CN105925629A - 一种通过微生物转化合成丁二胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨酸脱羧酶基因，将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。本发明方法通过构建大肠杆菌重组菌株分泌表达鸟氨酸脱羧酶至大肠杆菌周质腔中，然后向发酵液中投入一定浓度的底物鸟氨酸，周质腔中的鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为丁二胺，解决了丁二胺向细胞外转运的难题，降低了生产成本，经济环保，操作简单方便，提高了丁二胺的产量。

Description

一种通过微生物转化合成丁二胺的方法

技术领域

本发明属于基因工程菌技术领域，尤其是一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，该方法通过过表达鸟氨酸脱羧酶对发酵液中鸟氨酸进行生物转化，从而有效提高丁二胺的产量。

背景技术

1,4-丁二胺(butanediamine，简称丁二胺)，又名腐胺(putrescine)，是一类含氮、带正电荷的小分子脂肪族化合物，是生物胺类(包括腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等)中最简单的一种。在细胞内，丁二胺是鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的作用下脱羧产生的，与赖氨酸的脱羧产物尸胺一样都是尸体腐败产生的气味中的成分，作为一种毒碱存在于腐败物中。丁二胺的应用十分广泛。在农业上丁二胺适当添加可以减缓瓜果蔬菜腐烂的时间，从而延长保存时间；在医学上，丁二胺作为一些疾病的判断指标；在工业上，丁二胺可以与己二酸聚合合成新型优质的聚酰胺--尼龙46，具有重要的工业用途。

目前合成丁二胺的方法有化学合成法和生物合成法。化学合成法条件苛刻、污染环境、破坏生态，生物合成法和微生物转化法可直接规模化制备人类所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是研究的方向和热点。

生物合成法生产丁二胺就是通过微生物利用糖类发酵直接合成丁二胺。为了提高丁二胺的产量，根据大肠杆菌的丁二胺合成调节情况。对丁二胺合成的代谢途径进行改造。专利公开文献CN 103403147A报道了利用利用谷氨酸棒杆菌重组菌株发酵糖类合成丁二胺的方法：通过阻断谷氨酸棒杆菌的自鸟氨酸至精氨酸的生物合成途径，增加细胞内谷氨酸水平，增强自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径并引入细胞外鸟氨酸脱梭酶生产丁二胺。专利公开文献WO06/005603也报道了通过通过去除降解或使用腐胺的亚精胺和乙酰腐胺合成途径来提高丁二胺的产量。但由于胞内合成丁二胺不能有效分泌到细胞外，造成在细胞内的积累而抑制赖氨酸脱羧酶的活性，影响丁二胺的产量。

微生物转化法就是利用微生物细胞表达鸟氨酸脱羧酶，将投入的底物鸟氨酸转化成丁二胺。本发明专利申请通过构建大肠杆菌重组菌株分泌表达鸟氨酸脱羧酶至大肠杆菌周质腔中，然后向发酵液中投入一定浓度的底物鸟氨酸，周质腔中的鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为丁二胺，避免了丁二胺向细胞外转运的难题。因此与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，该方法构建能分泌表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株，发酵该重组菌株并诱导鸟氨酸脱羧酶基因分泌表达至周质腔中，把投入到发酵液中的鸟氨酸转化成丁二胺，，解决了丁二胺向细胞外转运的难题。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨酸脱羧酶基因，将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。

而且，步骤如下：

构建能够表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株，发酵该微生物重组菌株诱导鸟氨酸脱羧酶基因的表达，得发酵液，然后向表达鸟氨酸脱羧酶的发酵液中加入鸟氨酸，鸟氨酸脱羧酶将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。

而且，所述鸟氨酸的浓度为5-40g/L。

而且，所述鸟氨酸浓度为10-30g/L。

而且，所述鸟氨酸浓度为15-25g/L。

而且，所述微生物重组菌株为大肠杆菌重组菌株、谷氨酸棒杆菌重组菌株、谷草芽孢杆菌重组菌株和乳酸菌重组菌株；

或者，所述鸟氨酸脱羧酶基因来源于大肠杆菌的speC基因。

而且，所述微生物重组菌株的构建方法如下：

将鸟氨酸脱羧酶基因连接到微生物的分泌表达载体上，并转化微生物，筛选得到能分泌表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株。

