CN105960457B

CN105960457B - 普鲁兰酶变体以及编码它们的多核苷酸

Info

Publication number: CN105960457B
Application number: CN201580004962.7A
Authority: CN
Inventors: 松井知子; A.雅马吉西
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: US20200248157A1; DK3415624T3; DK3097192T3; US20170044511A1; CN105960457A; WO2015110473A2; EP3097192A2; CA2932239C; EP3097192B1; EP3415624B1; US10030237B2; CA2932239A1; WO2015110473A3; HUE056192T2; EP3415624A1; US20180298364A1; US11136568B2; US10640755B2

Abstract

本发明涉及普鲁兰酶变体，这些普鲁兰酶变体具有升高的热活性并且包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的一个或多个位置处对亲本普鲁兰酶的取代。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。这些变体主要衍生自来自脱支芽孢杆菌、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌或者杂合普鲁兰酶的普鲁兰酶。

Description

普鲁兰酶变体以及编码它们的多核苷酸

序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及普鲁兰酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。还描述了本发明的普鲁兰酶用于淀粉转化以产生发酵产物的用途。本发明还涉及包含本发明的普鲁兰酶的组合物。

相关领域描述

淀粉通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是分支多糖，其中直链α-1,4D-葡萄糖残基由α-1,6糖苷键连接。支链淀粉被水解1,4-α-糖苷键以产生支链和直链低聚糖的α-淀粉酶部分地降解。支链淀粉被α-淀粉酶的延长降解导致所谓的α-极限糊精的形成，α-极限糊精不易被α-淀粉酶进一步水解。支链低聚糖可以被去分支酶水解为直链低聚糖。剩余的支链低聚糖可以被葡糖淀粉酶解聚为D-葡萄糖，将直链低聚糖水解为D-葡萄糖。

可攻击支链淀粉的去分支酶被分成两类：分别是异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)和普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰的特性以及通过它们对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。

本领域众所周知在淀粉转化过程中添加异淀粉酶或普鲁兰酶。普鲁兰酶是具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性(EC3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。通常，普鲁兰酶与α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶组合使用。

普鲁兰酶在本领域中是已知的。US 6,074,854和US 5,817,498披露了来自脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的普鲁兰酶。WO 2009/075682披露了衍生自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的普鲁兰酶。

本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的普鲁兰酶变体。

发明内容

本发明涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且a)其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:3的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或b)其中该变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:6的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或c)其中该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:9的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或d)其中该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:16的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或e)其中该变体与SEQ ID NO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:17的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

在一个另外的方面，本发明涉及变体催化结构域，其中该变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代；并且a)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:3的氨基酸330至828具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或b)其中该变体催化结构域与SEQID NO:6的氨基酸430至928具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或c)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:9的氨基酸330至829具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或d)其中该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:16的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或e)其中该变体与SEQ ID NO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:17的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

本发明另外涉及包含本发明的变体催化结构域的普鲁兰酶变体，其中该普鲁兰酶变体具有普鲁兰酶活性以及与亲本普鲁兰酶相比升高的热活性，并且当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

在再另一个方面，本发明涉及包括本发明的普鲁兰酶变体的组合物。

本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还涉及从含淀粉材料生产发酵产品的方法。

定义

普鲁兰酶：术语“普鲁兰酶”意指是具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性(EC3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序可以确定普鲁兰酶活性。在本发明的上下文中，普鲁兰酶变体具有改进的热活性。当在70℃下测量时，使用如在实例中所述的PHADEBAS测定来将升高的热活性确定为相对于在65℃下的活性的相对活性。

具体而言，当比较SEQ ID NO:3的变体时，在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性本发明的普鲁兰酶变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

具体而言，当比较SEQ ID NO:6的变体时，在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性本发明的普鲁兰酶变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

具体而言，当比较SEQ ID NO:9的变体时，在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性本发明的普鲁兰酶变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

普鲁兰酶结构域，CBM41、X45、X25：根据NCBI的CDD(保守结构域数据库，玛琪乐-鲍尔(Marchler-Bauer)等人，核酸研究(Nucleic acids research)2011，第39卷，D225-229)，普鲁兰酶中的X25、X45和CBM41结构域如下所述：

嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶和类似蛋白的X25结构域。

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)切割普鲁兰、支链淀粉和糖原中，以及支链淀粉和糖原的α-和β-淀粉酶极限糊精中的1.6-α-糖苷键。嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶在工业中用于高果糖玉米糖浆、高麦芽糖含量糖浆和低热量以及“清淡”(light)啤酒的生产。除了催化结构域之外，普鲁兰酶包含若干碳水化物结合结构域(CBM)连同具有未知功能的结构域(称为“X”模块)。X25被鉴定于嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶中，并且分离另一个具有未知功能的结构域(X45)。X25存在于一些普鲁兰酶中的多个拷贝中。已表明X25和X45是靶向混合的α-1.6/α-1.4连接的D-葡聚糖多糖的CBM。

嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶和类似蛋白的X45结构域。

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)切割普鲁兰、支链淀粉和糖原中，以及支链淀粉和糖原的α-和β-淀粉酶极限糊精中的1.6-α-糖苷键。嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶在工业中用于高果糖玉米糖浆、高麦芽糖含量糖浆和低热量以及“清淡”啤酒的生产。除了催化结构域之外，普鲁兰酶包含若干碳水化物结合结构域(CBM)连同具有未知功能的结构域(称为“X”模块)。X45被鉴定于嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶中；它被另一个具有未知功能的结构域(X25)间断。已表明X25和X45是靶向混合的α-1.6/α-1.4连接的D-葡聚糖多糖的CBM。

来自普鲁兰酶样酶的家族41碳水化合物结合模块

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一组淀粉去分支酶，该酶催化α-葡聚糖(优选普鲁兰)的α-1,6-糖苷键的水解。普鲁兰是一种多糖，其中α-1,4-连接的麦芽三糖单位经由α-1,6-键相组合。这些酶在淀粉工业中很重要，其中它们被用于水解支链淀粉。普鲁兰酶由多个不同结构域组成，包括属于糖苷水解酶(GH)家族13和碳水化合物结合模块(CBM)(包括CBM41)的催化结构域。碳水化合物结合模块家族41是主要在细菌普鲁兰酶中发现的大约100个残基的模块。可以使用http://pfam.xfam.org/search处可获得的Pfam数据库‘序列搜索(Sequence Search)’工具(使用Pfam版本26.0或更高版本)在查询蛋白质序列中鉴定CBM41(别名PUD)(细菌普鲁兰酶相关结构域)模块。Pfam数据库是蛋白质家族的大集合，各自由多重序列比对和隐蔽马尔科夫模型(HMM)代表。Pfam在创作共用(Creative Commons Zero(“CC0”))协议下可免费获得(参见http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)。

将以FASTA格式的查询蛋白质序列输入到经由互联网在http://pfam.xfam.org/search处可获得的Pfam数据库序列搜索工具的检索字段中，并且点提交按钮，在此之后序列搜索结果展示于显示显著Pfam-A配对的表中，下表。

包含家族名称PUD的表格行的存在是查询蛋白质序列中CBM41(别名PUD)模块存在的阳性鉴定。PUD家族名称也可以被称为PF03714，而不影响歧义性。

表中另外的列显示包络线起点和端点(Envelope Start and End)坐标，其分别定义查询序列中CBM41(别名PUD)模块的起点和端点坐标，之后涵盖起点至端点(包括端值)序列的序列区。

表中另外的列显示E-值，其是指CBM41(别名PUD)模块鉴定的统计显著性。较低的E-值比较高的E-值在统计学上更为显著。显著的CBM41(别名PUD)模块鉴定被定义为具有小于1.0的E-值、优选地小于1e-2(0.01)的E-值、更优选地小于1e-4(0.0001)的E-值、甚至更优选地小于1e-6(0.000001)的E-值的那些。

一些普鲁兰酶在它们的N-末端包含所有这些结构域，并且一些缺少这些结构域中的一个或两个或全部。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中片段具有普鲁兰酶活性。

杂合普鲁兰酶：通过结合融合到另一种普鲁兰酶的C-末端片段的一种普鲁兰酶的N-末端片段获得根据本发明的杂合普鲁兰酶。优选地，融合发生在催化结构域之内，其中杂合普鲁兰酶中至少一部分催化结构域应当衍生自包含于Promozyme D2(SEQ ID NO:5)中的催化结构域，然而，其他融合点也是可能的。融合物可以是起源于两种亲本普鲁兰酶的两个片段之间的简单融合物，然而，在一些实施例中，融合物可以在两种亲本片段之间的界面中产生经改组的氨基酸序列。融合应当优选在这些亲本普鲁兰酶之间的同源性区域中进行。同源区应当至少为4个氨基酸。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。此类改进的特性包括但不限于比活性、热稳定性和热活性。在一个具体实施例中，改进的特性是升高的热活性。在另一个具体实施例中，改进的特性是增加的热稳定性。在另一个具体实施例中，改进的特性是增加的比活性。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质上相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

异淀粉酶：术语“异淀粉酶”意指淀粉去分支酶活性(E.C.3.2.1.68)，该活性水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰，及通过对于α-极限糊精的有限作用与普鲁兰酶相区别。异淀粉酶可以按本领域的技术人员熟知的有效量添加。异淀粉酶可以单独添加或连同普鲁兰酶一起添加。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸34至861，并且SEQ ID NO:2的氨基酸1至33是信号肽。在另一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸30至957，并且SEQ ID NO:5的氨基酸1至29是信号肽。在另一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸34至862，并且SEQ ID NO:8的氨基酸1至33是信号肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有普鲁兰酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸100至2583。SEQID NO:1的核苷酸1至99编码信号肽。在另一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:4的核苷酸88至2871。SEQ ID NO:4的核苷酸1至87编码信号肽。在另一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸100至2586。SEQ ID NO:7的核苷酸1至99编码信号肽。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

亲本或亲本普鲁兰酶：术语“亲本”或“亲本普鲁兰酶或嵌合体普鲁兰酶”意指进行改变以产生本发明的酶变体的普鲁兰酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位拓展罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有普鲁兰酶活性的片段。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括改变(即，取代、***和/或缺失)的具有普鲁兰酶活性的一个多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且***意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。与亲本酶相比，本发明的变体具有升高的热活性。

具体而言，当比较SEQ ID NO:16的变体时，在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性本发明的普鲁兰酶变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

具体而言，当比较SEQ ID NO:17的变体时，在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性本发明的普鲁兰酶变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

