CN105916996A - 测定含水液体中生物的损失的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了一种测定含水液体中光合生物(优选微生物)存活力损失的方法。在一个优选的实施例中，该方法包括生物(优选微生物)在暴露于紫外线辐射后，使用荧光将含水液体中生物的光修复指数与生物(优选微生物)的存活率相关联的步骤，从而测定存活力。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.第119(e)条要求2013年12月20日提交的美国临时申请系列号号61/963，982的的优先权，其内容在此通过引用并入本文。
技术领域
发明领域
总的来说，本发明涉及一种测定含水液体中目标生物(优选微生物)损失的方法。另一方面，本发明涉及荧光在测定生物(优选微生物)存活力损失中的应用，特别是含水液体中生物(优选微生物)存活力损失中的应用。
背景技术
对现有技术的描述
已知在本领域中，可以使用各种导致即刻死亡或延迟死亡的处理方法对含水液体(例如市政污水、市政饮用水、工业废水、来自运输船舶的压载水等)中的微生物进行消毒。使用适当剂量的紫外线辐射(UVR)，如紫外线C(UV-C)辐射进行处理，造成亚致死效应而导致延迟死亡和生殖损伤。通常情况下，这些效应只能通过使用费时的基于培养基的生长实验直接进行评估，其需要花费数天至数月才能完成。
来自运输船舶的压载水的处理受***国际海事组织(IMO)和美国海岸警卫队(USCG)的监管。USCG推荐使用活体染料二乙酸荧光素(FDA)和5-氯甲基二乙酸荧光素(CMFDA)评估处理有效性(ETV 2010)。因此，活体染料被认为可以代表用于快速评估压载水处理有效性的传统方法。
基于荧光素的活体染料(例如FDA和CMFDA)测定待测细胞的细胞膜的完整性和细胞内酯酶的功能性。当用于测定浮游植物存活力时它有很多缺点。例如，该染色方法：
·是依赖于时间的(Dorsey等1989)；
·物种之间是高度多变的(Selvin等1988；Murphy和Cowles 1997；Onji等2000；Agustí和Sánchez 2002；Garvey等2007；Peperzak和Brussaard 2011)；
·随着同一物种生长阶段而变化(Gilbert等1992；Garvey等2007)；和
·可被绿色自发荧光掩蔽和混淆(Tang和Dobbs,，2007；Steinberg等2011)，并且在一些情况下，可被红色叶绿素自发荧光掩蔽和混淆(Agustí和Sánchez 2002；Garvey等2007)。
细胞膜和酯酶均不是UVR损害的主要目标。UV-C处理造成死亡的主要原因被认为是通过对核苷酸的损害(Gieskes和Buma 1997；Sinha和Hader 2002)。这种损害(例如DNA和RNA中的核苷酸的二聚体化)干扰了蛋白质合成中核苷酸复制和转录。FDA/CMFDA染色检测不到这种损害。
结果，由于高假阳性率，基于FDA测定基于UV-C的死亡率是不准确的：被成功处理并且不能繁殖的细胞仍然保留了完整的细胞膜和功能性酯酶，因此可以被FDA染成深色。尽管不能生长和繁殖(在自然环境中功能上无存活力)，但它们被评估为健康-见图1。
处理压载水的目的是防止引入潜在的入侵微生物，可以通过杀灭它们或使其无存活力来完成，即不能繁殖，从而不能在受纳水体中大量繁殖。
在例如国际专利公开号WO2010/130031[Fraser]和国际专利公开号WO2012/061924[DaCosta等]中已经描述了通过UVR处理压载水的应用，UVR处理是一种用于市政饮用水和市政污水消毒的成熟技术。然而，由于UVR主要通过繁殖损害和延迟死亡来发挥作用，而不是通过立即杀死来发挥作用，所以很难评估该微生物技术。一般地，是基于以下两个原因：
·直接测量繁殖率的技术是耗时的，且当施用于自然样品的混合体时，存在不确定性。—微生物存活力直接测量的是繁殖能力，即在培养基中的生长(如通过所谓的长出或再生长方法测定，例如Liebich等2012)。原则上，基于培养的方法例如最大或然数(MPN)技术提供了评估存活力的的黄金标准(cf.Throndsen 1978)。但是它们需要数日至数月来进行，因此这种方法不适于给定运输船舶的压载水处理规定的常规验证。此外，当用在天然存在的浮游生物集合体时，由于某些水生微生物(包括培养条件不佳的异养生物)不能被可靠地培养，因此会引入不可靠性。因此，直接使用MPN不能可靠地测量UVR对它们的存活力的影响。
·UVR作用模式与其它消毒技术不同，因此通常使用的“活与死”测定法大大低估了UVR在防止引入入侵微生物方面的有效性—对于DNA的侵害是UVR处理使微生物失活的主要原因(Gieskes和Buma 1997；Sinha和Hader 2002)。经UVR处理而无存活力的细胞仍然保留某些代谢功能，并且因此当通过活体染色评估时它们仍显示为活的，活体染色目前用于测量压载水处理(ETV 2010)的有效性—见图1。结果，基于活体染色的验证的压载水处理指南—即通过活体染色测定为“活着的(living)”，而不是根据繁殖能力定义的“有存活力的(viable)”—将强加不适当的高剂量设计，而其将导致需要更大的处理***，进而需要更多的能量。
在上述内容的启示下，需要替代基于培养基测定的可靠、快速的方法，但基于活体染色的现有方法不能可靠地检测出由UVR处理造成的延迟死亡和繁殖损害。对于基于测量叶绿素荧光的光合***损害的评估，可以检测到UVR造成的损害，但是仅仅光损害测量不能可靠地指示出死亡率或繁殖损害，部分原因是与光***损害有关的分子目标与DNA复制和蛋白质合成有关的分子目标不同。