而且，所述鸟氨酸脱羧酶基因来源于微生物或高等植物。

而且，所述微生物为大肠杆菌、乳酸菌(Lactobacillus)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmits)或摩氏摩根菌(Morganellamorganii)；或者，所述高等植物为曼陀罗、朝鲜蓟、冰叶日中花、兰花或白杨。

而且，步骤如下：

⑴产丁二胺工程菌株PUT-C1的构建

利用试剂盒提取大肠杆菌的基因组DNA，作为扩增鸟氨酸脱羧酶基因speC的模板；根据NCBI提供的大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因speC序列设计引物，分别扩增出speC；然后speC片段通过EcoRI和Nco I酶切后克隆至pET22b+相同酶切位点之间；转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，经过筛选，获得产丁二胺大肠杆菌重组菌PUT-C1；

构建重组菌PUT-C1所设计的引物序列如下(SEQUENCE1、SEQUENCE2)：

⑵鸟氨酸脱羧酶SpeC的酶活测定

①粗酶液的制备

1)从平板上取一环大肠杆菌重组菌PUT-C1接种于相应抗性的50mL液体LB中，在37℃、200r/min摇床上过夜培养12h；

2)按1％接种量转接入新的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下在摇床上培养；

3)当OD₆₀₀＝1.0时，加入终浓度1mM IPTG，然后在37℃，200r/min的条件下诱导6h；

4)取30mL培养液于50mL离心管中，6000r/min离心8min；

5)弃上清，加入10mL无菌磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡混匀，补加PBS至20mL，6000r/min离心8min；重复步骤一次；

6)加入10mL PBS，细胞悬液超声处理30min，超声2s，间歇3s，功率40％；

7)4℃低温下8000r/min离心15min，除去细胞碎片上清即为粗酶液；

②鸟氨酸脱羧酶SpeC的SDS-PAGE分析

将待用的凝胶浸泡在缓冲液中，用微量进样器按号向凝胶孔中加样；接上电泳仪，打开电源，调节电流至20-30mA，保持恒流，待样品迁移至分离胶下端1cm处时，关闭电源；电泳完毕后，取下电泳凝胶，并在凝胶的一角小心切去一小块作为标记，倒入考马斯亮蓝染色液进行染色1h；倾倒出染色液，将凝胶在水中漂洗数次；加入脱色液，开始每隔2h更换脱色液一次，直至凝胶背景清晰；

PUT-C1进行诱导表达及SDS-PAGE分析；

③酶活测定

1)取800μL不同pH的磷酸缓冲液于5mL无菌具塞刻度管中，至于37℃水浴预热5min；平行3个；

2)加入100μL粗酶液，加入L-精氨酸母液100μL，开始计时30min；对照组用无菌水替代L-精氨酸；

3)将具塞刻度管置于冰上，迅速加入500μL 2MNaOH终止反应；

4)衍生，上柱检测丁二胺的生成量；

④鸟氨酸脱羧酶活性检测结果

根据HPLC检测丁二胺转化结果，检测鸟氨酸脱羧酶SpeC的活性；

⑶重组菌株PUT-C1的摇瓶发酵及丁胺产量的测定

①摇瓶发酵

在平板上挑取一环单克隆重组菌株接种到含有5mL LB培养基中培养10-12h，以1％的接种量接入到装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝1.0，加入终浓度1mM IPTG，然后在37℃，200r/min的条件下诱导6h；投入底物鸟氨酸，其中鸟氨酸的浓度分别为0g/L、10g/L、20g/L、30g/L和40g/L，每组平行三个；37℃，200r/min培养12h；发酵液12000r/min离心5min，取上清液4℃保存；