野生型普鲁兰酶：术语“野生型”普鲁兰酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的普鲁兰酶。

变体命名规则

出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中包括的成熟多肽用以确定另一种普鲁兰酶中的对应的氨基酸残基。在一个实施例中，该成熟多肽被披露为SEQ ID NO:3。将另一种普鲁兰酶的氨基酸序列与披露为SEQ ID NO:3的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与披露为SEQ ID NO:3的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种普鲁兰酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology 537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195^*”或者“G195^*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195^*+Ser411^*”或“G195^*+S411^*”。

***。对于氨基酸***，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、***氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的***被表示为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，***氨基酸#1、***氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所***的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所***的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

<u>亲本：</u>	<u>变体：</u>
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明详细说明

本发明涉及衍生自杂合亲本普鲁兰酶的变体普鲁兰酶。杂合亲本普鲁兰酶是于2013年7月17日提交的共同未决的EP专利申请13176791.5的主题。该亲本普鲁兰酶(表示为P8)是通过结合融合到衍生自从在丹麦收集的腐植质样品中分离的脱支芽孢杆菌菌株(来自脱支芽孢杆菌的同源普鲁兰酶披露于US 6,074,854和US 5,817,498中)的普鲁兰酶的C-末端片段的衍生自描述于WO 2009/075682中的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(SEQ ID NO:4在WO2009/075682中；GENESEQP：AXB71624)的普鲁兰酶的N-末端片段而获得的杂合酶。所得杂合亲本普鲁兰酶在此被披露为SEQ ID NO:2，并且成熟普鲁兰酶披露为SEQ ID NO:3。

与亲本相比，根据本发明的变体具有改进的特性。这些改进的特性选自升高的热活性或针对麦芽糊精增加的比活性。在一个实施例中，本发明的变体具有升高的热活性。下面将更详细地描述为了获得升高的热活性而有待取代的位置。除了当取代亲本普鲁兰酶(表示为P8或P008，并且在此被披露为SEQ ID NO:3的杂合酶)中任一披露的位置时观察到的效果之外，对于替代杂合体或野生型普鲁兰酶还测试了一些位置。两种此类替代的杂合普鲁兰酶在此被披露为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。对于这些具体构建体更多细节，参见本文的实例部分。这些结果支持如下发现，可以在其他普鲁兰酶、野生型连同杂合体中的对应位置处引入特别是在催化结构域中进行的取代，并且该结果将为具有升高的热活性的变体普鲁兰酶。当在不同亲本酶中测试特定取代时，存在于该亲本中的的起始氨基酸可以与首先测试的亲本不同。这对所得变体没有任何影响。通常，本质特征是将被引入特殊位置处的氨基酸，而不是取代之前就存在的那些。因此，在整个本说明书中的许多实施例中，仅给出了在取代之后存在的氨基酸。例如，393A意指，任何存在于位置393的氨基酸都应被取代为A(Ala)。

根据本发明的变体包含根据SEQ ID NO:2的成熟多肽进行编号的一个或多个取代，在此被披露为SEQ ID NO:3。除非另有说明，针对在此披露的变体所指的位置编号是指SEQ ID NO:3中的编号。

本发明涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且

a)其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:3的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

b)其中该变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:6的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

c)其中该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:9的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

d)其中该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:16的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

e)其中该变体与SEQ ID NO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:17的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

变体

本发明提供了在对应于SEQ ID NO:3的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性以及升高的热活性。

这些变体在一个或多个其他位置上可进一步包含一个或多个另外的改变。此类另外的改变不会显著影响根据本发明的变体的特性，但是会改变该变体与SEQ ID NO:3相比的％一致性。

在一个实施例中，该变体与亲本普鲁兰酶的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变化。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变化。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变化。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变化。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变化。

在一个具体实施例中，本发明涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的两个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的三个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的四个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的五个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且

在另一方面，变体在对应于位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的六个或更多个位置处包含取代。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、456、492、610、624、或699中的一个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且

在另一方面，该变体包括在对应于位置393的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置393的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cyt、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置143的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置143的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr取代，优选被Gly取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代V143G或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置150的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Arg取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代E150R或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置243的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置243相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N243E或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置244的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置244的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Lys取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代S244K或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置345的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置346的位置的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Pro取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代A345P或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置346的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置346相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N346S或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置368的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置368相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Glu取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置370的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置370的位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:3的多肽的取代K370S或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置373的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置373的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代I373L或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置381的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置381的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代I381V或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置382的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置382相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N382T或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置385的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置385的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Glu取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:3的多肽的取代Q385E或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置387的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置387的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Leu取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:3的多肽的取代Q387L或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置402的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置402的位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:3的多肽的取代M402T或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置429的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置429的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代I429V或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置430的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置430的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Arg取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T430R或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置431的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置431的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被谷氨酸取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代Q431E或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置432的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置432的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Phe取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代L432F或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置456的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置456的位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:3的多肽的取代F456A或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置486的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置486的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr取代，优选被Cys取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代V486C或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置492的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置492的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Ser或Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T492S,A或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置610的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置610相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Leu或精氨酸取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N610L或N610R或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置624的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置624的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:3的多肽的取代G624S或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置631的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置631的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val取代，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T631S或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置632的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置632的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val取代，优选被Cys取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代S632C或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置665的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置665的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr取代，优选被Ile取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代V665I或由该取代组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置699的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置699的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val取代，优选被Arg取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代E699R或由该取代组成。

在另一个方面，该变体包括选自下组的一个或多个取代或由其组成，该组由以下各项组成：393A、143G、150R、243E、244K、345P、346S、368G、370S、373L、381V、382T、385F、387L、402T、429V、430R、431E、432F、456A、486C、492S,A、610R,L、624S、631S、632C、665I以及699R，其中位置编号参照SEQ ID NO:3。在整个本说明书中的许多情况下，仅给出了应在取代之后存在的特定氨基酸。这是由于如下事实，即我们测试并发现了可以将取代引入许多不同亲本普鲁兰酶中并仍然导致相同的改进效果。这些不同的亲本普鲁兰酶在取代之前在相同的特定对应位置处不都具有相同的氨基酸。因此，为了获得所描述的效果，本质特征是在取代之后存在于特定位置处的特定氨基酸。

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

c)其中该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:9的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或d)其中该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ IDNO:16的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

a)其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:3的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

d)其中该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:16的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或e)其中该变体与SEQ ID NO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:17的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和432F的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置431E和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和432F和610R的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和432F和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和610R和624S的位置处的取代或由其组成，

其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和431E和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置393A和431E和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一方面，该变体包括在对应于位置368G和393A和431E和432F和610R和624S的位置处的取代或由其组成，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

在另一个具体实施例中，本发明的变体包含SEQ ID NO:3的多肽或在SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17的多肽的对应位置处的以下取代或特定取代的组合中的至少一个：

N368G；

E699R；

E150R；

N346S；

N243E；

S244K；

V143G；

N393A；

N610R；

N610L；

G624S；

F456A；

T492S,A；

V486C+T492S,A；

N368G+M402T；

T631S+S632C；

V486C+T492S,A+T631S+S632C；

N393A+T631S+S632C；

T631S+S632C+E699R；

N393A+V486C+T492S,A+T631S+S632C；

N393A+G624S+S632C；

N393A+N610R+T631S+S632C；

N393A+G624S+T631S+S632C；

N393A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+V486C+T492S,A+G624S+T631S+S632C；

N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+E699R；

N346S+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+F456A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+K370S+I373L+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

I381V+Q385E+Q387L+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

I381V+N382T+Q385E+Q387L+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+V665I；

N393A+T430R+Q431E+L432F+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+Q431E+L432F+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+I429V+Q431E+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+I429V+T430R+Q431E+L432F+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+A492S,A；

N368G+N393A；

N393A+N610R；

N368G+N393A+N610R；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；或

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

N368G；

N393A；

N610R；

G624S；

T492S,A；

N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+A492S,A；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且；

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代E699R的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代E150R的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N346S的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N243E的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代S244K的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代V143G的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N610R的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N610L的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代G624S的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代F456A的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T492S,A的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代V486C+T492S,A的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G+M402T的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ IDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ IDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代V486C+T492S,A+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T631S+S632C+E699R的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+V486C+T492S,A+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+G624S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+N610R+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+V486C+T492S,A+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+E699R的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N346S+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+F456A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代A345P+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G+K370S+I373L+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代I381V+Q385E+Q387L+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代I381V+N382T+Q385E+Q387L+N393A+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代A345P+N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代A345P+N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代A345P+N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+V665I的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+T430R+Q431E+L432F+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+Q431E+L432F+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+I429V+Q431E+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

更具体地，在一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N393A+I429V+T430R+Q431E+L432F+V486C+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该普鲁兰酶变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

当被引入披露为SEQ ID NO:3的亲本中时，所有上述特定取代或取代的组合具有使所得变体热活性增加的效果。为了测试特定取代在不同亲本酶中的效果，已将若干取代和取代的组合引入在此披露为SEQ ID NO:6的亲本酶中。所有被测试的取代还显示出在SEQID NO:6中是有效的。与SEQ ID NO:3相比，SEQ ID NO:6具有另外的100个氨基酸。因此，实际的位置编号是+100。这另外的100个氨基酸构成了所谓的具有104个氨基酸的X25结构域(具有未知功能的结构域)以及对应于N-末端部分中的4个氨基酸的缺失。X25结构域发现于SEQ ID NO:6的N-末端部分的位置158-261，催化结构域的上游。

在一个具体实施例中，本发明的变体包含SEQ ID NO:3的多肽或在SEQ ID NO:6的多肽的对应位置处的以下取代或特定取代的组合中的至少一个：

N368G；

N393A；

N610R；

G624S；

N368G+N393A+A492S,A；

N368G+N393A；

N393A+N610R；

N368G+N393A+N610R；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:6的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

类似地，在另外的实施例中，在此处被披露为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的亲本杂合普鲁兰酶中对取代的特定组合进行了测试。

因此，在一个具体实施例中，本发明的变体包含SEQ ID NO:3的多肽或在SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:17的多肽的对应位置处的以下取代或特定取代的组合中的至少一个：

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；或

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％的相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

当将亲本普鲁兰酶选为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17时(其比如SEQ ID NO:3多100个氨基酸，实际位置参照SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17)，编号将为+100。因此，作为举例，N368G+N393A+A492S将对应于SEQ ID NO:6中的N468G+N493A+A592S。

