CN104267088B

CN104267088B - 检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN104267088B
Application number: CN201410163474.8A
Authority: CN
Inventors: 李根喜; 曹亚; 虞加翠; 张慧慧; 陈伟伟; 韩鹏
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN104267088A

Abstract

本发明涉及一种检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法。该传感器为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有能够作为铜纳米簇合成模板的双链DNA。本发明利用谷胱甘肽与铜离子的高亲和力结合，抑制电极表面铜纳米簇的合成，并通过对铜纳米簇的电化学定量表征，实现对谷胱甘肽的间接检测。本发明检测谷胱甘肽的线性范围为1~1000 nM，检出限约为0.42 nM。本发明还具有操作简单、成本低廉、使用方便、选择性高等优点，因而在生化研究和临床分析等领域中具有巨大的潜在应用价值。

Description

检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型电化学生物传感器及其制备方法，特别是一种检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法。

发明背景

谷胱甘肽是细胞中含量最丰富的小分子量非蛋白巯基化合物，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成。谷胱甘肽是机体内巯基和硫化物的调节剂，在维持蛋白巯基的还原状态和酶的活性、抗氧化、维持生物机体内氧化还原环境平衡等方面发挥着重要作用。近年来若干研究表明，机体内谷胱甘肽浓度的变化与阿尔兹海默病、帕金森综合症、糖尿病、动脉粥样硬化等诸多疾病的发生发展有关；而谷胱甘肽的灵敏检测可以为这些疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。现今检测谷胱甘肽的技术主要包括高效液相色谱法、紫外-热量检测法、毛细管电泳法、质谱分析法、荧光光谱测定法等。这些方法在检测灵敏度、选择性、检测时间和稳定性方面各有优势，但同时也存在操作繁琐、仪器设备昂贵等不足。因此，发明一种简单、灵敏的谷胱甘肽检测新方法显得非常迫切。

电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器，主要由分子识别和信息转换部件两部分组合构成。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号。电化学研究中常用三电极体系，包括工作电极、辅助电极（也称对电极）和参比电极。电流流经工作电极和辅助电极，工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。电化学方法作为一类分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测谷胱甘肽的电化学生物传感器，该传感器通过对电极表面铜纳米簇的定量分析，实现对于谷胱甘肽的间接检测。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：设计一条DNA单链P1，其3'末端含有巯基，可以通过金-巯共价键的作用自组装在金电极表面；另外设计一条与P1单链碱基完全互补的DNA单链P2，两者杂交形成双链，成为铜纳米簇在电极表面合成的模板。在还原剂存在的条件下，溶液中的二价铜离子被还原成一价亚铜离子，后者发生歧化反应转变成二价铜离子和零价铜原子，而零价铜原子可以在电极表面固定的双链DNA的大沟位置发生富集并最终形成铜纳米簇。利用盐酸将合成的铜纳米簇氧化溶解，并使用电化学技术进行检测，可以实现对电极表面铜纳米簇的定量表征。另一方面，谷胱甘肽可以特异性地结合溶液中的铜离子，从而抑制铜离子的还原过程，最终导致电极表面合成的铜纳米簇的数量减少。利用电化学技术对铜纳米簇进行定量表征时所得到的电化学信号也相应变小，通过分析电化学信号改变的多少，我们就可以计算得到谷胱甘肽的浓度。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测谷胱甘肽的电化学生物传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有能够作为铜纳米簇合成模板的DNA双链，且该双链互补结构。

上述的DNA双链由P1、P2链杂交形成，其中P1链的序列为：5'-TACTCATACGCTCATACGTTCATCACGACTAAAAA-C₆-SH-3'，P2链的序列为：5'- AGTCGTGATGAACGTATGAGCGTATGAGTA-3'。

上述序列的设计原则是在实验过程中P1-P2杂交链可以在电极表面保持稳定的双链结构，且双链长度不少于30个碱基（T-A碱基对的比例大于50%），以保证铜纳米簇合成的效率。一旦DNA的序列被设计出来，其制备或化学合成将交由专业的核酸合成公司完成。

