CN102433288B - 一种产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

一株产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株从土壤中筛选而来的Rummeliibacilluspycnus（SK23-002），保藏编号为CCTCCNO：M2011466，以此芽孢菌为发酵菌株，以葡萄糖为碳源、酵母膏和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产鸟氨酸或含有精氨酸酶的菌体并将所得菌体添加到5%-20%精氨酸溶液中转化合成鸟氨酸，经检测可知，转化率可达80%以上，而且此发酵过程可不依赖精氨酸诱导作用。本发明方法生产的鸟氨酸安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。该发明能高效地生产鸟氨酸，适于进行大规模生产。

Description

一种产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法

技术领域

本发明涉及能够生产鸟氨酸的一种新微生物菌株及其培养发酵生产鸟氨酸或含有精氨酸酶的菌体，并将该菌体用于生物制备鸟氨酸的方法，属于食品生物技术领域，广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。更具体的说本发明涉及来源于土壤的Rummeliibacillus pycnus（SK23.002），保藏编号为CCTCC NO：M 2011466，利用该菌株生物合成鸟氨酸（ornithine）。

背景技术                                                

近年发现鸟氨酸可刺激脑垂体分泌成长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪之代谢(基础代谢)，在结合运动情况下摄食鸟氨酸可减少体内脂肪堆积，增强肌肉和体力，起到减肥保健的作用，此外鸟氨酸还可促进肠道成长提高肠道免疫功能；L-鸟氨酸也是细胞成长因子聚胺合成之前体可能有助于美肤作用，在提高免疫功能和抗癌功能上也有一定作用。L-鸟氨酸加在运动员保健品支链氨基酸中，还具有脱苦作用，所以鸟氨酸是一多功能的氨基酸，故成为关注的热点。

本发明所制的鸟氨酸具有以下特征。分子式：C₅H₁₂N₂O₂，分子量：132.19，熔点：140℃(细微结晶，120℃软化)，溶解性：易溶于水和乙醇，微溶于***，其溶液呈碱性，易溶于水、乙醇,微溶于***。通常作为试剂使用的是其单盐，L-鸟氨酸单盐易溶于水,不溶于甲醇、乙醇、***。在生物体内，鸟氨酸主要参与尿酸循环，对于体内氨态氮的排出有重要作用。鸟氨酸在医药上除作为试剂与注射液外，通常与精氨酸一起用于配置恢复疲劳的发泡饮料。近年来，鸟氨酸在食品工业和医药工业上的应用日益广泛。

目前鸟氨酸的生产主要有合成法、酶法和发酵法3种方法。合成法是早期研究鸟氨酸时的制备方法，其过程复杂，成本较高，D-鸟氨酸及L-鸟氨酸都有，不好分离，故已被淘汰。酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，生成L-鸟氨酸，此法产品纯度高，但价格昂贵，精氨酸及精氨酸酶均不易获得，限于实验室制备。发酵法生产的鸟氨酸，此法简便易行，只要选择合适的菌种，可以达到较高的产量，适用于工业化规模生产。所以，随着鸟氨酸在食品工业和医药工业上的应用日益广泛，对微生物发酵法生产鸟氨酸的研究就具有重大的理论意义和经济意义。

本发明人深入调查和研究了现有技术，并从土壤中筛出多株生产鸟氨酸的菌株进行了研究，最终筛选到一株能高产鸟氨酸的新微生物，优化后可达90%以上的转化率，并通过分离纯化以及浓缩干燥等手段得到较纯的鸟氨酸。基于上述发现提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够高产鸟氨酸，且发酵过程中可不依赖精氨酸的诱导。

其二，是提供一种该菌株生产鸟氨酸的方法，以得到高的转化率。

再者，是提供一种鸟氨酸分离纯化与精制的方法，以得到高纯度的鸟氨酸。

为了实现上述目的，本发明提供一种来源于土壤的Rummeliibacillus pycnus（SK23-002），保藏编号为CCTCC NO：M 2010073。

本发明的技术方案：一株产鸟氨酸的菌株，其分类命名为Rummeliibacillus pycnus（SK23-002），是通过根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16sRNA序列的测定而得出。利用该微生物，发酵生产鸟氨酸的方法，步骤如下：

（1）种子培养

种子培养基：L-Arg 1-20g/L，酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-100g/L，无机氮源1.0-20.0g/L以及加或不加少量无机盐等，调pH6.0-7.5；

种子培养条件：CCTCC NO：M 2011466菌株于30-37℃、150-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养10-15h活化该菌株。

（2）发酵培养

发酵培养基：酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖1-100g/L，L-Arg 1-20g/L，无机氮源1.0-20.0g/L以及加或不加少量无机盐等，调pH6.0-7.5；

