CN105950705B - 一组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

一组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物检测、神经退行性病变技术领域，本发明提供了一组阿尔兹海默病早期诊断或筛查的分子标记物，所述的分子标记物是miR‑101‑3p、miR‑144‑5p和let‑7g‑5p。本发明还提供了这组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，以及一种无创性、特异性、高灵敏度的对阿尔兹海默氏症进行早期诊断及筛查的试剂盒和检测方法。

Description

一组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂 盒中的应用
技术领域
本发明涉及医学生物检测、神经退行性病变技术领域，尤其涉及一组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，该组microRNAs具体为miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p，本发明还涉及一种无创性、特异性、高灵敏度的对阿尔兹海默氏症进行早期诊断及筛查的试剂盒和检测方法。
背景技术
阿尔兹海默病(AD)是一种神经退行性病变相关的疾病，约占老年人痴呆病例中50-60％。AD主要的临床表现为记忆和其他认知功能的缺失。通常，AD患者会遭受10年或更长时间的病程，最终死于无助的状态。AD这么长的持续患病时间给AD患者，家庭，社会带来了经济和心理上的负担。AD据统计在2010年就花费了6040亿美元。另有统计显示65岁以上人群中有5％的人患AD，80岁以上人群中有超过20％的人患AD，90岁以上人群中超过1/3的人患AD，而且随着现代的人的生命期望值越来越高，AD将会变成更加流行的一种老年类疾病，到2050年，全世界将会有超过1.15亿的AD患者。AD代表的是一种主要的并且日益严重的公共健康问题，所以很必要去发现AD新的病理机制为AD患者提供新的治疗靶点，并且为AD的早期诊断和病程预测确定一个新的检测指标(World Health Organization.Dementia:aPublic Health Priority World Health Organization,Geneva,2012)。
而目前，AD诊断唯一的金标准是脑组织中淀粉样蛋白Aβ的沉积。但是，这一过程需要有创性的脑活检才能实现。
MicroRNA(miRNA)是由21-25个核苷酸构成的分子，MicroRNA通过抑制其靶分子mRNA的翻译或者促进其降解而起到负性基因表达调控作用。随着近年研究的不断深入，人们发现血清中大部分微小RNA分子存在于外泌体中并且可以通过外泌体途径释放入血，并且可以稳定存在，利于检测，这就有可能使血清外泌体中的miRNA成为一种新型无创性诊断分子。与传统 的活检相比，微创(抽血)或无创(使用尿液或唾液)诊断方法减少了患者的痛苦和不便，也降低了分析成本。近两年，多个研究团队对血液、尿液和唾液中的exosome进行研究，发现了多种疾病的生物标志物，有望指导疾病的个性化治疗(Lorea Manterola,Elizabeth Guruceaga,et al.A small noncoding RNA signature found in exosomesof GBM patient serum as a diagnostic tool.Neuro-Oncology.2014；0,1–8)。
MicroRNA与阿尔兹海默氏症的研究越来越多，但目前尚无有报道研究利用血清外泌体中的一组miRNAs(miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p)从而替代AD诊断的金标准淀粉样蛋白Aβ的水平从而实现对阿尔兹海默氏症(AD)进行早期诊断。
发明内容
本发明的目的在于寻找到能够有效用于阿尔兹海默病早期诊断和筛查的一组特异性分子标记物。本发明的另一目的在于提供一组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。本发明的第三目的在于提供一种早期检测阿尔兹海默氏症的检测方法。
本发明为了解决有创性的阿尔兹海默氏症诊断的金标准的瓶颈，且能在正常人患病之前做出风险评估和防治策略，本发明利用血清外泌体中的microRNAs特异性强、灵敏度高，且在血清中稳定存在利于检测从而作为阿尔兹海默氏症早期诊断的生物标志物。
本发明的第一方面，提供了一组阿尔兹海默病早期诊断或筛查的分子标记物，所述的分子标记物是miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p。
miR-101-3p：uacaguacugugauaacugaa(SEQ ID NO:1)
miR-144-5p：ggauaucaucauauacuguaag(SEQ ID NO:2)
let-7g-5p：ugagguaguaguuuguacaguu(SEQ ID NO:3)
本发明通过研究阿尔兹海默氏症的发病机理，寻找可以替代诊断金标准淀粉样蛋白Aβ水平的miRNAs，并验证了脑组织中的miRNAs通过外泌体途径释放进入外周血中，最终通过检测血清外泌体中的microRNAs(miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p)从而是实现AD的早期诊断和早期筛查。
本发明通过查找AD脑组织的microRNA表达谱芯片结果、生物信息学 预测AD相关致病基因(APP、APOE等)的直接靶向microRNA两种策略综合分析，筛选一批AD患者相关的microRNA作为候选研究基因。
本发明在体外验证了Aβ与miRNAs之间的相关性，从而证明我们筛选出的一组miRNAs(miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p)确实可以替代脑组织中的淀粉样蛋白Aβ水平。首先我们选用人神经***来源的细胞株添加Aβ刺激作为体外模型，发现APP等Aβ生成基因的mRNA显著上调。而3条候选microRNA均呈现明显下调，二者存在良好负相关性。但是，microRNA和这些靶基因究竟谁调控谁呢？于是，我们首先通过瞬时转染细胞进行了miRNA的过表达和干扰研究，发现三条候选microRNA均可以引起Aβ生成基因的反向变化。但是，当我们过表达Aβ生成基因3’UTR时，发现APP，BACE1。也可以引起miRNAs的显著下调，于是我们进一步进行了miRNAs的半衰期分析，证实的确可以促进miRNAs的降解。这就提示我们，Aβ生成基因也可以反向调控miRNAs的表达丰度。因此，我们初步提出了miRNAs与Aβ之间的负向调控机制。miRNAs可以结合Aβ生成基因的mRNA，促进mRNA降解，但是如果miRNAs发生下调。这种抑制作用就会消失，最终导致Aβ生成与沉积增多。而Aβ增多时，又会促进BACE1,APP的转录，它们又可以反过来结合microRNAs，并促进其降解。这样miRNAs与Aβ有着良好的负相关性因此可以替代Aβ的水平从而有可能成为阿尔兹海默氏症早期诊断的生物标志物。