②HPLC检测丁二胺

实验采用国标法检测丁二胺的含量，通过对水样进行柱前衍生，水样经苯甲酰氯衍生化后用***萃取，萃取物经溶剂转换溶于甲醇后用高效液相色谱紫外检测；

1)样品的衍生和萃取

取1mL上清液加入5mL具塞刻度试管中，加入500μL 2mol/LNaOH溶液、10μL苯甲酰氯，37℃水浴振摇20min，隔5min旋涡振荡30s，加入0.5g NaCl、1mL***振荡30s静置分层；把上层***取至另一离心管中，待***挥发完全，加入500μL甲醇溶解，过膜后作为HPLC检测用样；标准溶液的衍生和萃取步骤同样品处理步骤；

2)HPLC测定

a色谱条件

A)色谱柱：C18色谱柱，5μm，4.6×250mm，或性能相当者；

B)柱温：室温；

C)流动相：A(乙腈)，B(0.02mol/L乙酸铵)，梯度洗脱条件如下：

D)检测波长：254nm。

E)进样量：10μL；

F)流速：1mL/min；

b液相色谱分析测定

开机，预热，使用流动相冲洗色谱柱，基线稳定30min后开始进样；

将发酵液上清稀释后衍生进行HPLC分析，通过峰面积计算出丁二胺的含量。

本发明的优点和积极效果：

本发明方法通过构建大肠杆菌重组菌株分泌表达鸟氨酸脱羧酶至大肠杆菌周质腔中，然后向发酵液中投入一定浓度的底物鸟氨酸，周质腔中的鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为丁二胺，解决了丁二胺向细胞外转运的难题，降低了生产成本，经济环保，操作简单方便，提高了丁二胺的产量。

附图说明

图1为本发明中E.coli基因组DNA图；

图2为本发明中speC的PCR产物图；

图3为本发明中pET22b-speC双酶切结果图；

图4为本发明中诱导表达产物SDS-PAGE分析图；

图5为本发明中丁二胺的标准品图；

图6为本发明中样品色谱图；

图7为本发明中丁二胺含量的标准曲线图；

图8为本发明中不同投料量的丁二胺的产量图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

本发明所运用的技术手段：

本发明的基因序列涉及鸟氨酸脱羧酶基因，其序列为已知序列。质粒pET22b+、分子操作技术、微生物培养技术及丁二胺的检测等，对于本领域的技术人员而言都是公知的。

实施例1

一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨酸脱羧酶基因，将底物鸟氨酸转化成丁二胺。

步骤可以如下：

构建能够表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株，发酵该微生物重组菌株诱导鸟氨酸脱羧酶基因的表达，得发酵液，然后向表达鸟氨酸脱羧酶的发酵液中加入鸟氨酸，鸟氨酸脱羧酶将底物鸟氨酸转化成丁二胺；

其中，所述鸟氨酸的浓度可以是5-40g/L，优选的鸟氨酸浓度是10-30g/L，更优选的鸟氨酸浓度是15-25g/L。

进一步地，所述微生物重组菌株为大肠杆菌重组菌株、谷氨酸棒杆菌重组菌株、谷草芽孢杆菌重组菌株和乳酸菌重组菌株；

或者，所述鸟氨酸脱羧酶基因来源于大肠杆菌的speC基因。

进一步地，所述微生物重组菌株的构建方法如下：

将鸟氨酸脱羧酶基因连接到微生物的分泌表达载体上，并转化微生物，筛选得到能分泌表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株。

进一步地，所述鸟氨酸脱羧酶基因可以来源于大肠杆菌、乳酸菌(Lactobacillus)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmits)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)等微生物；也可以来源于曼陀罗(DaturaStramonium)、朝鲜蓟(Cynarascolymus)、冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、兰花(Cymbidium)、白杨(poplar)等高等植物；更优选的是来源于大肠杆菌的speC基因。

实施例2

一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，具体步骤如下：

(1)产丁二胺工程菌株PUT-C1的构建

将鸟氨酸脱羧酶基因连接于表达质粒pET22b+上构建质粒pET22b-speC，转化入E.coliBL21(DE3)中构建成工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-speC。