变体催化结构域

本发明提供了变体催化结构域，其中该变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代；并且

a)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:3的氨基酸330至828具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

b)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:6的氨基酸430至928具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

c)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:9的氨基酸330至829具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

d)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸430至928具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

e)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸430至928具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。

在另一方面，变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的两个或更多个位置处包含取代；并且

在另一方面，变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的三个或更多个位置处包含取代；并且

在另一方面，变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的四个或更多个位置处包含取代；并且

在另一方面，变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、345、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的五个或更多个位置处包含取代；并且

在另一方面，变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的六个或更多个位置处包含取代；并且

在另外的实施例中，本发明涉及包含根据本发明的变体催化结构域的普鲁兰酶变体，其中该普鲁兰酶变体具有普鲁兰酶活性以及与亲本普鲁兰酶相比升高的热活性，并且当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

包含变体催化结构域的普鲁兰酶变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置的393A、345P、346S、368G、370S、373L、381V、382T、385F、387L、402T、429V、430R、431E、432F、456A、486C、492S,A、610R,L、624S、631S、632C、665I以及699R。

根据本发明，已经构建了若干变体催化结构域(CD)，并且在实例中已经进一步示出，可以通过替换成熟普鲁兰酶的N-末端部分来进一步修饰具有升高的热活性的所得变体普鲁兰酶，而同时保留这些改进的特性，例如升高的热活性。

普鲁兰酶可以包含N-末端部分，这些N-末端部分包括选自CBM41结构域、X45结构域和CBM48结构域的结构域。因此，在一个实施例中，根据本发明的普鲁兰酶变体进一步包括一个N-末端部分，该N-末端部分包括选自CBM41结构域、X45结构域和CBM48结构域的结构域中的至少一个。在一个实施例中，所有这些结构域都可以存在。

根据本发明的普鲁兰酶变体可进一步包括X25结构域。优选地，这些N-末端结构域选自可获得自芽孢杆菌属细菌的CBM41、X45、X25、以及CBM48。特别地，该芽孢杆菌属菌种是嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌或脱支芽孢杆菌。

在一个具体实施例中，根据本发明的普鲁兰酶变体包括选自下组的一个或多个取代或由其组成，该组由以下各项组成：393A、368G、492S,A、610R,L、624S、631S、632C、431E、432F。更具体地，该变体催化结构域包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

368G+393A+492S,A；

368G+393A+T492A,S+610R+624S；

393A+492S,A+610R+624S+631S+632C；

368G+393A+492S,A+610R+624S+631S+632C；

368G+393A+492S,A+610R+624S+631S+632C+431E+432F；

368G+393A+610R+624S+631S+632C；或

368G+393A+610R+624S+631S+632C+431E+432F；

并且

实例中进一步描述了根据本发明的变体的具体实例，其中N-末端部分已经被替换。因此，在进一步的具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:20或与SEQ ID NO:20的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ IDNO:21或与SEQ ID NO:21的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+A492S,A的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:22的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:24或与SEQ ID NO:24的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ IDNO:25或与SEQ ID NO:25的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。在另一个具体实施例中，本发明涉及选自SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，使用SEQ ID NO:3进行编号。

在本发明的另一方面，可以通过添加另外的特定取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)进一步改进热活性，这些取代选自以下取代或取代的组合之一：Q258A；

Q287R；

Q352A；

Q356R；

Q258A+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

V212I；

H186A；

V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q485E+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+V586A+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+C732S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+S557A+L559G+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+H421E+Q487L+S557A+L559G+V586A+D686S+E799R。

在一个具体实施例中，本发明涉及选自与SEQ ID NO:26的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性并且包含取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)N468G+N493A+N710R+G724S+T731S+S732C+Q531E+L532F的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，并且其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Q258A；

Q287R；

Q352A；

Q356R；

Q258A+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

V212I；

H186A；

V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q485E+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+H421E+Q487L+S557A+L559G+V586A+D686S+E799R；当在72℃下测量时，使用PHADEBAS测定，相对于在65℃下的活性所述变体具有至少60％的相对活性。

在另一个具体实施例中，本发明涉及选自与SEQ ID NO:27的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性并且包含取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)N468G+N493A+T592S,A+N710R+G724S+T731S+S732C+Q531E+L532F的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，并且其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Q258A；

Q287R；

Q352A；

Q356R；

Q258A+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

V212I；

H186A；

V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q485E+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

在本发明的另一方面，可以通过添加另外的特定取代(使用SEQ ID NO:3进行编号)进一步改进热活性，这些取代选自以下取代或取代的组合之一：Y27K+H79Y+Q187R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+E699R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+T486S+D586S+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q385E+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+H321E+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R。

在一个具体实施例中，本发明涉及选自与SEQ ID NO:28的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性并且包含取代(使用SEQ ID NO:3进行编号)

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F的普鲁兰酶的普鲁兰酶变体，并且其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Y27K+H79Y+Q187R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+E699R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+T486S+D586S+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q385E+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+H321E+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R，当在76℃下测量时，使用PHADEBAS测定，相对于在65℃下的活性所述变体具有至少30％的相对活性。

这些变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的取代。这样的另一个变化可以被引入而不显著地影响这些普鲁兰酶变体的特性。

这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能有利于纯化的小的延伸，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁汉)和Wells(威尔斯)，1989，Science(科学)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的普鲁兰酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。

亲本普鲁兰酶

该亲本普鲁兰酶可以是通过结合融合到衍生自从在丹麦收集的腐植质样品中分离的脱支芽孢杆菌菌株(来自脱支芽孢杆菌的同源普鲁兰酶披露于US 6,074,854和US 5,817,498中)的普鲁兰酶的C-末端片段的衍生自描述于WO 2009/075682中的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(SEQ ID NO:4在WO 2009/075682中；GENESEQP：AXB71624)的普鲁兰酶的N-末端片段而获得的如在此描述的杂合酶，例如P008(SEQ ID NO:3)。在此披露的另外的亲本普鲁兰酶包括P258(在此被披露为SEQ ID NO:16)或P243(在此被披露为SEQ ID NO:17)、P006(在此被披露为SEQ ID NO:19)。

亲本普鲁兰酶还可以是任何可以通过引入如在此说明的一个或多个取代而增加热活性从而有利地改进的野生型、或变体或杂合普鲁兰酶。

亲本普鲁兰酶可以是(a)与SEQ ID NO:2或5或8的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ IDNO:1或4或7的成熟多肽编码序列(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或4或7的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2或5或8的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这一成熟多肽具有普鲁兰酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或5或8的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。

在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2或5或8的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2或5或8的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该亲本分别包括SEQ ID NO:2的氨基酸34至861；SEQ ID NO:5的氨基酸30至957或SEQ ID NO:8的氨基酸34至862或由其组成。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2或5或8的成熟多肽的等位基因变体。

在另一个方面，该亲本是由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1或4或7的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。

可以使用SEQ ID NO:1或4或7的多核苷酸及其子序列、连同SEQ ID NO:2或5或8的多肽及其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种类的菌株的亲本的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或4或7或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交是指，多核苷酸杂交到对应于以下的标记的核酸探针上：(i)SEQ ID NO:1或4或7；(ii)SEQ ID NO:1或4或7的成熟多肽编码序列；(iii)它们的全长互补体；或(iv)它们的子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1、4或7的成熟多肽编码序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸100至2583；SEQ ID NO:4的核苷酸88至2871、或SEQ IDNO:7的核苷酸100至2586。在另一个方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2、5或8的多肽；它的成熟多肽；或它的片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1、4或7。

在另一个实施例中，该亲本由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工程微生物和生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯瓦蒂娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术(Biotechnology)9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经***来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是细菌普鲁兰酶，例如，该亲本可以是***多肽，如芽孢杆菌属。

在一方面，该亲本是嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌或脱支芽孢杆菌普鲁兰酶。

在另一个方面，该亲本是芽孢杆菌属普鲁兰酶，例如具有SEQ ID NO:2或5或8的普鲁兰酶或其成熟多肽。

应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有普鲁兰酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:3、6、9的多肽或其杂合体的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699中的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入亲本普鲁兰酶，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及***片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其***载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节***的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核***中的调节***包括lac、tac、以及trp操纵子***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核***中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处***或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记***。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记***。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝***到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝***孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化：贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente)，在艾本尔森，J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙，M.I.(Simon,M.I.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

生产方法

本发明还涉及用于产生亲本普鲁兰酶的变体普鲁兰酶的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的一个或多个位置处取代该亲本普鲁兰酶，其中该变体具有普鲁兰酶活性以及与亲本相比升高的热活性；并且

a)其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

b)其中该变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

c)其中该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。

一个另外的实施例涉及通过本发明的方法产生的变体普鲁兰酶。

在另一方面，产生变体的方法，该方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的普鲁兰酶变体的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的普鲁兰酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。

这些组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如根据本发明的普鲁兰酶变体以及一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。优选地，包括于组合物中的这些酶活性选自如根据本发明的杂合普鲁兰酶以及一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、以及蛋白酶。在一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。在另一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。在另一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶。在另一个具体实施例中，该组合物包括普鲁兰酶、以及β-淀粉酶。

在具体实施例中，该组合物包括本发明的变体普鲁兰酶以及α-淀粉酶。优选地是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度下典型地是稳定的。在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比较，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸。优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239的位置处具有取代。在优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用WO99/19467中披露的SEQ ID NO:3进行编号)。

在另一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选WO 2013/006756中SEQ ID NO:7中所示的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，尤其是G128D+D143N。

在另一个具体实施例中，该组合物包括本发明的变体普鲁兰酶以及蛋白酶。在优选的实施例中，该蛋白酶是在WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:2的橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶的变体，或具有WO 2011/072191中SEQ ID NO:2的氨基酸1-177，具有以下突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在另一个实施例中，该蛋白酶来源于热球菌属的细菌菌株，例如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株(pfu蛋白酶)。

在实施例中，该蛋白酶是在美国专利号6,358,726-B1中示为SEQ ID NO:1的蛋白酶。在另一个实施例中，该蛋白酶是在WO 2012/088303中示为SEQ ID NO:13的蛋白酶。

在另一个具体实施例中，该组合物包括本发明的杂合普鲁兰酶以及葡糖淀粉酶。在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌菌株，特别是在WO2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有使用成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸22-616)进行编号的K79V取代，并且描述于WO2013/036526中。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ IDNO:2的氨基酸22-616的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代以及以下取代中的一个或多个：P2N、P4S、P11F、T65A、Q327F，尤其是在WO 2013/053801中描述的P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F。