本发明的第二方面，提供了一组microRNAs在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，所述的一组microRNAs是miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p。
所述的诊断试剂，为检测生物样品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的试剂的组合。
所述的诊断试剂盒，包含了检测生物样品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的试剂。
所述的检测生物样品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的试剂，选自：对miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p具有检测特异性的PCR引物。
较优的，miRNA逆转录和实时定量PCR检测引物序列如下：
miRNA逆转录引物：
miR-101-3p：AAATATGCGGCCGCTCATG(SEQ ID NO:4)
miR-144-5p：AAATATGCGGCCGCCGAGA(SEQ ID NO:5)
let-7g-5p：AAATATGCGGCCGCAATTT(SEQ ID NO:6)
实时定量PCR检测引物：
miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID NO:8)
let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
通用实时定量PCR引物:TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID NO:10)
所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、***固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。较优的为血浆或血清。
本发明的第三方面，提供了一种阿尔兹海默氏症的诊断试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中miR-101-3p的含量的试剂、miR-144-5p的含量的试剂和let-7g-5p的含量的试剂。
本发明所述的阿尔兹海默氏症的诊断试剂盒，是由反转录***、引物***和扩增***组成，所述的引物***包括：
通用实时定量PCR引物如SEQ ID NO:10所示；
miR-101-3p实时定量PCR引物如SEQ ID NO:7所示；
miR-144-5p实时定量PCR引物如SEQ ID NO:8所示；
let-7g-5p实时定量PCR引物如SEQ ID NO:9所示。
所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、***固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。较优的为血浆或血清。
本发明的第四方面，提供了一种利用上述诊断试剂盒进行阿尔兹海默氏症的检测方法，所述的检测方法为：按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，经异丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血浆中的小RNA；由反转录***反转录小RNA成cDNA；用扩增***进行Real-time PCR扩增，测定miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量。
本发明通过对100例不同年龄的正常人血样进行了检测，证实我们的3条microRNA有随年龄逐渐下调的趋势。
本发明又在正常小鼠上进行了验证，通过miRNA荧光原位杂交，我们首先发现小鼠脑组织中的miRNA随年龄逐渐下调。而与此同时，Aβ蛋白水 平随年龄上调。但在正常小鼠心、肺组织中，这些microRNAs随年龄变化趋势不明显，这提示这些microRNA下调具有组织特异性。
随后，本发明又在了小鼠外周血的外泌体进行了microRNA的检测，发现其与脑组中的miRNA有着同样的变化趋势，所以我们可以看出在正常人和小鼠的外周血中miRNA都有随年龄逐渐下调的趋势。
本发明提供了一种可以无创性的、特异性强、高灵敏度的对阿尔兹海默氏症进行早期诊断的方法。该方法主要通过对50例AD患者的血清样本进行诊断鉴别从而证明由这一组miRNAs构成的试剂盒的诊断效能及临床应用价值。
本发明的miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p这三个分子联合检测敏感性及特异性均高于单个分子单独检测(图3)。
本发明通过检测血浆或血清中的miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p含量的变化，可以对阿尔兹海默氏症进行早期诊断和筛查，以便尽早进行临床干预，防止病情进展。本发明为早期诊断阿尔兹海默氏症、评估正常人患阿尔兹海默氏症的风险提供了新的手段。
附图说明
图1：通过高通量测序及生物信息学分析对脑组织及外周血中miRNA进行筛选，其中A:为利用GEO数据库的AD患者脑组织和外周血的高通量测序数据进行生物信息学分析，筛选了15条共同下调的miRNAs；B:通过生物信息学分析软件miRanda预测靶向Aβ生成基因的miRNAs及它们之间的结合位点；C:通过二者取交集，筛选出3条miRNA作为候选研究对象，这些miRNA既在AD中是下调的，又同时可以靶向Aβ生成基因。