一种根据上述的检测谷胱甘肽的生物传感器的制备方法，其特征在于制备该传感器的工作电极，具体步骤为：

a)将处理过的金电极置于0.5MH₂SO₄中，在0～1.6V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，直至达到稳定；吹干待用；

b)将步骤a所得金电极浸没在DNA固定缓冲溶液中，室温下静置15~18小时后，再浸没在1 mM 巯基己醇水溶液中避光反应0.5～2.0小时，用超纯水冲洗，吹干，即得到第一根链修饰的金电极；所述的DNA固定缓冲溶液中含有浓度为1 μM的第一根链、10 mM 的Tris-HCl、1 mM的 EDTA、10 mM的TCEP以及0.1 M的NaCl，溶液的pH值为7.4；

c)将步骤b所得的经第一根链修饰的金电极浸没在DNA杂交缓冲液中，4℃静置1~2小时后用超纯水冲洗，吹干，即得到完备的双链DNA修饰的金电极；所述的DNA杂交缓冲溶液为10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有浓度为1 μM的第二根链和1 M的NaCl。

上述的金电极的处理方法的具体步骤为：在待处理的金电极表面滴20 μL水虎鱼溶液，即浓硫酸﹕过氧化氢的体积比为3﹕1，反应2分钟，用超纯水冲洗干净，氮气吹干；将金电极在5000目砂纸上打磨2分钟之后，在含有粒度分别为1 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝的砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，然后在乙醇、超纯水中依次超声2分钟，除去杂质。

一种谷胱甘肽的检测方法，采用上述的谷胱甘肽的生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.称取适量抗坏血酸粉末，用超纯水稀释至10mM，取40μL与320μL反应缓冲液混合，再往该体系中加入40 μL含有10 μM铜离子和不同浓度谷胱甘肽的待测混合溶液，室温反应20分钟；所述的反应缓冲液中含有浓度为20 mM的MOPS、300 mM的NaCl和2 mM的MgCl₂，溶液的pH值为7.5。

b.将生物传感器中的工作电极金电极立刻放入步骤a所得的混合溶液中，室温下反应30分钟。用超纯水冲洗并用氮气吹干后，将工作电极浸入到200 μL 0.1 M 盐酸溶液中溶解电极表面合成的铜纳米簇。反应2小时后，将上述溶液与4.8 mL 0.5 M NaAc-HAc缓冲液混合，并以此作为电解质溶液进行电化学检测。电化学检测具体步骤为：首先在-1.2 V电压下沉积8分钟，然后用差分脉冲伏安法（DPV）扫描得到相应电化学数据；其中DPV实验具体参数为：初始电位0.1 V，终止电位0.35 V，脉冲振幅50 mV，脉冲周期200 m。

本发明构建了一种检测谷胱甘肽的电化学生物传感器，利用谷胱甘肽与铜离子亲和力强的特点，将谷胱甘肽对铜纳米簇合成的抑制作用与电化学检测灵敏、方便的优势相结合，通过对电极表面合成的铜纳米簇的定量表征，对谷胱甘肽进行了快速、灵敏的检测，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为在溶液中存在不同浓度的铜离子时，电极表面合成的铜纳米簇的DPV定量表征结果。曲线从a到f分别为0 M、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM和10 μM。

图2为检测1 μM 谷胱甘肽及对照实验中所得到的DPV图谱。（a）对照组，体系中不含谷胱甘肽；（b）实验组，体系中含有1 μM谷胱甘肽。

图3为检测不同浓度谷胱甘肽（从a到g分别为0 nM、1 nM、5 nM、10 nM、100 nM、1 μM和10 μM）时得到的DPV图谱。

图4为DPV峰电流值与谷胱甘肽浓度间的关系，***图为谷胱甘肽浓度在1-1000nM范围内，DPV峰电流值与谷胱甘肽浓度对数值间的线性关系。

图5为检测1 μM谷胱甘肽以及10 μM干扰氨基酸时得到的DPV图谱。

具体实施方法

实施例一：双链DNA修饰的金电极制备

在待处理的金电极表面滴20 μL水虎鱼溶液（浓硫酸﹕过氧化氢=3﹕1）反应2分钟，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。将金电极在5000目砂纸上打磨5分钟之后，分别在含有氧化铝（粒度分别为1 μm，0.3 μm，0.05 μm）砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，然后在乙醇、超纯水中依次超声2分钟，除去杂质。将处理好的金电极放置在0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描。设置扫描电压范围0～1.6 V，扫描速度100 mV/s，设定30圈扫至循环伏安曲线稳定，用氮气吹干，得到表面处理干净的裸金电极，可用于巯基DNA的修饰。将该金电极浸入含1 μM P1链的DNA固定缓冲溶液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、10 mM TCEP以及0.1 M NaCl，pH 7.4）中室温下静置15~18小时，即形成良好的无非特异性吸附的P1链自组装单分子层。用超纯水冲洗金电极，并用氮气吹干，再将金电极浸入含有1 μM P2链的杂交缓冲液（10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有1 M的NaCl）中，4℃静置1~2小时后用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到完备的双链DNA修饰的金电极。