因此，迫切需要一种用于更一般的代谢损害的快速检测方法。优选地，该方法与繁殖损害相关，所述繁殖损害通过基于培养基检测存活力而测定。
发明内容
本发明的一个目的是消除或减轻现有技术中的上述缺点中的至少一个。
本发明的另一个目的是提供一种新的方法，用于测定含水液体中的生物存活力损失。
因此，在其中一个方面，本发明提供了荧光的应用，用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
在其另一个方面，本发明提供了荧光的应用，用于测定生物被暴露于辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
在另一个方面，本发明提供了荧光的应用，用于测定生物被暴露于紫外线辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
在另一个方面，本发明提供了可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失中的应用，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
在另一个方面，本发明提供了可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
在另一个方面，本发明提供了可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于紫外线辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
在另一个方面，本发明提供了一种用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失的方法，该方法包括评估生物进行光修复的能力的步骤。
在另一个方面，本发明提供了一种用于测定生物被暴露于应激物后含水液体中生物存活力损失的方法，该方法包括以下步骤：
(a)测量暴露于应激物之前未处理的生物样品的可变荧光(Fv)；
(b)测量暴露于应激物之后经处理的生物样品的可变荧光(Fv)；
(c)使用步骤(a)和(b)中获得的测量值计算光修复指数；
(d)将步骤(c)中计算得到的光修复指数与生物归一化存活力相关联。
在另一个方面，本发明提供了一种用于测定含水液体中生物存活力损失的***，该***包括：
(a)用于接收含水液体样品的样品壳体；
(b)被配置用于测量含水液体中生物的荧光的仪器；
(c)计算机元件，被配置用于将生物暴露于应激物后含水液体中生物的光修复指数与生物存活率相关联。
本发明的发明人发现，对光合修复过程的损害的测量值可以作为生物优选微生物的总体代谢损害和存活力损失的良好的代理。因此本发明人开发了一种针对光合***损害及对于该损害的修复的快速测定方法，优选基于荧光测定，更优选基于可变荧光，最优选基于可变叶绿素荧光。本发明人构建了基于该测量值的指数，其能够用于可靠地预测经UV-C处理的光合微生物的存活。通过将基于荧光的光损害检测扩展至量化光***的损害及其修复(其依赖于蛋白质合成)，从而建立一种快速、灵敏的评估整体代谢损害和存活力损失的方法。这代表对上述现有技术中评估光合***损害方法的一个改进，上述现有技术中的方法不能像本检测方法那样可以作为UV-C处理后存活力损失的可靠的指示。
从一般的角度来看，将生物暴露于所谓的应激物后，评估对生物的光合修复过程的损害。如本说明书通篇所使用的，术语“应激物”具有广泛的含义，并旨在包括能够对生物引起刺激的试剂、条件或其它刺激物。在一个优选的实施例中，应激物选自于由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存和它们的任意组合。在另一个优选的实施例中，该应激物是紫外线辐射例如UV-C辐射。
因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及一种对含有生物的含水液体进行UV-C处理后，在操控周围光环境期间测量荧光的方法。该优选的实施例涉及对光合生物的代谢损害的快速评估方法，作为存活力损失的测量方法，该方法明显比基于活体染色或直接单独测定荧光参数的方法更加准确。
因此，本发明涉及一种用于评估光合生物(优选微生物)存活力损失的快速、可靠的方法，该方法可有利地应用于评价施加于这些生物上的消毒处理或其它刺激(stress)。
附图说明
本发明的实施方式将参照附图进行描述，其中相同的附图标记代表相同的部件，并且其中：
图1表示在三种微藻(威氏海链藻、赤潮异弯藻和等鞭金藻)培养中，由UV-C诱导的死亡率(可变细胞个数的log10减少量)的比较，通过基于培养的实验和通过使用FDA染色评估所述死亡率；
图2表示三种微藻培养(威氏海链藻、赤潮异弯藻和等鞭金藻)的剂量-响应曲线，及处理后测定的由MPN实验测定的存活力和可变荧光参数Fv之间的关系；
图3表示三种微藻培养(威氏海链藻、赤潮异弯藻和等鞭金藻)的剂量-响应曲线(左)，及处理后立即测量的由MPN实验测定的存活力和光修复指数(PRI)之间的关系(右)；
图4表示基于强光和弱光强度下的连续培养，测定PRI输入参数的实施例—对使用UVR处理前(未处理)和处理后(经处理)的样品进行测量得到Fv(在每种情况下，均将暗适应样品暴露于强光及接着一段时间的弱光，在此期间测得Fv)；
图5表示基于含有或不含叶绿体蛋白质合成抑制剂在强光下的平行培养，测定PRI的输入参数的实施例—在该情况下，抗菌素林可霉素用作抑制剂(对使用UVR处理前(未处理)和处理后(经处理)的样品进行测量得到Fv，并且在每种情况下，均将含有或不含蛋白质合成抑制剂的平行培养的暗适应样品暴露于强光)；
