CN105954514A - ***和伪狂犬病二联快速检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种***和伪狂犬病二联快速检测试纸条及其制备方法。该试纸条基于膜免疫层析的原理，采用胶体金双抗原夹心法来制备，以葡萄球菌A蛋白(SPA)为捕获抗原，以***病毒3ABC和伪狂犬病毒GE蛋白为检测抗原。在检测一份血清样品时，可同时诊断猪***和伪狂犬病的野毒感染。该试纸条操作便捷，不需要仪器设备，结果判读简单，能够满足基层组织、农户对于重大疫病诊断的需求，对猪***、伪狂犬病防控具有重要意义。

Description

***和伪狂犬病二联快速检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明总体涉及动物疫病快速诊断试纸条，具体涉及***和伪狂犬病二联快速检测试纸条。
背景技术
***(foot-and-mouth disease，FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病，猪、牛、羊等偶蹄类动物最易感。猪***的发病率高，传播迅速，可造成母猪流产、仔猪大批死亡，带来严重的经济损失。我国对***采取强制免疫策略，每年都会使用大量的灭活疫苗，并监测疫苗免疫效果，提高动物临床抗体水平。如何区分疫苗免疫动物和野毒感染动物成为影响***防控的关键。在***疫苗生产过程中，3ABC非结构蛋白会被除去，因此动物接种***疫苗不产生3ABC抗体。因此，检测3ABC蛋白抗体，可作为诊断野毒感染的重要指标。
伪狂犬病(Pseudorabies virus，PRV)是一种猪的急性传染病，主要侵害生殖***，可导致母猪***、流产、死胎，哺乳仔猪大量死亡，对成年育肥猪猪可引起生长停滞、增重缓慢等，是危害养猪业的重大传染病之一。疫苗免疫接种是防控伪狂犬病的重要措施。目前，可用的伪狂犬疫苗均为弱毒活疫苗，能否鉴别免疫动物和野毒感染动物是伪狂犬病净化的关键。通过基因工程技术构建缺失GE蛋白基因的伪狂犬病毒突变株，所制备的疫苗接种动物，不会诱导产生GE蛋白抗体。所以，通过检测GE蛋白抗体，可以精确区分伪狂犬疫苗免疫猪群和野毒感染猪群。
随着生物技术的发展，目前市面上已经有猪***3ABC和伪狂犬病GE抗体检测试剂盒，但主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法。ELISA操作繁琐，耗时较长，而且需要仪器，不利于临床实地的疾病诊断。之后出现了一种类似专利CN103792373A的胶体金快速检测卡，但是只能单一诊断伪狂犬病野毒感染。猪***、伪狂犬病对怀孕母猪和仔猪危害大，严重破坏养猪业可持续发展，研制快速、多联的疾病诊断技术具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种动物疫病快速诊断试纸条及其制备方法，该试纸条可同时诊断猪***和伪狂犬病的野毒感染。
本发明通过以下技术方案实现：该试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫；其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸；在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫；在包被膜上设有检测线I、检测线II和质控线，检测线I包被***病毒3ABC蛋白，检测线II包被伪狂犬病毒GE蛋白，质控线包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体；玻璃纤维膜上喷涂有葡萄球菌A蛋白(SPA)胶体金颗粒标记偶联物。
本发明试纸条应用双抗原夹心法，当被检样品中含有3ABC或GE抗体时，则在样品垫处与SPA蛋白结合，形成“SPA抗原-抗体复合物”，并在吸水纸的作用下向前渗透泳动。当复合物到达检测线I，3ABC抗体与***病毒3ABC蛋白发生特异性结合，形成“SPA抗原-3ABC抗体-3ABC抗原复合物”，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线II，GE抗体与伪狂犬病毒GE蛋白发生特异性结合，形成“SPA抗原-GE抗体-GE抗原复合物”，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当被检样品中不含3ABC和GE抗体时，胶体金标记的SPA泳动至质控线，与兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体结合，在包被膜上出现肉眼可见的色带。检测时，吸取待检血清样品1滴，滴到样品垫上，观察检测线I、II和质控线是否出现红色色带，从而判定动物是否被***、伪狂犬野毒感染。
本发明的积极效果是：
1、本发明操作便捷，不需要仪器设备，结果判读简单。在检测一份血清样品时，可同时诊断猪***和伪狂犬病野毒感染。能够满足基层组织、农户对于重大疫病诊断的需求。
2、本发明采用双抗原夹心法，不受样品的宿主来源限制，除了诊断猪***和伪狂犬病野毒感染，还可用于多种动物***野毒感染的鉴别诊断。
3、本发明将免疫层析法与胶体金技术相结合，研制出快速诊断试纸条。相对于ELISA，试纸条原辅料更为简单，成本低，有益于推广应用。
附图说明
图1为本发明试纸条的侧面结构示意图。图中1：底板；2：包被膜；3：玻璃纤维膜；4：吸水纸；5：样品垫。
图2为图1的正面结构示意图。图中6：检测线I；7：检测线II；8：质控线。
图3为***野毒感染阳性和伪狂犬野毒感染阳性结果示意图。包被膜2上的检测线I6、检测线II7和质控线8均出现红色色带。