图2：在体外验证Aβ与miRNAs的相关性及机制分析，其中A:人神经***来源的细胞株添加Aβ5uM刺激作为体外模型,HSA作为对照，发现APP等Aβ生成基因的mRNA显著上调，而3条候选microRNA均呈现明显下调，二者存在良好负相关性；B:通过瞬时转染细胞进行了miRNA的过表达和干扰研究，发现三条候选microRNA均可以引起Aβ生成基因的反向变化；C:通过过表达Aβ生成基因3’UTR时，发现APP，BACE1,也可以引起miRNAs的显著下调，于是我们进一步通过鹅膏覃碱处理抑制体内转录进行了miRNA的半衰期分析，这些基因的3’UTR证实的确可以促进miRNA的降解；这就提示我们，Aβ生成基因也可以反向调控miRNA的表达丰度。
图3：外周血exo-miRNAs对AD的诊断价值，荧光定量PCR 3条microRNA在AD患者血清中均出现下调；ROC诊断模型中，3条miRNA联合诊断时，诊断效能可以达到0.88。
图4：外周血Exo-microRNA随年龄的改变，其中A:通过荧光定量PCR对100例不同年龄的正常人血样进行了检测，证实我们的3条microRNA确实有随年龄下调的趋势；B:通过荧光原位杂交，我们将正常小鼠按照月龄分成5个年龄段，结果表明小鼠脑组织中的miRNAs随年龄逐渐下调；C:正常小鼠心、肺组织中的microRNA随年龄变化趋势不明显，这提示这些microRNA下调具有组织特异性。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：
通过高通量测序及生物信息学分析对脑组织及外周血中miRNA进行筛选通过对PUBMED中GEO数据库：GSE48552、GSE46579、GSE46131高通量测序数据进行分析筛选出在AD患者脑组织和外周血中15条共同下调的miRNAs,如图1A所示。
然后通过microRNA与RNA相互结合分析软件miRanda可以从如下网址下载：http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do。下载后按照网站提供的软件使用说明使用，具体的，我们将目前广泛的AD致病基因(APP、PSEN1/2、APOE BACE1等)的mRNA序列导入分析软件，分析其与软件所收录的所有人的microRNA的相互结合情况，我们采用Score Threshold:140的条件控制指标，得到了与AD致病基因可能有结合的所有miRNA，如图 1B所示。
通过二者取交集，筛选出3条miRNA作为候选研究对象，这些miRNA既在AD中是下调的，又同时可以靶向Aβ生成基因，如图1C所示。最终筛选出来的3条miRNA(miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p)作为候选研究AD诊断的检测标志物。
实施例2：在体外验证Aβ与miRNAs的相关性及机制分析
1、人神经***来源细胞系SHSY-5Y细胞培养
人神经***来源的神经母细胞瘤细胞(SHSY-5Y，购自中科院细胞所)培养于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱静置培养。
2、在AD的体外模型中Aβ与miRNA呈现出良好的负相关性
当细胞密度达到约70％，对SHSY-5Y细胞添加Aβ肽(Bachem，Torrance CA)5uM刺激作为体外AD模型，模拟体内环境，同浓度的人血清白蛋白(HAS)作为阳性阴性对照。
48h后收集细胞抽提RNA后逆转录诚cDNA后进行qRT-PCR检测。结果如图2A所示在转染过Aβ肽的细胞中，Aβ的生成基因与miRNA呈现出良好的负相关性，Aβ的生成基因表达增加，miRNA表达降低。
3、当细胞密度达到约50％，利用Lipofectamine2000试剂(美国Invitrogene公司)，按照转染试剂说明书的步骤和试剂比例，在SHSY-5Y细胞中转入miRNA的mimics，结果如图2B所示，Aβ的生成基因发生明显的下调。
4、当细胞密度达到约50％，利用Lipofectamine2000试剂(美国Invitrogene公司)，按照转染试剂说明书的步骤和试剂比例，在SHSY-5Y细胞中转入Aβ的生成基因的3'UTR，结果如图2C所示，3条miRNA均发生明显的下调。
U6的引物：
P1:GTAACCCGTTGAACCCCATT(SEQ ID NO:11)
P2:CCATCCAATCGGTAGTAGCG(SEQ ID NO:12)
PCR产物：200bp。退火温度：55℃
miRNA的引物如下：
miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID NO:8)
let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
通用实时定量PCR引物:TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID NO:10)
PCR产物：135bp。退火温度：55℃
5、合成引物及构建pcDNA3.1-APP 3'UTR真核表达载体
(1)设计引物
APP 3'UTR XhoIF:
5'CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC 3'(SEQ ID NO:13)APP 3'UTR NotIR:
5'ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG 3'(SEQ ID NO:14)
酶切位点为XhoI和NotI,分别加入引物的5’端，并加入酶切位点的保护碱基。
(2)PCR扩增目的片段
在0.2mL EP管中配制以下体系，基因组DNA模板原液稀释20倍后取0.5μL扩增F11R：
取5μlPCR产物，做1％琼脂糖凝胶电泳(含EB 0.5μg/ml；电压：80V)鉴
定；其余用于回收、纯化目的片段。
(3)回收纯化目的片段
PCR产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取含目的基因片段的凝胶条带至干净1.5mlOD管中，称重后，按100mg凝胶对应100μL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12 000rpm离心1min，弃滤液。向柱上加入500μL溶液PE，室温12000rpm离心1min，弃滤液。重复上一操作一次。室温空柱12000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。将柱子置于新的1.5mL EP管上，向柱中央加入30μL 60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA。
(4)重组质粒的鉴定及保存