实施例二：铜纳米簇合成及电化学定量表征

取40 μL 10 mM抗坏血酸溶液与320 μL反应缓冲液（20 mM MOPS、300 mM的NaCl和2 mM的MgCl₂，pH 7.5）混合，再往该体系中加入40 μL不同浓度的铜离子溶液，静置20分钟。将双链DNA修饰的金电极放入上述混合溶液中，室温下反应30分钟。反应结束后，用超纯水冲洗电极并用氮气吹干，以去除多余的吸附在电极表面的铜离子。随后，将电极浸入到200μL 0.1 M 盐酸溶液中溶解电极表面合成的铜纳米簇。2小时后，将上述溶液与4.8 mL 0.5M NaAc-HAc缓冲液混合，并以此作为电解质溶液进行电化学检测。

相关核酸序列如下：

P1链序列为：5'-TACTCATACGCTCATACGTTCATCACGACTAAAAA-C₆-SH-3'。

P2链序列为：5'- AGTCGTGATGAACGTATGAGCGTATGAGTA-3'。

电化学检测具体步骤：首先在-1.2 V电压下沉积8分钟，然后DPV扫描得到相应电化学数据；DPV实验具体参数为：初始电位0.1 V，终止电位0.35 V，脉冲振幅50 mV，脉冲周期200 ms。

如图1曲线a所示，当反应溶液中不存在铜离子时，最终得到的DPV图谱中没有明显的电化学响应峰，这是由于此时电极表面没有形成铜纳米簇。而当反应溶液中存在铜离子时，DPV图谱在0.22 V附近得到一个明显的特征氧化还原峰，并且该峰电流绝对值随铜离子浓度增加而增大（曲线b到f）。以上结果表明通过盐酸溶解、电沉积和DPV扫描等一系列步骤，可以实现对电极表面合成的铜纳米簇的定量表征。

实施例三：不同浓度谷胱甘肽的检测

取40 μL 10 mM抗坏血酸溶液与320 μL反应缓冲液（20 mM MOPS、300 mM的NaCl和2 mM的MgCl₂，pH 7.5）混合，再往该体系中加入40 μL含有10 μM铜离子和不同浓度谷胱甘肽（0 nM、1 nM、5 nM、10 nM、100 nM、1 μM和10 μM）的待测混合溶液，室温反应20分钟。随后，将双链DNA修饰的金电极放入上述混合溶液中，室温下反应30分钟后进行电化学检测，具体检测步骤与实施例二中相同。

图2曲线a显示了双链DNA修饰的金电极在只含有抗坏血酸和铜离子的反应体系中作用一段时间并经过一定处理后扫描得到的DPV图谱。从中可以看出，电极表面固定的双链DNA分子可以作为铜纳米簇合成的模板，并且电极表面铜纳米颗粒的生成会导致DPV图谱中出现明显的电化学响应。而当体系中存在1 μM 谷胱甘肽时，最终得到的DPV响应明显减弱（图2曲线b），这是由于谷胱甘肽能够与溶液中存在的铜离子结合，进而抑制了铜纳米簇在电极表面的形成。

如图3所示，随着谷胱甘肽浓度的提高，DPV图谱中电化学响应逐渐降低，这说明随着谷胱甘肽浓度的增加，越来越多的铜离子与谷胱甘肽结合，进而导致电极表面形成的铜纳米簇越来越少。

将DPV峰电流值与谷胱甘肽浓度作图即得图4。另外，图4的***图显示，当谷胱甘肽浓度在1~1000 nM之间变化时，谷胱甘肽浓度的对数值与DPV峰电流值呈现良好的线性关系，可以作为谷胱甘肽定量检测的依据。谷胱甘肽的最低检出限约为0.42 nM。