图4为***野毒感染阳性和伪狂犬野毒感染阴性结果示意图。包被膜2上的检测线I6和质控线8均出现红色色带，检测线II7不出现红色色带。
图5为伪狂犬野毒感染阳性和***野毒感染阴性结果示意图。包被膜2上的检测线II7和质控线8均出现红色色带，检测线I6不出现红色色带。
图6为***野毒感染阴性和伪狂犬野毒感染阴性结果示意图。包被膜2上的质控线8出现红色色带，检测线I6和检测线II7均不出现红色色带。
图7为本发明检测无效结果示意图。包被膜2上的质控线8、检测线I6和检测线II7均不出现红色色带。
图8为本发明检测无效结果示意图。包被膜2上的质控线8不出现红色色带，检测线I6和检测线II7出现红色色带。
图9为本发明检测无效结果示意图。包被膜2上的质控线8和检测线I6均不出现红色色带，检测线II7出现红色色带。
图10为本发明检测无效结果示意图。包被膜2上的质控线8和检测线II7均不出现红色色带，检测线I6出现红色色带。
具体实施方式
下面结合附图具体介绍本发明的***和伪狂犬病二联快速检测试纸条及其制备方法。本领域技术人员应该理解，下面描述的实施例只是为了更好地理解本发明，并不用来限制本发明。
如图1所示，根据本发明的***和伪狂犬病二联快速检测试纸条包括底板1、包被膜2、玻璃纤维膜3、吸水纸4以及样品垫5。其中，包被膜2粘贴在底板1上面，包被膜2正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜3和吸水纸4。在玻璃纤维膜3远离吸水纸4的一端的正面粘贴样品垫5。底板1通常为PVC材质，包被膜2为硝酸纤维素膜(NC膜)。在玻璃纤维膜3上涂覆有胶体金标记SPA蛋白。
如图2所示，在包被膜2上设有检测线I6、检测线II7和质控线8。检测线I6包被***病毒3ABC蛋白，检测线II7包被伪狂犬病毒GE蛋白，质控线8包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体。所述检测线I6、检测线II7和质控线8在包被膜2上呈3条线平行排列，依据检测线I6、检测线II7和质控线8是否出现红色色带来进行结果判定。
下述实施例中的主要原材料来源为：***病毒3ABC蛋白、伪狂犬病毒GE蛋白由郑州中道生物技术有限公司制备。其它试剂和材料均可来源于商业途径。所述的实验方法，若无特别说明，均为常规实验方法。
本发明所述试纸条采用3条带显色的胶体金免疫层析法制备，显示条带为红色色带，具体制备方法如下：
1.1包被膜2的制备
在硝酸纤维素膜上分别喷涂***病毒3ABC蛋白、伪狂犬病毒GE蛋白和兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体，并呈3条线平行排列，分组组成检测线I6、检测线II7和质控线8。37℃烘干处理2小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。
检测线I6：调试喷膜仪，喷液量为1ul/cm，用包被缓冲液稀释***病毒3ABC蛋白，浓度为2.5mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
检测线II7：调试喷膜仪，喷液量为1ul/cm，用包被缓冲液稀释伪狂犬病毒GE蛋白，浓度为3.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
质控线8：调试喷膜仪，喷液量为1ul/cm，用包被缓冲液稀释兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体，浓度为1mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
所述包被缓冲液配方：称取牛血清白蛋白0.01g，十二水合磷酸氢二钠30.072g，磷酸二氢钾2.176g，用超纯水溶解，并定容至1000mL。
包被膜2上所划3条线应细致均匀，相邻两线间隔0.4-1.0cm。
1.2玻璃纤维膜3的制备
(1)胶体金溶液的制备
将双蒸水置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入浓度为1％的氯金酸溶液至终浓度为0.02％。煮沸5分钟，之后加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，加样体积为氯金酸溶液的1.8倍。煮沸10分钟后，冷却至室温，再用双蒸水调整氯金酸浓度为0.02％，常温避光保存备用。
(2)胶体金标记SPA玻璃纤维膜3的制备
用5M碳酸钾调节胶体金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗体/mL胶体金溶液的比例加入SPA蛋白，混匀后静置5分钟。再按5％体积的量加入10％牛血清白蛋白溶液，混匀后静置5分钟。10000rpm离心30分钟，弃去上清，用标记洗涤液洗涤1次。沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液铺10cm2的量喷涂于玻璃纤维膜3上。真空干燥3小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。
所述10％牛血清白蛋白溶液：取牛血清白蛋白100g，用双蒸水定容至1000mL。
所述标记洗涤液：取牛血清白蛋白4g，聚乙二醇80002g，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.211g，用双蒸水定容至1000mL，并调节PH至8.1。
所述金标蛋白保存液：取牛血清白蛋白25g，聚乙二醇80005g，Tris 10.2g，氢氧化钠2.5g，吐温207.5mL，用双蒸水定容至1000mL，并调节PH至8.5。