分别回收、纯化经XhoI和NotI双酶切后的载体片段和目的片段。所得DNA各自溶于30μl ddH2O中，1％琼脂糖凝胶电泳(含EB 0.5μg/ml；电压：80V)鉴定，-20℃保存。
用T4DNA连接酶重组连接酶切后的载体片段和目的片段，形成pcDNA3.1–APP 3'UTR重组质粒。用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序，测序正确。
转化步骤如下：
用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟。每管加800μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到氨苄抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。
将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，16小时。长出的克隆进行后续PCR鉴定。
6、pcDNA3.1–APP 3'UTR感染人人神经***来源细胞系SHSY-5Y。
实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种5×104个目的细胞于12孔培养板中，所加培养基体积为0.5ml。待细胞生长至60-70％时准备进行pcDNA3.1-APP 3'UTR和pcDNA3.1-NC转染。
转染步骤如下：
取97ulDMEM到1ml OD管中，加入3ul fugen-6到DMEM中，用加样枪混匀或拿手指轻轻弹动，之后室温放置5分钟。同时去1微克质粒加入到总体积100微升的DMEM中，轻轻混匀，静置5分钟。5分钟后，将两种液体用枪混匀，室温放置30分钟。30分钟后用100ul枪吸出反应液，均匀的 滴入12孔板中，轻轻拍打，放入培养箱。培养过夜后，第二天早上换正常培养基，继续培养并用G418筛选阳性克隆。
实施例3：外周血exo-miRNAs对AD的诊断价值
50例AD患者的病例资料如下表所示。
50例AD患者及年龄匹配健康人基本信息
**P＜0.01compared to controls
50例AD患者及年龄匹配健康人基本信息，通过同年龄匹配的人作为对照，对照与患者之间除了MMSE分数(精神状态评分)其余指标都没有统计学差异。
用SBI公司的EXOQ5A-1血清外泌体提纯试剂盒对AD患者血清中的外泌体进行纯化，后对外泌体中的miRNA进行提取,通过荧光定量PCR对50例AD患者及年龄匹配健康人的血清外泌体中3条microRNA进行检测
具体方法如下：
1)按照SBI公司EXOQ5A-1血清外泌体提纯试剂盒的标准说明书对血清中的外泌体进行纯化，后对其中的miRNA进行提取。
2)实时PCR检测的AD患者及年龄匹配健康人的血清外泌体中3条microRNA表达量。
(1)抽提不同样本血清外泌体中的总RNA，逆转录为cDNA。
(2)设计引物，检测3条miRNA表达水平。U6作为检测用内参。
引物序列如下：
U6的引物：
P1:GTAACCCGTTGAACCCCATT(SEQ ID NO:11)
P2:CCATCCAATCGGTAGTAGCG(SEQ ID NO:12)
PCR产物：200bp。退火温度：55℃
miRNA的引物如下：
miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID NO:8)
let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
通用实时定量PCR引物:TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID NO:10)
PCR产物：135bp。退火温度：55℃
荧光定量PCR体系如下：
PCR反应步骤：
PCR产物含量计算采用比较Ct值法进行相对定量。比较Ct值法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。
定义：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内标
ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内标)已处理-(Ct目的基因-Ct内标)未处理
RQ＝2-ΔΔCt
利用EXCEL里面的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。将第3天、5天和7天分别和第1天进行比较，进行T检验分析。如图3所示。
实验结果表明，通过同年龄匹配的正常人作为对照，可以看出AD患者血清外泌体中的miRNA均发生明显下调，通过ROC模型看出，当3条miRNAs同时做为AD诊断标志物的时候诊断效能最高。
实施例4：外周血Exo-microRNA随年龄的改变
首先对100例不同年龄段的正常人的血清外泌体中的miRNA按上述方法进行检测，结果如图4A所示，可以发现正常人血清外泌体中的miRNAs随着年龄表达量逐渐降低。
而后我们在小鼠的脑组织和血清外泌体也进行了miRNA的检测，动物实验接近临床试验，结果如图4B所示。同时我们也对小鼠的其他器官进行了miRNA的检测，结果如图4C所示，可以看出随着小鼠月龄的增加，miRNA并没有表现出一个很明显的变化趋势，这就提示小鼠脑组织和血清外泌体中的miRNA随年龄的变化是具有组织特异性的。
实验所用小鼠C57品系，SPF级。体重约15～45g，1-9月龄均有，购自上海实验动物中心。共30只小鼠，分5组，每组6只。
小鼠脑组织中miRNA的荧光原位杂交实验，探针为自己体外转录合成。
具体方法如下：
1)探针变性
将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
2)标本变性
①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。
②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。
3)杂交
将已变性或预退火的DNA探针10μL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15～17h)。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持 标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4)洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