实施例四：生物电化学传感器特异性研究

为了验证本生物电化学传感器的特异性，我们用其他氨基酸（丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸等）作为对照，按照上述实验方法，分别对浓度为10 μM干扰氨基酸进行电化学检测。如图5所示，当溶液中含有1 μM谷胱甘肽时，所得的DPV峰电流绝对值最小，约为0.16 μA，而含其他干扰氨基酸时DPV峰电流绝对值都较大，与空白对照时相近，说明本生物电化学传感器对于谷胱甘肽具有很高的选择性和特异性。

以上结果表明，本生物传感器对于谷胱甘肽具有很好的选择性和特异性，设计思路简单、成本低廉、实验操作方便、检测结果灵敏，在生化研究和临床分析领域中有着很大的潜在应用价值。没有查到专利是关于用双链修饰金电极制备的传感器进行检测GSH。

<120> 检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

5'-TACTC ATACG CTCAT ACGTT CATCA CGACT AAAAA-C₆-SH-3'

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

5'- AGTCG TGATG AACGT ATGAG CGTAT GAGTA-3'

Claims

1.一种检测谷胱甘肽的电化学生物传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极上修饰有能够作为铜纳米簇合成模板的DNA双链，且该双链为互补结构；通过对工作电极表面铜纳米簇的定量分析，实现对谷胱甘肽的间接检测；

所述的DNA双链由P1链、P2链杂交形成，其中P1链的序列为：5'-TACTCATACGCTCATACGTTCATCACGACTAAAAA-C₆-SH-3'，P2链的序列为：5'- AGTCGTGATGAACGTATGAGCGTATGAGTA-3'。

2.一种根据权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于制备该传感器的工作电极，具体步骤为：

b)将步骤a所得金电极浸没在DNA固定缓冲溶液中，室温下静置15~18小时后，再浸没在1 mM 巯基己醇水溶液中避光反应0.5～2.0小时，用超纯水冲洗，吹干，即得到P1链修饰的金电极；所述的DNA固定缓冲溶液中含有浓度为1 μM的P1链、10 mM 的Tris-HCl、1 mM的EDTA、10 mM的TCEP以及0.1 M的NaCl，溶液的pH值为7.4；

c)将步骤b所得的经P1链修饰的金电极浸没在DNA杂交缓冲液中，4℃静置1~2小时后用超纯水冲洗，吹干，即得到完备的双链DNA修饰的金电极；所述的DNA杂交缓冲溶液为10 mMpH 7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有浓度为1 μM的P2链和1 M的NaCl。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的金电极的处理方法的具体步骤为：在待处理的金电极表面滴20 μL水虎鱼溶液，即浓硫酸与过氧化氢的体积比为3:1的溶液，反应2分钟，用超纯水冲洗干净，氮气吹干；将金电极在5000目砂纸上打磨2分钟之后，在含有粒度分别为1 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝的砂浆的丝绸上依次抛光至镜面，然后在乙醇、超纯水中依次超声2分钟，除去杂质。

4.一种谷胱甘肽的检测方法，采用根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：

a)称取适量抗坏血酸粉末，用超纯水稀释至10mM，取40μL与320μL反应缓冲液混合，再往该缓冲液中加入40 μL含有10 μM铜离子和不同浓度谷胱甘肽的待测混合溶液，室温反应20分钟；所述的反应缓冲液中含有浓度为20 mM的MOPS、300 mM的NaCl和2 mM的MgCl₂，溶液的pH值为7.5；

b)将生物传感器中的工作电极金电极立刻放入步骤a所得的混合溶液中，室温下反应30分钟；用超纯水冲洗并用氮气吹干后，将工作电极浸入到200 μL 0.1 M 盐酸溶液中溶解电极表面合成的铜纳米簇；反应2小时后，将反应所得溶液与4.8 mL 0.5 M NaAc-HAc缓冲液混合，并以此作为电解质溶液进行电化学检测；电化学检测具体步骤为：首先在-1.2 V电压下沉积8分钟，然后用差分脉冲伏安法DPV扫描得到相应电化学数据；其中DPV实验具体参数为：初始电位0.1 V，终止电位0.35 V，脉冲振幅50 mV，脉冲周期200 ms。