在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，尤其是血红密孔菌菌株，特别是在WO 2011/066576中披露为SEQ ID NO:2、4或6的血红密孔菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该酶组合物包括如WO 2011/066576中SEQ ID NO:6的氨基酸19-573所示的葡糖淀粉酶。

在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是密粘褶菌菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:18的密粘褶菌葡糖淀粉酶。在尤其优选的实施例中，该酶组合物包括在WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且具有以下取代中的一个或多个：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P，使用成熟多肽(SEQ ID NO:18的第18-576位)进行编号。

在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是篱边粘褶菌的菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸18-573的成熟的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶。

在具体实施例中，该组合物包括本发明的变体普鲁兰酶和葡糖淀粉酶以及任选地α-淀粉酶，并且其中该普鲁兰酶选自与此处SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+A492S的多肽，使用SEQ ID NO:3进行编号，并且该葡糖淀粉酶选自i)变体密粘褶菌葡糖淀粉酶，相比于WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576中阐述的野生型密粘褶菌葡糖淀粉酶氨基酸序列，该变体包括取代S95P+A121P；或ii)与WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体，并且该α-淀粉酶选自：i)具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶变体，与在WO 2013/006756中的SEQ ID NO:7中阐述的杂交微小根毛霉α-淀粉酶氨基酸序列相比，该变体包括取代G128D+D143N；或ii)与WO 2013/006756中SEQ ID NO:7的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的变体。

该组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。

该组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。

该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。

下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

使用普鲁兰酶变体的方法-工业应用

本发明还涉及在各种工业应用中使用本发明的多肽的方法。

本发明的多肽可用于淀粉过程，特别是淀粉转化、尤其是淀粉液化(参见例如，美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909、WO 99/19467以及WO 96/28567，这些专利全部通过引用结合在此)。还考虑的是用于淀粉转化目的的组合物，其除本发明的多肽之外，还可包含葡糖淀粉酶(AMG)和α-淀粉酶。

此外，本发明的多肽特别适用于从淀粉或全谷粒中生产甜味剂以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，该专利通过引用结合在此)，如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。

在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的多肽用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。在一个实施例中，该淀粉材料可以是经糊化的。在另一个实施例中，该淀粉材料是未经糊化的。

淀粉加工

天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化(gelatinization)”过程中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少该含淀粉材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所已知。

由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业做法中，粘度的这种降低主要通过酶法降解来实现。

在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。在实施例中，在液化期间，还存在降粘酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。

在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及线性的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。

在实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮过程。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。

在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如85℃左右，将液化过程进行约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。

通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。

在下面的“α-淀粉酶”部分中披露了α-淀粉酶的实例。

可以使用本领域熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，具体是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或普鲁兰酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在一个同时糖化和发酵过程(SSF)中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)下，并且在约4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行糖化。

糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度下执行一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行一个完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH4.5。在一个同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶一起添加。

在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或普鲁兰酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由普鲁兰酶降解。如果糖化过程中仍然存在得自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。

其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。

可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。在下面的“酶”部分中披露了产碳水化合物源的酶的实例。

在具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包含以下步骤：

(x)减少该含淀粉材料的粒度；并且

(y)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆料。

在实施例中，将该含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。

该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。

常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。

在实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括一个脱支步骤。

当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如一个预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。

当所需的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换除去钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。

发酵产物的生产

可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，尤其是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。

在实施例中，液化过程步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且尤其是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。

发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括(但不局限于)FALI(弗莱希曼酵母(Fleischmann'sYeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司(DSMSpecialties))、RED STAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(AngelYeastCompany)，中国(China))。这些方法中所使用的起始酵母的量是在合适时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞总体上以约10⁴至约10¹²、并且优选地从约10⁷至约10¹⁰活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，约pH 4-5。

除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可包括营养物以及额外酶，这些额外酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。

在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需最终产物时，可使用一种乳酸杆菌属种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。

用于由含未经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法

本发明涉及在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“粗淀粉水解”方法)。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)、优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。

因此，在一个方面中，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：使用产碳水化合物源的酶以及发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下将含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一个方面中，本发明涉及生产发酵产物的过程，包括以下步骤：

(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且

(ii)使用发酵生物进行发酵；

其中使用至少葡糖淀粉酶和根据本发明的变体普鲁兰酶进行步骤(i)。

在一个实施例中，在步骤(i)中添加α-淀粉酶。在另一个实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行。

在一个实施例中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在一种或多种淀粉酶如葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或一种或多种α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使原料淀粉水解的葡糖淀粉酶。一种或多种α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母例如，酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用古林斯坦(Gorinstein)和李(Lii)，1992，淀粉

44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该方法之前，可以制备具有10-55w/w％干固体(DS)、优选25-45w/w％干固体、更优选30-40w/w％干固体的含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。由于本发明的方法是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在实施例中，水性浆料含有从约1至约70vol.％、优选地15-60vol.％、尤其是从约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉材料可优选地通过干式或湿式碾磨来减少粒度至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉材料中至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明此方面中的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在优选的实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度下进行。在实施例中，执行该方法以使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％，如低于约3w/w％，如低于约2w/w％，如低于约1w/w％，如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从pH 3.5到6、或更优选地从pH 4到5的pH下进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。

由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法

在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：

(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；或

(b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；

(c)使用发酵生物体进行发酵；

其中在根据本发明的普鲁兰酶的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。

在实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在实施例中，金属蛋白酶来自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是来源于热球菌属菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的激烈热球菌。在实施例中，葡糖淀粉酶来源于曲霉属的菌株，例如，黑曲霉或泡盛曲霉、踝节菌属的菌株，尤其是埃默森踝节菌；或阿太菌属的菌株，尤其是罗氏阿太菌；栓菌属的菌株，例如，瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，例如，篱边黏褶菌或密粘褶菌；或其混合物。糖化步骤(b)以及发酵步骤(c)可依序或同时进行。当该方法作为依序糖化和发酵过程来执行时，普鲁兰酶和/或金属蛋白酶可在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时执行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。普鲁兰酶和/或金属蛋白酶还可有利地在液化之前(预液化处理)，即在步骤(a)之前或期间，和/或在液化之后(液化后处理)，即在步骤(a)之后添加。普鲁兰酶最有利地在液化之前或期间，即在步骤(a)之前或期间添加。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：

x)优选地通过研磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉的材料的粒径；

y)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆料。

在实施例中，粒度是小于#7筛，例如#6筛。#7筛通常用于常规现有技术过程中。水性浆料可含有从10-55，例如25-45以及30-40的w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在实施例中，在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以喷射蒸煮该浆料以进一步使该浆料经糊化。在实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同普鲁兰酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在实施例中，然后，可将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、如105℃-125℃之间的温度下喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶变体以及任选地普鲁兰酶变体和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度下执行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。

含淀粉材料

可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是一种蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在优选的实施例中，该含淀粉材料是玉米。在优选的实施例中，该含淀粉材料是小麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产品。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在优选的实施例中，该发酵产物是乙醇。

以釜馏物加工淀粉浆料

碾磨的含淀粉材料与水以及回收的稀釜馏物合并以产生水性浆料。浆料可包含15至55％ds w/w之间(例如20％至50％、25％至50％、25％至45％、25％至40％、20％至35％以及30％-36％ds)。在一些实施例中，回收的稀釜馏物(逆流)在约10至70％v/v(例如10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、20％至60％、20％至50％、20％至40％以及还有20％至30％范围内)。

一旦经碾磨的含淀粉材料与水以及逆流合并，不调整浆料中的pH。此外，在将植酸酶以及任选地α-淀粉酶添加至浆料之后，不调整pH。在实施例中，浆料的pH是在约pH 4.5至小于约6.0范围内(例如pH 4.5至5.8、pH 4.5至5.6、pH 4.8至5.8、pH 5.0至5.8、pH 5.0至5.4、pH 5.2至5.5以及pH 5.2至5.9)。取决于添加至浆料的稀釜馏物的量以及包含稀釜馏物的材料的类型，浆料的pH可在约pH 4.5与5.2之间。例如，稀釜馏物的pH可在pH 3.8与pH4.5之间。

在乙醇生产期间，可添加酸以降低啤酒池中的pH，以减少在蒸馏之前的微生物污染的风险。

在一些实施例中，将植酸酶添加至浆料。在其他实施例中，除了植酸酶以外，将α-淀粉酶添加至浆料。在一些实施例中，将植酸酶以及α-淀粉酶依序添加至浆料。在其他实施例中，同时添加植酸酶以及α-淀粉酶。在一些实施例中，将包含植酸酶以及任选地α-淀粉酶的浆料孵育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时以及15分钟至4小时)的时间。在其他实施例中，在约40℃至115℃(例如，45℃至80℃、50℃至70℃、50℃至75℃、60℃至110℃、60℃至95℃、70℃至110℃、70℃至85℃以及77℃至86℃)范围内的温度下孵育浆料。

在其他实施例中，在比含淀粉材料的淀粉糊化温度低约0℃至约30℃(例如，0至25℃、0至20℃、0至15℃、0至10℃以及0至5℃)的温度下孵育浆料。在一些实施例中，温度是低于约68℃、低于约65℃、低于约62℃、低于约60℃以及低于约55℃。在一些实施例中，温度是高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃以及高于约60℃。在一些实施例中，在低于淀粉糊化温度的温度下孵育包含植酸酶以及α-淀粉酶的浆料被称为主要(1°)液化。

在一个实施例中，经碾磨的含淀粉材料是玉米或高粱。浆料包含25％至40％DS，pH在4.8至5.2范围内，并且浆料与植酸酶以及任选地α-淀粉酶在60℃至75℃范围内的温度下孵育5分钟至2小时。

当前，据信用于液化过程的可商购的微生物α-淀粉酶总体上不能足够稳定地在高于约80℃的温度下、在小于pH 5.6的pH水平下使用全谷粒从干式碾磨过程中产生液化淀粉底物。许多可商购的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH下降低。

在另外的液化步骤中，在约4.0至5.5的pH下，孵育或预处理的含淀粉材料经历比含淀粉材料的淀粉糊化温度(例如，70℃至120℃、70℃至110℃以及70℃至90℃)高的温度增加，如约0℃至约45℃，持续约2分钟至约6小时的一段时间(例如，2分钟至4小时、90分钟、140分钟以及90至140分钟)，更优选地1小时与2小时之间。温度可通过常规高温喷射蒸煮***来增加一段较短时间，例如，1至15分钟。然后，淀粉可进一步在从约75℃至95℃(例如，80℃至90℃以及80℃至85℃)范围内的温度下水解约15至150分钟(例如，30至120分钟)的时间。在优选的实施例中，pH在这些过程步骤期间未调整，并且液化醪液的pH在约pH 4.0至pH5.8(例如pH 4.5至5.8、pH 4.8至5.4以及pH 5.0至5.2)范围内。在一些实施例中，将第二剂量的热稳定的α-淀粉酶添加至二次液化步骤，但是在其他实施例中没有额外剂量的α-淀粉酶。