(1)杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。(2)将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
(3)在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
(4)在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
(5)取出玻片，自然干燥。
(6)取200μL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5)杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针)
(1)在玻片的杂交部位加150μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
(2)去掉保鲜膜，再加150μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
(3)取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
(4)在玻片标本的杂交部位加150μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。
(5)去掉保鲜膜，加150μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。
(6)取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
(7)重复步骤(1)、(2)、(3)，再于2×SSC中室温清洗一下。
(8)取出玻片，自然干燥。
(9)取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
6)封片
可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用)，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
7)荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞***相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。结果如图4B所示随着小鼠月龄增加，绿色荧光强度越来越弱，提示miRNA表达水平下调。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一组阿尔兹海默病早期诊断或筛查的分子标记物，所述的分子标记物是miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p。
2.一组microRNAs检测试剂在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，所述的一组microRNAs是miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p。
3.根据权利要求2所述的一组microRNAs检测试剂在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂为检测生物样品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的试剂的组合。
4.根据权利要求2所述的一组microRNAs检测试剂在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂盒包含了检测生物样品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的试剂。
5.根据权利要求3或4所述的一组microRNAs检测试剂在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的试剂为对miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p具有检测特异性的PCR引物。
6.根据权利要求5所述的一组microRNAs检测试剂在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，所述的引物序列如下：
miRNA逆转录引物：
miR-101-3p：AAATATGCGGCCGCTCATG(SEQ ID NO:4)
miR-144-5p：AAATATGCGGCCGCCGAGA(SEQ ID NO:5)
let-7g-5p：AAATATGCGGCCGCAATTT(SEQ ID NO:6)
实时定量PCR检测引物：
miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID NO:8)
let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
通用实时定量PCR引物:TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID NO:10)。
7.根据权利要求3或4所述的一组microRNAs检测试剂在制备阿尔兹海默氏症诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、***固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
8.一种阿尔兹海默氏症的诊断试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中miR-101-3p的含量的试剂、miR-144-5p的含量的试剂和let-7g-5p的含量的试剂。
9.根据权利要求8所述的一种阿尔兹海默氏症的诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由反转录***、引物***和扩增***组成，所述的引物***包括：
通用实时定量PCR引物如SEQ ID NO:10所示；
miR-101-3p实时定量PCR引物如SEQ ID NO:7所示；
miR-144-5p实时定量PCR引物如SEQ ID NO:8所示；
let-7g-5p实时定量PCR引物如SEQ ID NO:9所示。
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