1.3大板组条
各组份规格(长×宽)：底板1(30cm×7.6cm)、包被膜2(30cm×2.0cm)、样品垫5(30cm×3.0cm)、涂覆胶体金标记SPA蛋白的玻璃纤维膜3(30cm×0.7cm)和吸水纸4(30cm×3.2cm)。
各层的组合方式如下：将包被膜2粘贴在底板1上面，包被膜2正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜3和吸水纸4。在玻璃纤维膜3远离吸水纸4的一端的正面粘贴样品垫5。即在底板1上按顺序依次粘贴包被膜2、玻璃纤维膜3、吸水纸4、样品垫5。
1.4切条
用切条机将大板切成单条，每条宽度为3-5cm。
下面再详细描述本发明的试纸条检测原理和结果判定。
2.1试纸条检测原理
本发明试纸条应用双抗原夹心法，用SPA蛋白作为捕获抗原，用***病毒3ABC和伪狂犬病毒GE蛋白作为检测抗原。其原理是当被检样品中含有3ABC或GE抗体时，则在样品垫5处与SPA蛋白结合，形成“SPA抗原-抗体复合物”，并在吸水纸4的作用下向前渗透泳动。当复合物到达检测线16，3ABC抗体与***病毒3ABC蛋白发生特异性结合，形成“SPA抗原-3ABC抗体-3ABC抗原复合物”，在包被膜2上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线117，GE抗体与伪狂犬病毒GE蛋白发生特异性结合，形成“SPA抗原-GE抗体-GE抗原复合物”，在NC膜上出现肉眼可见的色带。当溶液泳动至质控线8，与兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体结合，在包被膜2上出现肉眼可见的色带。检测时，吸取待检血清样品1滴，滴到样品垫5上，观察检测线I6、II7和质控线8是否出现红色色带，从而判定动物是否被***、伪狂犬病野毒感染。
2.2试纸条结果判定
下面结合附图，具体介绍本发明试纸条的结果判定标准。
如图3所示，包被膜2上的检测线I6、检测线II7和质控线8均出现红色色带，则***和伪狂犬病均为野毒感染阳性。
如图4所示，包被膜2上的检测线I6和质控线8均出现红色色带，检测线II7不出现红色色带，则***野毒感染阳性，而伪狂犬病野毒感染阴性。
如图5所示，包被膜2上的检测线II7和质控线8均出现红色色带，检测线I6不出现红色色带，则***野毒感染阳性和伪狂犬病野毒感染阴性。
如图6所示，包被膜2上的质控线8出现红色色带，检测线I6和检测线II7均不出现红色色带，则***和伪狂犬病均为野毒感染阴性；
当出现以下几种情况时，检测结果无效：包被膜2上的质控线8、检测线I6和检测线II7均不出现红色色带(图7)；包被膜2上的质控线8不出现红色色带，检测线I6和检测线II7出现红色色带(图8)；包被膜2上的质控线8和检测线I6不出现红色色带，检测线II7出现红色色带(图9)；包被膜2上的质控线8和检测线II7不出现红色色带，检测线I6出现红色色带(图10)。

Claims (3)

1.一种***和伪狂犬病二联快速检测试纸条，该试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫；
其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸；在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫；在包被膜上设有检测线I、检测线II和质控线，检测线I包被***病毒3ABC蛋白，检测线II包被伪狂犬病毒GE蛋白，质控线包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体；玻璃纤维膜上喷涂有葡萄球菌A蛋白胶体金颗粒标记偶联物。
2.根据权利要求1所述的***和伪狂犬病二联快速检测试纸条，其中检测线I、检测线II和质控线三条线呈平行布置，相邻两线间隔0.4-1.0cm。
3.一种***和伪狂犬病二联快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)将***病毒3ABC蛋白、伪狂犬病毒GE蛋白、兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗体分别用包被缓冲液稀释后形成浓度为1.0-3.0mg/mL的喷涂液；用喷膜仪在包被膜上分别喷涂划线相应喷涂液，形成检测线I、检测线II和质控线；
(2)将双蒸水置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入氯金酸溶液；煮沸之后加入柠檬酸三钠溶液，加样体积为氯金酸溶液的1.5-3倍；煮沸10-30分钟后，冷却至室温形成胶体金溶液；
(3)用碳酸钾调节胶体金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗体/mL胶体金溶液的比例加入SPA蛋白，混匀后静置；再按5％体积的量加入10％牛血清白蛋白溶液，混匀后静置；离心弃去上清，用标记洗涤液洗涤；沉淀物用十分之一初始胶体金溶液体积的金标蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液铺10-15cm2的量喷涂于玻璃纤维膜上，真空干燥后备用；
(4)将步骤(1)中制成的包被膜粘贴在底板上面，再将步骤(3)中制成的玻璃纤维膜粘贴在包被膜的一端，将吸水纸粘贴在包被膜的另一端，在玻璃纤维膜远离吸水纸的一端的正面粘贴样品垫；
(5)用切条机将步骤(4)中制成的大板切成宽度为3-5cm的单条，形成***和伪狂犬病二联快速检测试纸条。
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