可在孵育以及液化步骤之后进行本领域中熟知的糖化以及发酵步骤。

蒸馏

任选地，在发酵之后，可例如通过蒸馏以及任选地随后进行一个或多个过程步骤来萃取醇(例如，乙醇)。

在一些实施例中，通过在此提供的方法来生产的乙醇的产率是至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％以及至少18％(v/v)以及至少23％v/v。根据在此提供的方法来获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。

副产物

来自发酵的剩余物是酒糟，它典型地用于液体或干燥形式的动物饲料。在另外的实施例中，最终产物可包括可用作例如动物饲料的发酵副产物如干酒糟(DDG)以及含可溶物的干酒糟(DDGS)。

关于如何完成液化、糖化、发酵、蒸馏以及回收乙醇的进一步细节是本领域技术人员熟知的。

根据在此提供的方法，糖化以及发酵可同时或单独地执行。

发酵生物

术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，例如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如***糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。

发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母；毕赤酵母属的菌株，特别是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS5773或巴斯德毕赤酵母；假丝酵母属的菌株，特别是***糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、博伊丁假丝酵母、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、假热带假丝酵母(Candidatropicalis)或产朊假丝酵母。其他发酵生物包括汉逊酵母属的菌株，特别是异常汉森酵母或多形汉逊酵母；克鲁弗酵母属的菌株，特别是脆壁克鲁弗酵母或马克斯克鲁弗酵母(Kluyveromyces marxianus)；以及裂殖酵母属的菌株，特别是粟酒裂殖酵母。

优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属的菌株，特别是大肠杆菌；发酵单胞菌属的菌株，特别是运动发酵单胞菌；发酵杆菌属的菌株，特别是棕榈科发酵杆菌(Zymobactorpalmae)；克雷伯菌属的菌株，特别是产酸克雷伯菌；明串珠菌属的菌株，特别是肠膜状明串珠菌；梭菌属的菌株，特别是丁酸梭菌；肠杆菌属的菌株，特别是产气肠杆菌；以及高温厌氧杆菌属的菌株，特别是高温厌氧杆菌BG1L1(应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotech.)77:61-86)、产乙醇高温厌氧杆菌(Thermoanarobacterethanolicus)、产甲烷高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)或热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。乳杆菌属的菌株也被预期，如谷氨酸棒状杆菌R、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和嗜热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。

在实施例中，该发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。

在实施例中，该发酵生物是C5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。

在一个实施例中，将该发酵生物添加至发酵培养基中，这样使得每mL的发酵培养基的活发酵生物(如酵母)计数在从10⁵至10¹²个的范围内，优选从10⁷至10¹⁰个，尤其是约5x10⁷个。

酵母是用于乙醇发酵的优选发酵生物。优选的是酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母种的菌株，优选是对高水平的乙醇(即，直到例如约10、12、15或20vol.％或更多的乙醇)耐受的菌株。

在实施例中，利用C5的酵母是披露于WO 2004/085627中的酿酒酵母菌株。

在实施例中，发酵生物是WO 2010/074577(内达尔科(Nedalco))中关注的C5真核微生物细胞。

在实施例中，发酵生物是披露于US 2008/0014620中的能够直接将木糖同分异构化为木糖的经转化C5真核细胞。

在实施例中，发酵生物是披露于WO 2009/109633中的C5糖发酵细胞。

可商购的酵母包括LNF SA-1、LNF BG-1、LNF PE-2和LNF CAT-1(可获得自巴西的LNF)，RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。

能够从可发酵糖生产所希望的发酵产物的发酵生物优选在精确条件条件下以具体生长速率生长。当将该发酵生物引入进/添加至发酵培养基中时，接种的发酵生物经过多个阶段。不出现原始生长。此时期称为“停滞期”并且可以被认为是适应时期。在称为“对数期”的接下来的阶段过程中，生长速率逐渐增加。在最大生长期间后，速率停止并且发酵生物进入“静止期”。在另外的时间段后，发酵生物进入“死亡期”，其中活细胞的数目下降。

发酵

基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。

例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度下进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。

对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度下进行发酵。在实施例中，pH是从pH 3至6，优选pH 4至5左右。

其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员已知的、适于所讨论的发酵生物的温度下发酵。

典型地在3与7之间的范围内的pH，优选从pH 3.5至6，如pH 5左右下进行发酵。发酵典型地持续6-96小时。

本发明的方法可以作为分批过程或作为连续过程进行。发酵可以在超滤***中进行，其中将渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是包含所希望的发酵产物的液体。同样考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中执行的方法/工艺，并且其中将渗余物在固体、水和一种或多种发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是包含发酵产物的液体。

发酵后，可以将发酵生物与发酵的浆料分开并再循环。

发酵培养基

短语“发酵培养基(fermentation media)”或“发酵培养基(fermentationmedium)”是指进行发酵的环境并且包括发酵底物，即被一种或多种发酵生物代谢的碳水化合物来源。

发酵培养基可以包括针对一种或多种发酵生物的其他营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂被广泛地用于发酵领域中并且包括氮源，例如氨；维生素以及矿物质或其组合。

回收

继发酵之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以将发酵培养基蒸馏以提取所希望的发酵产物或可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。可替代地，可以通过汽提回收发酵产物。回收方法在本领域中是熟知的。

组合物

本发明还涉及包含根据本发明的杂合普鲁兰酶以及至少一种另外的酶的组合物。一种或多种另外的酶可选自下组，该组由以下各项组成：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶)、半纤维素酶(例如木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶、其他普鲁兰酶、和/或在商业过程中结合普鲁兰酶使用的其他酶。这类酶在淀粉处理、糖转化、醇以及其他有用最终产物的发酵、商业洗涤剂以及净化助剂、去污、织物处理或退浆等等的领域中是已知的。

酶

下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。

α-淀粉酶

可以使用任何α-淀粉酶，例如真菌、细菌或植物源的。在优选的实施例中，该α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加，在3至7、优选从3.5至6或更优选从4-5的范围内的pH下具有最适活性的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。

细菌α-淀粉酶

用于在本发明中使用的α-淀粉酶可以是一种细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属。在优选的实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以来源于其他芽孢杆菌属物种。

α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 99/19467中的SEQ IDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用而结合在此)。在实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。

芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的变体和/或杂合体：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文献都通过引用而结合在此)。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,576和6,297,038中(通过引用而结合在此)并且包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179至G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO 96/23873中的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用而结合在此)，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用而结合在此)中的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ IDNO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于δ(181-182)的一种双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239的位置处具有取代。在优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和

细菌杂合α-淀粉酶

该α-淀粉酶可以是杂合α-淀粉酶，例如包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有以下取代中的一个或多个(尤其是全部)：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌进行编号)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。

真菌α-淀粉酶

真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属的菌株的α-淀粉酶，例如白曲霉、黑曲霉和米曲霉α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶是与在WO 96/23874中示为SEQ ID NO:10的氨基酸序列的成熟部分展现出高度一致性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性的α-淀粉酶。

另一种优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉的菌株。在优选的实施例中，该酸性真菌α-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且描述于WO 89/01969(实例3-通过引用而结合)中的黑曲霉α-淀粉酶。

其他野生型α-淀粉酶包括来源于亚灰树花菌属(Meripilus)和根毛霉属的菌株，优选大型亚灰树花菌或微小根毛霉的菌株的那些(WO 2004/055178，将其通过引用结合在此)。

在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于白曲霉(金子(Kaneko)等人，1996，发酵与生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)81:292-298：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的基因的核苷酸序列的分子克隆和测定(Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii)”；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370)。

该真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合结构域(SBD)和α-淀粉酶催化结构域的野生型酶或其变体。

真菌杂合α-淀粉酶

在优选的实施例中，该真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2005/003311、美国专利申请公开号2005/0054071(诺维信公司)和WO2006/069290(诺维信公司)(通过引用而结合在此)中的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化结构域(CD)和碳水化合物结合结构域/模块(CBM)(例如淀粉结合结构域(SBD))以及任选地接头。

杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2006/069290中的实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQID NO:96的组合)或作为WO 2006/069290的表5中的V039、以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:102)。其他杂合α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(将其通过引用而结合在此)的实例4的表3、4、5以及6中。

在优选的实施例中，该α-淀粉酶是衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选WO 2013/006756中SEQ ID NO:7中所示的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，特别是G128D+D143N。

杂合α-淀粉酶的其他实例包括披露于美国专利申请公开号2005/0054071中的那些，包括披露于第15页上表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合结构域的黑曲霉α-淀粉酶。

其他α-淀粉酶与任何上述α-淀粉酶展现出高度的序列一致性，即与上面披露的成熟酶序列展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。

商用α-淀粉酶产品

包括α-淀粉酶的优选的商用组合物包括MYCOLASE^TM(DSM)、BAN^TM、TERMAMYL^TM SC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TM X、LIQUOZYME^TM SC和SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L(诺维信公司)以及CLARASE^TM L-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TM FRED、SPEZYME^TM AA、SPEZYME^TM ALPHA、SPEZYME^TM DELTA AA、GC358、GC980、SPEZYME^TM CL和SPEZYME^TM RSL(杜邦工业生物科学(DuPont Industrial Biosciences))，以及来自黑曲霉的称作SP288的酸性真菌α-淀粉酶(可获得自诺维信公司，丹麦)。

产碳水化合物源的酶(糖化酶)

术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成器)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(两种麦芽糖生成器)并且还包括α-葡糖苷酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。产碳水化合物源的酶能够产生可以所讨论中一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产物(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产品，优选乙醇。可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。共混物包括以下混合物，这些混合物包括至少葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶，尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选的是酸性真菌α-淀粉酶。

在常规的淀粉到乙醇的方法(即，包括液化步骤)中，可以如EP 140410中定义该比例，尤其是当同时进行糖化和发酵时。

葡糖淀粉酶

术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。

该葡糖淀粉酶的添加量可以为0.001到10AGU/g DS，优选地从0.01到5AGU/g DS，例如为约0.1、0.3、0.5、1或2AGU/g DS，尤其是0.1至0.5AGU/g DS或0.02-20AGU/g DS，优选地0.1-10AGU/g DS。

葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌源的，选自下组,该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(哈塔(Hata)等人，1991，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)55(4):941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(Prot.Eng.)10:1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，1998，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于Talaromyces duponti、埃默森踝节菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)以及嗜热踝节菌(美国专利号4,587,215)。粘褶菌属(US 2012/0214196)。

在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌菌株，特别是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有使用成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸22-616)进行编号的K79V取代，并且描述于WO 2013/036526中。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸22-616的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代以及以下取代中的一个或多个：P2N、P4S、P11F、T65A、Q327F，尤其是在WO 2013/053801中描述的P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F。

细菌葡糖淀粉酶包括来自以下各项的葡糖淀粉酶：梭菌属(特别是嗜热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135138)和嗜热解硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831))，瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部披露于WO 2006/069289中；或披露于PCT/US 2007/066618中的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。可以在本发明中使用杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例披露于WO 2005/045018中。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用结合在此)。

该葡糖淀粉酶可以与任何上述葡糖淀粉酶具有高度序列一致性，即与上述成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。

可商购的葡糖淀粉酶组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER，SAN^TM EXTRAL，SPIRIZYME^TM PLUS，SPIRIZYME^TM FUEL，SPIRIZYME^TM B4U，SPIRIZYME ULTRA^TM和AMG^TM E(来自诺维信公司，丹麦)；OPTIDEX^TM 300，GC480^TM和GC147^TM(来自杜邦工业生物科学(DuPont Industrial Biosciences)，美国)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900，G-ZYME^TM和G990Zr(来自杜邦工业生物科学)。

能以0.02-20AGU/g DS、优选0.1-10AGU/g DS、尤其是1-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS、例如0.5AGU/g DS或以0.0001-20AGU/g DS的量、优选0.001-10AGU/g DS、尤其是0.01-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS的量添加葡糖淀粉酶。

β-淀粉酶

β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统地给予外切作用的麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。麦芽糖单位以逐步方式依次从非还原链末端去除，直到该分子被降解，或在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。

β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离(福格蒂(Fogarty)和凯利(Kelly)，1979，工业微生物学进展(Progress in Industrial Microbiology)15:112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的可商购β-淀粉酶是来自丹麦的诺维信公司的NOVOZYM^TM WBA和来自美国的杜邦工业生物科学的SPEZYME^TM BBA 1500。

麦芽糖淀粉酶

淀粉酶还可以是麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，EC 3.2.1.133)，其催化α-构型的直链淀粉和支链淀粉水解为麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而结合在此。

能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加麦芽糖淀粉酶。

普鲁兰酶

普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其由它们在例如支链淀粉(amylopectin)和普鲁兰(pullulan)中水解α-1,6-糖苷键的能力表征。

可以添加根据本发明的普鲁兰酶，以及此外任何其他的普鲁兰酶，优选细菌普鲁兰酶，优选来源于芽孢杆菌属的菌株，尤其是来源于脱支芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、淀粉脱支芽孢杆菌或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的菌株。

根据本发明的普鲁兰酶可以按有效量添加，该有效量包括从1-100微克/g DS之间，尤其是从10-60微克/g DS的优选范围。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于下文的“材料与方法”-部分中。

在优选的实施例中，以1-100微克酶蛋白/g DS之间，优选10-60微克酶蛋白/g DS之间的量使用普鲁兰酶。

适合的可商购普鲁兰酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYME^TM D2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-1000、OPTIMAX L-300(杜邦工业生物科学)以及AMANO 8(安能满公司(Amano)，日本)。

本发明进一步由下述编号的实施例描述：

[实施例1]在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代的普鲁兰酶变体，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且

[实施例2]根据实施例1所述的普鲁兰酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的两个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

[实施例3]根据实施例1所述的普鲁兰酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的三个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

c)其中该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:9的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少30％相对活性，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

[实施例4]根据实施例1所述的普鲁兰酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的四个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

a)其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:3的普鲁兰酶相比，该变体具有升高的热活性，特别地，当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性；或

[实施例5]根据实施例1所述的普鲁兰酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的五个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

[实施例6]根据实施例1所述的普鲁兰酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的六个或更多个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

[实施例7]根据以上实施例中任一项所述的普鲁兰酶变体，该变体在对应于SEQID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、486、492、610、624、或699中的一个位置处包含取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性。

[实施例8]如实施例1-7中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。

[实施例9]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置393的位置处的取代。

[实施例10]如实施例09所述的变体，其中该取代是用丙氨酸进行的。

[实施例11]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置143的位置处的取代。

[实施例12]如实施例11所述的变体，其中该取代是用缬氨酸进行的。

[实施例13]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置150的位置处的取代。

[实施例14]如实施例13所述的变体，其中该取代是用精氨酸进行的。

[实施例15]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置243的位置处的取代。

[实施例16]如实施例15所述的变体，其中该取代是用谷氨酸进行的。

[实施例17]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置244的位置处的取代。

[实施例18]如实施例17所述的变体，其中该取代是用赖氨酸进行的。

[实施例19]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置345的位置处的取代。

[实施例20]如实施例19所述的变体，其中该取代是用脯氨酸进行的。

[实施例21]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置346的位置处的取代。

[实施例22]如实施例21所述的变体，其中该取代是用丝氨酸进行的。

[实施例23]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置368的位置处的取代。

[实施例24]如实施例23所述的变体，其中该取代是用谷氨酸进行的。

[实施例25]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置370的位置处的取代。

[实施例26]如实施例25所述的变体，其中该取代是用丝氨酸进行的。

[实施例27]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置373的位置处的取代。

[实施例28]如实施例27所述的变体，其中该取代是用亮氨酸进行的。

[实施例29]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置381的位置处的取代。

[实施例30]如实施例29所述的变体，其中该取代是用缬氨酸进行的。

[实施例31]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置382的位置处的取代。

[实施例32]如实施例31所述的变体，其中该取代是用苏氨酸进行的。

[实施例33]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置385的位置处的取代。

[实施例34]如实施例33所述的变体，其中该取代是用谷氨酸进行的。

[实施例35]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置402的位置处的取代。

[实施例36]如实施例35所述的变体，其中该取代是用苏氨酸进行的。

[实施例37]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置429的位置处的取代。

[实施例38]如实施例37所述的变体，其中该取代是用缬氨酸进行的。

[实施例39]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置430的位置处的取代。

[实施例40]如实施例39所述的变体，其中该取代是用精氨酸进行的。

[实施例41]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置431的位置处的取代。

[实施例42]如实施例41所述的变体，其中该取代是用谷氨酸进行的。

[实施例43]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置432的位置处的取代。

[实施例44]如实施例43所述的变体，其中该取代是用苯丙氨酸进行的。

[实施例45]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置456的位置处的取代。

[实施例46]如实施例45所述的变体，其中该取代是用丙氨酸进行的。

[实施例47]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置486的位置处的取代。

[实施例48]如实施例47所述的变体，其中该取代是用半胱氨酸进行的。

[实施例49]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置492的位置处的取代。

[实施例50]如实施例49所述的变体，其中该取代是用丝氨酸或丙氨酸进行的。

[实施例51]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置610的位置处的取代。

[实施例52]如实施例51所述的变体，其中该取代是用亮氨酸或精氨酸进行的。

[实施例53]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置624的位置处的取代。

[实施例54]如实施例53所述的变体，其中该取代是用丝氨酸进行的。

[实施例55]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置631的位置处的取代。

[实施例56]如实施例55所述的变体，其中该取代是用丝氨酸进行的。

[实施例57]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置632的位置处的取代。

[实施例58]如实施例57所述的变体，其中该取代是用半胱氨酸进行的。

[实施例59]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置665的位置处的取代。

[实施例60]如实施例59所述的变体，其中该取代是用异亮氨酸进行的。

[实施例61]如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包括对应于位置699的位置处的取代。

[实施例62]如实施例61所述的变体，其中该取代是用精氨酸进行的。

[实施例63]根据实施例1-62所述的变体，其中该变体包括选自下组的一个或多个取代或由其组成，该组由以下各项组成：393A、143G、150R、243E、244K、345P、346S、368G、370S、373L、381V、382T、385F、387L、402T、429V、430R、431E、432F、456A、486C、492S、610R,L、624S、631S、632C、665I以及699R。

如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

N368G；

E699R；

E150R；

N346S；

N243E；

S244K；

V143G；

N393A；

N610R；

N610L；

G624S；

F456A；

T492S；

V486C+T492S；

N368G+M402T；

T631S+S632C；

V486C+T492S+T631S+S632C；

N393A+T631S+S632C；

T631S+S632C+E699R；

N393A+V486C+T492S+T631S+S632C；

N393A+G624S+S632C；

N393A+N610R+T631S+S632C；

N393A+G624S+T631S+S632C；

N393A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+V486C+T492S+G624S+T631S+S632C；

N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C+E699R；

N346S+N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+F456A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+K370S+I373L+N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

I381V+Q385E+Q387L+N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

I381V+N382T+Q385E+Q387L+N393A+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N368G+N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

A345P+N368G+I381V+Q385E+Q387L+N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C+V665I；

N393A+T430R+Q431E+L432F+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+Q431E+L432F+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+I429V+Q431E+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N393A+I429V+T430R+Q431E+L432F+V486C+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+A492S,A；

N368G+N393A；

N393A+N610R；

N368G+N393A+N610R；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F；

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C；

N368G+N393A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F。

[实施例64]变体催化结构域，其中该变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、631、632、665以及699的一个或多个位置处包含取代；并且；

a)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

b)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

c)其中该变体催化结构域与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

[实施例65]根据实施例64所述的变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的两个或更多个位置处包含取代，其中该变体催化结构域具有普鲁兰酶活性，并且；

[实施例66]根据实施例64所述的变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的三个或更多个位置处包含取代，其中该变体催化结构域具有普鲁兰酶活性，并且；

[实施例67]根据实施例64所述的变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的四个或更多个位置处包含取代，其中该变体催化结构域具有普鲁兰酶活性，并且；

[实施例68]根据实施例64所述的变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、345、346、368、370、373、381、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的五个或更多个位置处包含取代，其中该变体催化结构域具有普鲁兰酶活性；并且

[实施例69]根据实施例64所述的变体催化结构域在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的六个或更多个位置处包含取代，其中该变体催化结构域具有普鲁兰酶活性；并且