发酵条件：接种量1%-10%，30-37℃、转速100-500rpm的条件下在发酵培养基中发酵5-72h。

（3）发酵后处理

发酵液经冷冻离心后收集含鸟氨酸的发酵液及含精氨酸酶的湿菌体，并用0.1%的生理盐水和pH6.0的0.1mol/L醋酸盐缓冲液清洗菌体，得静息细胞进行全细胞转化反应，经检测转化率在80%以上。

（4）全细胞转化反应：底物精氨酸浓度10-200g/L，静息细胞量0.1-10g/L，此反应在pH4.0-8.0，30-70℃的条件下转化反应时间5-40h，得到转化后的反应液，

（5）鸟氨酸的分离纯化

将含鸟氨酸的发酵液或转化后的反应液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂001×7，氨水洗脱，进行鸟氨酸分离纯化。

本发明的有益效果：本发明涉及一株从土壤中筛选而来的Rummeliibacillus pycnus（SK23-002），保藏编号为CCTCC NO：M 2011466，以此芽孢菌为出发酵菌株，以葡萄糖为碳源、酵母膏和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产含有精氨酸酶的菌体，发酵所得菌体添加到5%-20%精氨酸溶液中转化合成鸟氨酸，经检测可知，转化率可达80%以上，而且此发酵过程可不依赖精氨酸诱导作用。本发明方法生产的鸟氨酸安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。该发明能高效地生产鸟氨酸，适于进行大规模生产。

生物材料样品保藏：一种产鸟氨酸的菌株，其分类命名为（Rummeliibacillus pycnus）SK23.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2011466，保藏日期2011年12月12日。

具体实施方式

以下是Rummeliibacillus pycnus（SK23.002）进行发酵生产鸟氨酸的实施例，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实例，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。

实施例1  SK23.002号菌株的发酵培养

使用菌株SK23.002，在含L-Arg 0.5%、葡萄糖1%、酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，无机氮源0.1%以及含或不含少量无机盐等，调pH6.0的培养基中，37℃，190 rpm的条件下培养22h，冷冻离心，制得具有精氨酸酶活的静息细胞。

实施例2  转化反应

使用实施例1所得菌体，在含精氨酸质量浓度为50g/L、静息细胞量0.1-10g/L的100mM醋酸缓冲液（HAc-NaAc、pH6.0）中，在37℃下进行转化反应5-40h，合成鸟氨酸。

实施例3  鸟氨酸产量的测定

将实施例2中进行的反应液经灭酶（TCA沉淀）、稀释，通过安捷伦液相色谱仪，分别对精氨酸、鸟氨酸进行定量。分析条件如下：仪器型号：Agilent 1100，色谱柱：（250*4.6）mm  5μm  ODS HYPERSIL，柱温：40℃。

实施例4  新型鸟氨酸产生菌的鉴定

将新型鸟氨酸生产菌送往中国典型培养物保藏中心测定该菌的形态特征、生理生化特性以及16SrRNA基因序列分析，鉴定为Rummeliibacillus pycnus，是安全菌株。

实施例5 鸟氨酸的分离纯化

将转化所得的反应液经脱色后，利用强酸性阳离子交换树脂001×7，用不同浓度的氨水进行洗脱，得到纯化的鸟氨酸。

Claims (2)

1.一株产鸟氨酸的菌株，其分类命名为Rummeliibacillus pycnus，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011466。

2.用权利要求1所述的CCTCC NO：M 2011466菌株发酵生产鸟氨酸的方法，其特征在于，经发酵生产鸟氨酸及通过发酵生产具有精氨酸酶活性的菌体细胞，然后进行全细胞转化反应，合成鸟氨酸；步骤为：

（1）种子培养

种子培养基：L-Arg 1-20g/L，酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-100g/L，无机氮源1.0-20.0g/L，调pH6.0-7.5，去离子水配制；

种子培养条件：CCTCC NO：M 2011466菌株于30-37℃、150-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养10-15h活化该菌株；

（2）发酵培养

发酵培养基：酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖1-100g/L，L-Arg 1-20g/L，无机氮源1.0-20.0g/L，调pH6.0-7.5，去离子水配制；

发酵条件：接种量1%-10%，30-37℃、转速100-500rpm的条件下在发酵培养基中发酵5-72h；

（3）发酵后处理

发酵液经冷冻离心后收集含鸟氨酸的发酵液及含精氨酸酶的湿菌体，并用0.1%的生理盐水和pH6.0的0.1mol/L醋酸盐缓冲液清洗菌体，得静息细胞进行全细胞转化反应，经检测转化率在80%以上；

（4）全细胞转化反应：底物精氨酸浓度10-200g/L，静息细胞量0.1-10g/L，此反应在pH6.0，37℃的条件下转化反应时间5-40h，得到转化后的反应液；

（5）鸟氨酸的分离纯化

将含鸟氨酸的发酵液或转化后的反应液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂001×7，氨水洗脱，进行鸟氨酸分离纯化。