具体地，利用试剂盒提取大肠杆菌的基因组DNA，作为扩增鸟氨酸脱羧酶基因speC的模板，如图1；根据NCBI提供的大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因speC序列设计引物，分别扩增出speC，如图2；然后speC片段通过EcoRI和Nco I酶切后克隆至pET22b+相同酶切位点之间，得质粒pET22b-speC，如图3；转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，经过筛选，获得产丁二胺大肠杆菌重组菌PUT-C1。

构建重组菌PUT-C1所设计的引物序列如表1：

表1：构建重组菌PUT-C1所需引物

(2)鸟氨酸脱羧酶SpeC的酶活测定

测定鸟氨酸脱羧酶SpeC的活性方法步骤如下：

1、粗酶液的制备

1)从平板上取一环重组菌株接种于相应抗性的50mL液体LB中，在37℃、200r/min摇床上过夜培养12h。

2)按1％接种量转接入新的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下在摇床上培养。

3)当OD₆₀₀＝1.0时，加入终浓度1mM IPTG，然后在37℃，200r/min的条件下诱导6h。

4)取30mL培养液于50mL离心管中，6000r/min离心8min。

5)弃上清，加入10mL无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)，涡旋振荡混匀，补加PBS至20mL，6000r/min离心8min。重复步骤一次

6)加入10mL PBS，细胞悬液超声处理30min，超声2s，间歇3s，功率40％。

7)4℃低温下8000r/min离心15min，除去细胞碎片上清即为粗酶液。

2、鸟氨酸脱羧酶SpeC的SDS-PAGE分析

将待用的凝胶浸泡在缓冲液中，用微量进样器按号向凝胶孔中加样。接上电泳仪，打开电源，调节电流至20-30mA，保持恒流，待样品迁移至分离胶下端1cm处时，关闭电源。电泳完毕后，取下电泳凝胶，并在凝胶的一角小心切去一小块作为标记，倒入考马斯亮蓝染色液进行染色，约1h。倾倒出染色液，将凝胶在水中漂洗数次。加入脱色液，开始每隔2h更换脱色液一次，直至凝胶背景清晰。

PUT-C1进行诱导表达及SDS-PAGE分析，电泳结果如图4。鸟氨酸脱羧酶的分子量大小均为80kD左右。

3、酶活测定

1)取800μL不同pH的磷酸缓冲液于5mL无菌具塞刻度管中，至于37℃水浴预热5min。平行3个。

2)加入100μL粗酶液，加入L-精氨酸母液100μL，开始计时30min。对照组用无菌水替代L-精氨酸。

3)将具塞刻度管置于冰上，迅速加入500μL 2MNaOH终止反应。

4)衍生，上柱检测丁二胺的生成量。

4、鸟氨酸脱羧酶活性检测结果

根据HPLC检测丁二胺转化结果，鸟氨酸脱羧酶SpeC的活性为17.48U/mL。

(3)重组菌株PUT-C1的摇瓶发酵及丁胺产量的测定

1、摇瓶发酵

在平板上挑取一环单克隆重组菌株接种到含有5mL LB培养基中培养10-12h，以1％的接种量接入到装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝1.0，加入终浓度1mM IPTG，然后在37℃，200r/min的条件下诱导6h。投入底物鸟氨酸，其中鸟氨酸的浓度分别为0g/L、10g/L、20g/L、30g/L和40g/L，每组平行三个。37℃，200r/min培养12h。发酵液12000r/min离心5min，取上清液4℃保存。

2、HPLC检测丁二胺

实验采用国标法检测丁二胺的含量，通过对水样进行柱前衍生，水样经苯甲酰氯衍生化后用***萃取，萃取物经溶剂转换溶于甲醇后用高效液相色谱(HPLC)紫外检测。此法灵敏度高，丁二胺在2-40mg/L范围内呈线性关系。

1)样品的衍生和萃取

取1mL上清液加入5mL具塞刻度试管中，加入500μL 2mol/LNaOH溶液、10μL苯甲酰氯，37℃水浴振摇20min，隔5min旋涡振荡30s，加入0.5g NaCl、1mL***振荡30s静置分层。把上层***取至另一离心管中，待***挥发完全，加入500μL甲醇溶解，过膜后作为HPLC检测用样。标准溶液的衍生和萃取步骤同样品处理步骤。