[实施例70]包含根据实施例64至69中任一项所述的变体催化结构域的普鲁兰酶变体，其中该普鲁兰酶变体具有普鲁兰酶活性以及与亲本普鲁兰酶相比升高的热活性，并且当在70℃下测量时，相对于在65℃下的活性该变体具有至少60％的相对活性，更具体地至少65％、更具体地至少70％、更具体地至少60％、更具体地至少75％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少100％的相对活性。

[实施例71]根据实施例70所述的普鲁兰酶变体，其中该变体包括选自下组的一个或多个取代或由其组成，该组由以下各项组成：393A、143G、150R、243E、244K、345P、346S、368G、370S、373L、381V、382T、385F、387L、402T、429V、430R、431E、432F、456A、486C、492S、610R,L、624S、631S、632C、665I以及699R。

[实施例72]根据实施例64-71中任一项所述的普鲁兰酶变体，该变体进一步包括N-末端部分，该N-末端部分包括选自CBM41结构域、X45结构域和CBM48结构域的结构域中的至少一个。

[实施例73]根据实施例72所述的普鲁兰酶变体，该变体包括N-末端部分，该N-末端部分包括CBM41结构域、X45结构域和CBM48结构域。

[实施例74]根据实施例72-73所述的普鲁兰酶变体，该变体进一步包括X25结构域。

[实施例75]根据实施例64-74中任一项所述的普鲁兰酶变体，其中该变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：393A、368G、486C、492S,A、610R,L、624S、631S、632C、431E、432F。

[实施例74]根据实施例75所述的普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

368G+393A+492S,A；

368G+393A+492A,S+610R+624S；

393A+492S,A+610R+624S+631S+632C；

368G+393A+492S,A+610R+624S+631S+632C；

368G+393A+492S,A+610R+624S+631S+632C+431E+432F；

368G+393A+610R+624S+631S+632C；或

368G+393A+610R+624S+631S+632C+431E+432F。

[实施例77]根据实施例1-76中任一项所述的普鲁兰酶变体，该变体选自SEQ IDNO:20或与SEQ ID NO:20的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:21或与SEQ ID NO:21的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:22的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:24或与SEQID NO:24的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ IDNO:27或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶。

[实施例78]根据实施例1-77所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是升高的热活性。

[实施例79]根据实施例1-78所述的变体，其中与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQID NO:9、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17中的任一个相比，该变体针对淀粉或麦芽糊精具有增加的比活性。

[实施例80]根据实施例79所述的变体，其中该变体选自SEQ ID NO:20或与SEQ IDNO:20的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:21或与SEQ ID NO:21的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:22的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶。SEQ IDNO:23或与SEQ ID NO:23的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶；SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶。SEQ ID NO:28或与SEQID NO:28的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性的普鲁兰酶。

[实施例81]根据以上实施例中任一项所述的变体，其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一(使用SEQ ID NO:6进行编号)：

Q258A；

Q287R；

Q352A；

Q356R；

Q258A+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

V212I；

H186A；

V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q485E+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

[实施例82]根据权利要求81所述的变体，其中这些变体选自与SEQ ID NO:26的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性并且包含取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)N468G+N493A+N710R+G724S+T731S+S732C+Q531E+L532F的普鲁兰酶，并且其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Q258A；

Q287R；

Q352A；

Q356R；

Q258A+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

V212I；

H186A；

V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q485E+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

[实施例83]根据实施例82所述的变体，其中这些变体进一步包含以下取代的组合之一：

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R。

[实施例84]根据实施例81所述的变体，其中这些变体选自与SEQ ID NO:27的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性并且包含取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)N468G+N493A+T492S,A+N710R+G724S+T731S+S732C+Q531E+L532F的普鲁兰酶，并且其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Q258A；

Q287R；

Q352A；

Q356R；

Q258A+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

V212I；

H186A；

V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+G296R+N322P+Q352A+Q356R+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q485E+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R；

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+V586A+D686S+E799R；

[实施例85]根据权利要求84所述的变体，其中这些变体进一步包含以下取代的组合之一：

N19G+Y27K+H79Y+H186A+V212I+Q258A+Q287R+N322P+Q352A+Q356R+Q487L+D686S+E799R。

[实施例83]根据实施例1-80中任一项所述的普鲁兰酶变体，其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Y27K+H79Y+Q187R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+E699R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+T486S+D586S+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q385E+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+H321E+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R。

[实施例87]根据权利要求86所述的变体，其中这些变体选自与SEQ ID NO:28的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性并且包含取代N368G+N393A+T492S,A+N610R+G624S+T631S+S632C+Q431E+L432F的普鲁兰酶，并且其中这些变体进一步包含以下取代或取代的组合之一：

Y27K+H79Y+Q187R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+D586S+E699R+S798R；

Y27K+H79Y+Q187R+T486S+D586S+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q385E+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+V196R+Q387L+Q459G+T486C+D586S+C632S+Q675L+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+H321E+Q387L+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+Q387L+D586S+C632S+E699R+S798R；

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+D586S+E699R+S798R；

[实施例88]根据实施例87所述的变体，其中这些变体进一步包含以下取代的组合之一：

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+D586S+E699R+S798R；或

N19G+Y27K+H79Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R。

[实施例89]一种用于产生亲本普鲁兰酶的变体普鲁兰酶的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置393、143、150、243、244、345、346、368、370、373、381、382、385、387、402、429、430、431、432、456、486、492、610、624、631、632、665以及699的一个或多个位置处取代该亲本普鲁兰酶，其中该变体具有普鲁兰酶活性；并且；

c)其中该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

d)其中该变体与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性；或

e)其中该变体与SEQ ID NO:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。

[实施例90]一种通过如实施例89所述的方法产生的变体普鲁兰酶。

[实施例91]一种组合物，该组合物包括如实施例1-90中任一项所述的变体普鲁兰酶。

[实施例92]根据实施例91所述的组合物，该组合物包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、以及蛋白酶。

[实施例93]根据实施例91和92中任一项所述的组合物，该组合物包括如实施例1-84中任一项所述的多肽的普鲁兰酶以及：i)葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶；ii)α-淀粉酶以及蛋白酶；iii)葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶；iv)β-淀粉酶；或v)葡糖淀粉酶。

[实施例94]如实施例1-90中任一项所述的变体普鲁兰酶用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物例如乙醇的用途。

[实施例95]根据实施例94所述的用途，其中该淀粉材料是经糊化或未经糊化的淀粉材料。

[实施例96]一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；

(b)在葡糖淀粉酶的存在下使液化材料糖化；并且

(c)用发酵生物进行发酵；其中在如实施例1-90中任一项所述的变体普鲁兰酶的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。

[实施例97]一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且

(b)用发酵生物进行发酵

其中使用至少葡糖淀粉酶以及如实施例1-90中任一项所述的变体普鲁兰酶进行步骤(a)。

[实施例98]根据实施例97所述的方法，其中在步骤(a)中添加α-淀粉酶。

[实施例99]根据实施例97所述的方法，其中同时进行糖化和发酵。

[实施例100]根据实施例96-99中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，特别是乙醇。

[实施例101]一种编码如实施例1-90中任一项所述的变体普鲁兰酶的多核苷酸。

[实施例102]一种包括如实施例101所述的多核苷酸的核酸构建体。

[实施例103]一种包括如实施例101所述的多核苷酸的表达载体。

[实施例104]一种包含如实施例101所述的多核苷酸的宿主细胞。

[实施例105]一种产生如实施例1-90中任一项所述的普鲁兰酶变体的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如实施例104所述的宿主细胞。

[实施例106]如实施例105所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

[实施例107]一种包括如实施例1-90中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。

通过以下实例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

材料和方法

糖谱和溶解的干固体的确定

通过HPLC确定淀粉水解物的糖组成并且将葡萄糖产率随后计算为DX。°通过测量折射率而确定淀粉水解物的溶解(可溶性)的干固体的BRIX(白利糖度)。

实例

实例1：普鲁兰酶文库的构建

将来自枯草芽孢杆菌菌株的、携带来自芽孢杆菌属NCIB11777(SEQ ID NO:7和8)、脱支芽孢杆菌NN18718(SEQ ID NO:4和5)以及杂合普鲁兰酶P8(SEQ ID NO:1和2)的普鲁兰酶基因的基因组DNA使用

组织试剂盒(

Tissue kit)[马歇雷-纳高公司(MACHEREY-NAGEL)]进行分离，该杂合普鲁兰酶是通过结合融合到衍生自从在丹麦收集的腐植质样品中分离的脱支芽孢杆菌菌株(来自脱支芽孢杆菌的同源普鲁兰酶披露于US 6,074,854和US 5,817,498中)的普鲁兰酶的C-末端片段的衍生自描述于WO 2009/075682中的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(SEQ ID NO:4在WO 2009/075682中；GENESEQP：AXB71624)的普鲁兰酶的N-末端片段而获得的杂合酶。使用引物F1和R1、引物F2和R2、以及引物F1和R2，在以下条件下，使用与表达载体具有15bp的重叠的引物从基因组DNA扩增普鲁兰酶基因，该表达载体包括用于芽孢杆菌属表达以及如WO 99/43835中所述的大肠杆菌扩增的遗传元件。

引物F1：ATGTATTATGGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGTCCCTAATACGTTCTAG(SEQ ID NO:10)

引物R1：TTATTGATTAACGCGTTTAATTTTGATCAATGACATC(SEQ ID NO:11)

引物F2：ATGTATTATGGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGGCTAAAAAACTAATTTATG(SEQ ID NO:12)

引物R2：TTATTGATTAACGCGTTTACTTTTTACCGTGGTCTG(SEQ ID NO:13)

Phusion聚合酶(赛默科技公司(thermo scientific))：总共20μl：1,0μl模版(100ng/μl)，4,8μl H₂O，4μl，Phusion HF缓冲液：1,6μl dNTP(2,5mM)：0,2μl反向引物(20μM)，0,4μl Phusion(2U/μl)，8,0μl正向突变引物(1μM)。PCR-程序：98℃/30sec，30x(98℃/10sec，60℃/20sec，72℃/3min)，72℃/5min，4℃/∞

将生成的PCR片段经

凝胶和PCR净化试剂盒[马歇雷-纳高公司(MACHEREY-NAGEL)]进行纯化并且通过In fusion克隆(Clontech公司)连接至载体。然后，将in fusion混合物引入大肠杆菌DH5α,Jet感受态大肠杆菌细胞，BDL中。证实生成的质粒具有所设计的序列并且命名为pGMM、pD2同源物和p008，并用作用于文库构建的模版。通过以下步骤构建所有文库。设计在一个或多个靶位点处具有NNK或一个或多个所希望的突变的反向或正向引物，这些靶位点彼此具有15bp的重叠，并且使用引物1F或2F和反向引物和正向引物和引物1R或2R，使用适当的模板(pGMM、pD’或p008)进行两个PCR。将生成的PCR片段经

