZ、功率为90W的超声波处理30分钟，然后接种到实施例一制备的组织培养瓶中。将接种后的组织培养瓶置于人工气候箱中，于暗培养条件下培养12天至种子萌发，人工气候箱的环境参数设置为：温度26±1℃；然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为2000lux、温度为25±1℃的条件下培养至长成小苗。

实施例三：本发明所述的兜兰种子萌发培养基的测试

根据表1所示的1/4MS培养基配方以及表3所示的兜兰种子萌发培养基配方，参照实施例一所述的培养基制备方法，分别制备各试验组、对照组的兜兰种子萌发培养基。

表3 兜兰种子萌发培养基

选取生长健康、授粉140天的果荚，用质量浓度为75％的酒精浸泡30秒，再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒20分钟，再用无菌水清洗干净后，切开果荚，取出种子，在无菌环境下，分别接种于表3所示各试验组、对照组的培养基中，然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为2000lux、温度为25±1℃的条件下进行培养。培养30天后记录种子萌发率、萌发时间以及褐化率，结果如表4所示。

表4 兜兰种子萌发率、萌发时间、褐化率测试结果

备注：综合评分y＝a*0.5-b*0.3-c*0.2。

由表4的试验结果可知，采用本发明所述的兜兰种子萌发培养基，能够显著提高兜兰种子萌发率，缩短兜兰种子萌发时间，并降低其褐化率。由对照组2、对照组3与试验组9的结果对比可见，赤霉素与抗坏血酸之间存在协同促进作用，两者同时使用时，能够进一步提高兜兰种子萌发率，缩短种子萌发时间。

实施例四：本发明所述的兜兰种子萌发培养方法的测试

选取生长健康、授粉140天的果荚，用质量浓度为75％的酒精浸泡30秒，再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒20分钟，再用无菌水清洗干净后，切开果荚，取出种子，备用。

参照实施例二所述的兜兰种子萌发培养方法，按照表5所示的处理方法和培养条件，将消毒处理后得到的无菌种子接种于兜兰种子萌发培养基后，分别对各试验组、对照组的种子进行培养。培养30天后记录种子萌发率和萌发时间，结果如表5所示。

表5 兜兰种子萌发培养条件及其试验结果

备注：1.“+”表示处理；“-”表示不处理；

2.综合评分y＝a*0.7-b*0.3；

3.对照组4以及各试验组均采用实施例一所制得的兜兰种子萌发培养基，对照组5、对照组6采用1/4MS培养基并添加有6g/L的琼脂粉、30g/L的蔗糖，对照组7采用1/4MS培养基并添加有10％的椰子汁、0.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、6g/L的琼脂粉、30g/L的蔗糖和2g/L的活性炭。

由表5的试验结果可知，在采用本发明所述的兜兰种子萌发培养基的基础上，再通过KOH溶液浸泡处理、超声波处理和接种后暗培养处理的相互作用，以及通过铺设经培养基浸泡的无菌滤纸，能够进一步显著缩短兜兰种子的萌发时间，提高种子萌发率。此外，由对照组4、5、7的试验结果可知，本发明所述兜兰种子萌发培养基的培养效果，明显优于基础培养基及现有的兜兰种子萌发培养基。有对照组5、对照组6的试验结果可知，在培养基一致的条件下，采用本发明所述的兜兰种子萌发培养条件，亦能显著提高兜兰种子萌发率，缩短种子萌发时间。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种兜兰种子萌发培养基，其特征在于：以1/4MS培养基为基础培养基，并添加有抗坏血酸、赤霉素、活性炭、香蕉泥、琼脂粉和白砂糖。

2.根据权利要求1所述的兜兰种子萌发培养基，其特征在于：抗坏血酸的浓度为80～100mg/L，赤霉素的浓度为40～60mg/L，活性炭的浓度为1.8～2g/L，香蕉泥的浓度为40～50g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L，白砂糖的浓度为25～30g/L。

3.根据权利要求2所述的兜兰种子萌发培养基，其特征在于：抗坏血酸的浓度为100mg/L，赤霉素的浓度为50mg/L，活性炭的浓度为2g/L，香蕉泥的浓度为50g/L，琼脂粉的浓度为6g/L，白砂糖的浓度为30g/L。

4.根据权利要求1至3的其中之一所述的兜兰种子萌发培养基，其特征在于：所述兜兰种子萌发培养基的pH值为6.0。

5.一种兜兰种子萌发培养方法，包括以下步骤：

1)取生长健康、授粉140～150天的果荚，用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，再用质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液消毒18～25分钟，再用无菌水清洗干净后，切开果荚，取出种子；

2)种子用浓度为0.05～0.1mol/L的KOH溶液浸泡处理8～10分钟，用无菌水清洗干净后，再用频率为50～60KHz、功率为80～90W的超声波处理25～30分钟，然后接种到权利要求1所述的兜兰种子萌发培养基中，于暗培养条件下培养至种子萌发，然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1800～2000lux的条件下培养至长成小苗。

6.根据权利要求5所述的兜兰种子萌发培养方法，其特征在于：步骤3)中，所述的兜兰种子萌发培养基上铺设有灭菌滤纸，所述的灭菌滤纸经权利要求1所述的兜兰种子萌发培养基浸泡处理。