2)HPLC测定

a色谱条件

A)色谱柱：C18色谱柱，5μm，4.6×250mm，或性能相当者。

B)柱温：室温。

C)流动相：A(乙腈)，B(0.02mol/L乙酸铵)，梯度洗脱条件见表2。

D)检测波长：254nm。

E)进样量：10μL。

F)流速：1mL/min

b液相色谱分析测定

开机，预热，使用流动相冲洗色谱柱，基线稳定30min后开始进样

表2梯度洗脱条件

将发酵液上清稀释一定倍数后衍生进行HPLC分析，标准品和样品液相色谱图分别为图5和图6，丁二胺衍生物在约6.8min时出峰。根据图7标准曲线，通过峰面积计算出丁二胺的含量。

采用外标法生成峰面积(y)-丁二胺盐酸盐样品浓度(x)的标准曲线及其线性回归方程。从图4可以得出，采用外标法生成峰面积(y)-丁二胺盐酸盐样品浓度(x)的标准曲线及其线性回归方程。

y＝16.342x+5.34式(1)

其中，y为峰面积，x为丁二胺盐酸盐浓度，方程线性回归相关系数(Rs)为0.999。

根据标准曲线测定不同样品中的丁二胺的含量。每个样品做三个重复，求丁二胺产量的平均值。结果如图8所示。从图8可以看出，未投入鸟氨酸的发酵液中丁二胺产量为0；当投入鸟氨酸的浓度为10g/L时，丁二胺产量为500±17mg/L；当投入鸟氨酸的浓度为20g/L时，丁二胺产量为1690±64mg/L；当投入鸟氨酸的浓度为30g/L时，丁二胺产量为1240±27mg/L；当投入鸟氨酸的浓度为40g/L时，丁二胺产量为696±8mg/L。说明在底物浓度为20g/L时，发酵液中丁二胺积累量最大，表达鸟氨酸脱羧酶转化鸟氨酸为丁二胺可以有效提高丁二胺的产量。

Claims (10)

1.一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨酸脱羧酶基因，将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。

2.根据权利要求1所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：步骤如下：

构建能够表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株，发酵该微生物重组菌株诱导鸟氨酸脱羧酶基因的表达，得发酵液，然后向表达鸟氨酸脱羧酶的发酵液中加入鸟氨酸，鸟氨酸脱羧酶将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。

3.根据权利要求2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述鸟氨酸的浓度为5-40g/L。

4.根据权利要求2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述鸟氨酸浓度为10-30g/L。

5.根据权利要求2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述鸟氨酸浓度为15-25g/L。

6.根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述微生物重组菌株为大肠杆菌重组菌株、谷氨酸棒杆菌重组菌株、谷草芽孢杆菌重组菌株和乳酸菌重组菌株；

或者，所述鸟氨酸脱羧酶基因来源于大肠杆菌的speC基因。

7.根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述微生物重组菌株的构建方法如下：

将鸟氨酸脱羧酶基因连接到微生物的分泌表达载体上，并转化微生物，筛选得到能分泌表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株。

8.根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述鸟氨酸脱羧酶基因来源于微生物或高等植物。

9.根据权利要求5所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：所述微生物为大肠杆菌、乳酸菌(Lactobacillus)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmits)或摩氏摩根菌(Morganellamorganii)；或者，所述高等植物为曼陀罗、朝鲜蓟、冰叶日中花、兰花或白杨。

10.根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴产丁二胺工程菌株PUT-C1的构建

利用试剂盒提取大肠杆菌的基因组DNA，作为扩增鸟氨酸脱羧酶基因speC的模板；根据NCBI提供的大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因speC序列设计引物，分别扩增出speC；然后speC片段通过EcoRI和Nco I酶切后克隆至pET22b+相同酶切位点之间；转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，经过筛选，获得产丁二胺大肠杆菌重组菌PUT-C1；