凝胶和PCR净化试剂盒[马歇雷-纳高公司(MACHEREY-NAGEL)]进行纯化并且与用SacI和MluI以及in fusion混合物消化的表达载体混合以引入大肠杆菌中。将生成的大肠杆菌文库回收并且转化进枯草芽孢杆菌中，以构建具有如在表1a和表1b中所示的所希望的突变的芽孢杆菌属文库。

表1a：P008的热稳定性变体的取代(SEQ ID NO:3)

根据下表1b和1c，在SEQ ID NO:6中对在SEQ ID NO:3中显示出具有改进热活性效果的取代进行测试。表1c使用SEQ ID NO:3中的编号。

表1b：脱支芽孢杆菌普鲁兰酶的热稳定性变体的取代(D2同源物)(SEQ ID NO:6)根据SEQ ID NO:6进行位置编号。

变体编号	一个或多个取代
		P233	N468G
P234	N493A
		P235	A592S
P236	N710R
		P237	G724S
P238	T731S S732C
		P239	N710R G724S T731S S732C
P240	N468G N493A A592S
		P241	N468G N493A A592S N710R G724S T731S S732C

表1c：SEQ ID NO:6的变体使用根据SEQ ID NO:3的编号。

表1d：SEQ ID NO:16的变体(P258)

表1e：SEQ ID NO:17的变体(P243)

变体编号	关于SEQ ID NO:3的取代
		P252	N368G N393A N610R G624S T631S S632C
P303	N368G N393A N610R G624S T631S S632C Q431E L432F

为了测试当亲本酶的N-末端部分被来自其他普鲁兰酶的N-末端部分替换时，由在催化结构域中引入的取代所产生的改善的热活性是否可以维持，构建了以下杂合普鲁兰酶。

表2.通过用来自其他普鲁兰酶的等效部分替换N-末端部分来构建在催化结构域中具有取代的变体。不同N-末端结构域的起点由SEQ ID显示，并且对于CD，起点和特定取代均有指示。

*P265和P267携带位置492中的A，然而，该位置有助于所观察到的效果并且除非取代为S，否则不应被修饰。

实例2：P303的改进的变体的构建

普鲁兰酶变体，P303，被用作用于进一步变体选择的起始点，由此得出下表的特异性变体。

表3.

实例3：变体P287和P380的构建

起始自P202，描述于以上实例1中，引入三个另外的取代，N222P+Q252A+Q256R，以便产生P287。

因此，P287是包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+T492S+N610R+G624S+T631S+S632C的SEQ ID NO:3。

通过用来自P306的催化结构域替换P008的催化结构域来产生另一种变体，P380。P380作为SEQ ID NO:28被包括于此。

因此，P380具有如下所示的结构：

实例4：P380的改进的变体的构建

普鲁兰酶变体，P380，被用作用于进一步变体选择的起始点，由此得出下表的特异性变体。

表4.

实例5：普鲁兰酶测定

红色普鲁兰测定(麦格酶公司(Megazyme))

底物溶液

0.1g红色普鲁兰(麦格酶(megazyme)S-RPUL)

0.75ml 2M乙酸钠，pH 5.5

14.25ml H2O

将10μl的酶样品与80μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将50μl的乙醇添加至反应混合物并且在3500rpm下离心10min。

小心地取出上清液并且确定吸光度A510。

PAHBAH普鲁兰测定

底物溶液

0.15g BH4普鲁兰

25ml 50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5

PAHBAH溶液

0.0552g乙酸铋(III)

0.2g PAHBAH

0.5g酒石酸钠钾，四水化合物

10ml 500mM NaOH

将10μl的酶样品与110μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将40μl的PAHBAH溶液添加至反应混合物，在50℃下孵育另外的20min，并且确定吸光度A405。

里氏可溶性蜡质淀粉测定

底物溶液

0.2g里氏蜡状玉米淀粉

2.5ml 2M乙酸钠

97.5ml H₂O

将5μl的酶样品与100μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)下孵育20min。将100μl的0.15％I₂/1.5％KI溶液添加至反应混合物，并且确定吸光度A610。

PHADEBAS测定

底物溶液

1片PHADEBASα-淀粉酶片剂

5ml 50mM乙酸钠缓冲液，pH 5

40sec.微波炉高至沸腾

终止溶液

18％醋酸

测定方法

在96孔PCR管中酶反应

将10μl的酶样品与100μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将50μl的终止溶液添加至该反应混合物中并且在3500rpm下离心10分钟。小心地取出上清液并且读取在A600处的吸光度。

实例6：热活性的评价

将如在实例1中构建的芽孢杆菌属文库在220rpm、37℃下在96孔MTP中发酵，该MTP含有TB-gly培养基(13.3g/L BactoTM胰蛋白胨，26.6g/LBactoTM酵母提取物D，4.4g/L甘油)，该培养基含有6mg/L氯霉素，并且在若干温度下通过里氏可溶性淀粉测定和/或描述于实例2中的Phadebas测定测量普鲁兰酶活性。如表中所示，相比于亲本普鲁兰酶，普鲁兰酶变体的相对活性显示出更高的热活性。

实例7：芽孢杆菌属菌株的发酵

在220rpm、37℃下，在回转式摇床上的500ml带挡板烧瓶中发酵枯草芽孢杆菌菌株，这些烧瓶含有100ml TB-gly(添加有6mg/l氯霉素)。离心培养物(20000x g，20min)，并且小心地从沉淀慢慢倒出上清液。将上清液通过0.45μm过滤单元过滤以除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。

实例8：普鲁兰酶的纯化

通过β-环糊精亲和柱并且随后通过阴离子交换柱层析进行普鲁兰酶的纯化。纯化之后，将普鲁兰酶针对20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)进行透析并且浓缩。

实例9：酶热稳定性测量

将纯化的酶用50mM乙酸钠(pH 5.0或4.3)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将三十微升的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板96(LightCycler 480Multiwell Plate 96)(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics))并将板密封。

TSA的设备参数：

仪器：LightCycler 480实时PCR***(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))

扫描速率：0.02℃/sec

扫描范围：37℃-96℃

扫描速率：1.26℃/min

积分时间：0.5sec

激发波长465nm

发射波长580nm

将获得的荧光信号标准化进0和1的范围内。将解链温度(Tm)定义为标准化值最接近0.5时的温度。

实例10：温度活性测定

在55℃-77.5℃的范围内、pH 5.0下，通过描述于实例2中的PHADEBAS测定进行普鲁兰酶的活性测定。如下表所示，这些变体的最适温度高于亲本P008，在70℃-72.5℃左右。

实例11：N-末端部分被替换的催化结构域变体

在替换N-末端结构域之后，对在实例3中所描述的两个在催化结构域中具有取代的变体，P240和P265，进行测试。替换导致P256和P267。

将芽孢杆菌克隆在220rpm、37℃下在96孔MTP中发酵，该MTP含有TB-gly培养基(13.3g/L BactoTM胰蛋白胨，26.6g/L BactoTM酵母提取物D，4.4g/L甘油)，该培养基含有6mg/L氯霉素，并且在若干温度下通过描述于实例2中的Phadebas测定测量普鲁兰酶活性。如下表所示，相比于亲本普鲁兰酶，普鲁兰酶变体的相对活性显示出更高的热活性。

实例12：所选变体的相对活性

用稀释缓冲液将纯化的酶稀释至固定浓度。将10微升的酶溶液添加至110ul的预孵育的0.5％底物溶液(在60℃-75℃下，以5℃的间隔)中并且孵育30min。通过添加10ul的500mM NaOH使反应终止并且添加40ul的PAHBAH溶液。在55℃下孵育20min后，在A405处读取吸光度。

实例13：所选变体改进的比活性

使用描述于PAHBAH-普鲁兰测定的修改方法中的方法确定针对Pindex100(DE3)的比活性，该普鲁兰测定描述于在60℃和65℃下使用纯化的普鲁兰酶样品(2μg/ml)的实例2中。在本实验中使用的是Pindex100，而非使用普鲁兰。比活性列为与纯化商业产物

D2(Sigma E2412)活性的相对活性

实例14：所选普鲁兰酶变体的相对活性测量

在65℃-79℃的范围内、pH 5.0下，通过描述于实例2中的PHADEBAS测定进行所选普鲁兰酶变体的相对活性测量。结果示于以下表格中。

实例15：酶热稳定性测量(TSA)

如实例9中所述，确定作为溶解温度(Tm)测定的热稳定性。

TSA的设备参数：

扫描速率：0.02℃/sec

扫描范围：37℃-96℃

扫描速率：1.26℃/min

积分时间：0.5sec

激发波长465nm

发射波长580nm

将获得的荧光信号标准化进0和1的范围内。将解链温度(Tm)定义为标准化值最接近0.5时的温度。通过TSA进行Tm分析

实例16：所选变体的糖化测试

使用玉米淀粉从常规淀粉液化方法中制备右旋糖当量(DE)被调整至11的麦芽糊精，并且对于此实验，进行喷雾干燥。将麦芽糊精粉末溶解于热milliQ水中，并且在65℃下通过HCl/NaOH将pH调节至4.3，并且然后通过测量糖浆的屈光指数(RI)将固体调节至40％干固体(DS)。将糖浆在25ml玻璃瓶中进行，并且在65℃下通过添加含有纯化的葡糖淀粉酶JGA098和普鲁兰酶的2ml酶混合物而开始糖化，这样使得葡糖淀粉酶的终剂量是0.194AGU/gDS，并且普鲁兰酶的终剂量是5.3或10.7ug/gDS。在65℃搅拌下孵育样品并且在不同时间点进行取样。每次取样时，将0.75ml的糖浆在100℃下热灭活持续15min，并且然后用蒸馏水稀释6倍并在HPLC分析之前通过0.2μm尼龙注射器过滤器进行过滤。在85℃下，以0.5ml/min的流速，将20微升的糖浆样品施加到用蒸馏水平衡的HPX-87C柱(伯乐公司(Bio-Rad))上，并且在等度条件下将葡萄糖及其他低聚糖分级并且通过RI检测器进行检测。按在所检测的总面积中葡萄糖峰面积的百分比计算葡萄糖产率(％DX)。酶剂量和％DX相对于孵育时间示于下表中。

在不同时间点，糖浆的％DX。

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