构建重组菌PUT-C1所设计的引物序列为SEQUENCE1、SEQUENCE2；

⑵鸟氨酸脱羧酶SpeC的酶活测定

①粗酶液的制备

1)从平板上取一环大肠杆菌重组菌PUT-C1接种于相应抗性的50mL液体LB中，在37℃、200r/min摇床上过夜培养12h；

2)按1％接种量转接入新的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下在摇床上培养；

3)当OD₆₀₀＝1.0时，加入终浓度1mM IPTG，然后在37℃，200r/min的条件下诱导6h；

4)取30mL培养液于50mL离心管中，6000r/min离心8min；

5)弃上清，加入10mL无菌磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡混匀，补加PBS至20mL，6000r/min离心8min；重复步骤一次；

6)加入10mL PBS，细胞悬液超声处理30min，超声2s，间歇3s，功率40％；

7)4℃低温下8000r/min离心15min，除去细胞碎片上清即为粗酶液；

②鸟氨酸脱羧酶SpeC的SDS-PAGE分析

将待用的凝胶浸泡在缓冲液中，用微量进样器按号向凝胶孔中加样；接上电泳仪，打开电源，调节电流至20-30mA，保持恒流，待样品迁移至分离胶下端1cm处时，关闭电源；电泳完毕后，取下电泳凝胶，并在凝胶的一角小心切去一小块作为标记，倒入考马斯亮蓝染色液进行染色1h；倾倒出染色液，将凝胶在水中漂洗数次；加入脱色液，开始每隔2h更换脱色液一次，直至凝胶背景清晰；

PUT-C1进行诱导表达及SDS-PAGE分析；

③酶活测定

1)取800μL不同pH的磷酸缓冲液于5mL无菌具塞刻度管中，至于37℃水浴预热5min；平行3个；

2)加入100μL粗酶液，加入L-精氨酸母液100μL，开始计时30min；对照组用无菌水替代L-精氨酸；

3)将具塞刻度管置于冰上，迅速加入500μL 2MNaOH终止反应；

4)衍生，上柱检测丁二胺的生成量；

④鸟氨酸脱羧酶活性检测结果

根据HPLC检测丁二胺转化结果，检测鸟氨酸脱羧酶SpeC的活性；

⑶重组菌株PUT-C1的摇瓶发酵及丁胺产量的测定

①摇瓶发酵

在平板上挑取一环单克隆重组菌株接种到含有5mL LB培养基中培养10-12h，以1％的接种量接入到装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝1.0，加入终浓度1mM IPTG，然后在37℃，200r/min的条件下诱导6h；投入底物鸟氨酸，其中鸟氨酸的浓度分别为0g/L、10g/L、20g/L、30g/L和40g/L，每组平行三个；37℃，200r/min培养12h；发酵液12000r/min离心5min，取上清液4℃保存；

②HPLC检测丁二胺

实验采用国标法检测丁二胺的含量，通过对水样进行柱前衍生，水样经苯甲酰氯衍生化后用***萃取，萃取物经溶剂转换溶于甲醇后用高效液相色谱紫外检测；

1)样品的衍生和萃取

取1mL上清液加入5mL具塞刻度试管中，加入500μL 2mol/LNaOH溶液、10μL苯甲酰氯，37℃水浴振摇20min，隔5min旋涡振荡30s，加入0.5g NaCl、1mL***振荡30s静置分层；把上层***取至另一离心管中，待***挥发完全，加入500μL甲醇溶解，过膜后作为HPLC检测用样；标准溶液的衍生和萃取步骤同样品处理步骤；

2)HPLC测定

a色谱条件

A)色谱柱：C18色谱柱，5μm，4.6×250mm，或性能相当者；

B)柱温：室温；

C)流动相：A(乙腈)，B(0.02mol/L乙酸铵)，梯度洗脱条件如下：

D)检测波长：254nm。

E)进样量：10μL；

F)流速：1mL/min；

b液相色谱分析测定

开机，预热，使用流动相冲洗色谱柱，基线稳定30min后开始进样；

将发酵液上清稀释后衍生进行HPLC分析，通过峰面积计算出丁二胺的含量。