图6表示实施本方法实施例1的示意图；和
图7表示实施本方法实施例2的示意图。
具体实施方式
本发明涉及下列独立的应用：
荧光的应用，用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
荧光的应用，用于测定生物被暴露于辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
荧光的应用，用于测定生物被暴露于紫外线辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于紫外线辐射后在含水液体中的生物存活力损失，该应用包括评估生物进行光修复的能力。
这些应用优选的实施例包括以下特征的任意一种或任意两种或多种的组合：
·应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存及它们的任意组合；
·辐射是UV-C辐射；
·紫外线辐射的波长范围为约100nm至约280nm；
·生物是微生物；
·含水液体是水；和/或
·含水液体是来自运输船舶的压载水。
在另一个方面，本发明涉及一种用于测定生物被暴露于应激物后含水液体中生物存活力损失的方法，该方法包括评估生物进行光修复的能力的步骤。这些应用优选的实施例可能包括以下特征的任意一种或任意两种或多种的组合：
·应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存及它们的任意组合；
·应激物是紫外线辐射；
·应激物是UV-C辐射；
·应激物是波长范围为约100nm到约280nm的紫外线辐射；
·评估步骤包括对生物执行荧光测试；
·评估步骤包括对生物执行可变荧光测试；
·生物是微生物；
·含水液体是水；和/或
·含水液体是来自运输船舶的压载水。
在另一个方面，本发明涉及一种用于测定生物被暴露于应激物后含水液体中生物存活力损失的方法，该方法包括生物被暴露于应激物后，将含水液体中生物的光修复指数与生物的存活相关联的步骤。这些应用优选的实施例可能包括以下特征的任意一种或任意两种或多种的组合：
·应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存及它们的任意组合；
·应激物是紫外线辐射；·应激物是UV-C辐射；
·应激物是波长范围为约100nm到约280nm的紫外线辐射；
·光修复指数是通过对生物进行荧光测试而计算得到的；
·光修复指数是通过对生物进行可变荧光测试而计算得到的；
·生物是微生物；
·含水液体是水；和/或
·含水液体是来自运输船舶的压载水。
在另一个方面，本发明涉及一种用于测定生物被暴露于应激物后含水液体中生物存活力损失的方法，该方法包括以下步骤：(a)测量暴露于应激物之前未处理的生物样品的可变荧光(Fv)；(b)测量暴露于应激物之后经处理的生物样品的可变荧光(Fv)；(c)使用步骤(a)和(b)中获得的测量值计算光修复指数；(d)将步骤(c)中计算得到的光修复指数与生物归一化存活力相关联。这些应用优选的实施例可能包括以下特征的任意一种或任意两种或多种的组合：
·步骤(a)包括下列情况中的一种以上：(i)测量暴露于应激物之前未处理的生物样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(0)未处理；(ii)在辐射存在下、以第一强度培养未处理样品，以诱导Fv由Fv(0)未处理产生预定的减少量；(iii)在步骤(ii)后测定未处理的样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(1)未处理；(iv)在辐射存在下、以第二强度培养未处理样品，以诱导光修复，及Fv由Fv(1)未处理的增加；以及(v)在步骤(iv)后测量未处理的样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(2)未处理；
·步骤(ii)进行约10分钟至约120分钟；
·所述第一强度是在约2μmol光子m-2s-1至约4000μmol光子m-2s-1的范围内；
·步骤(ii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品；
·步骤(ii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长；
·在步骤(ii)所述的Fv的预定的减少量是在约20％至100％的范围内；
·在步骤(ii)所述的Fv的预定的减少量是在约30％至80％的范围内；
·在步骤(ii)所述的Fv的预定的减少量是在约35％至55％的范围内；
·步骤(iv)持续约30分钟至约240分钟；
·所述第二强度是在约1μmol光子m-2s-1至约100μmol光子m-2s-1的范围内；
·所述第二强度是在约10μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1的范围内；
·步骤(iv)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述辐射波长为从约400nm至约700nm；
·步骤(iv)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长；
·步骤(ii)和步骤(iv)使用实质上相同的辐射；
·步骤(b)包括下列情况中的一种或多种：(i)在光合有效辐射存在下、以第一强度培养经处理的样品，以诱导Fv由Fv(0)未处理产生预定的减少量；(ii)在步骤(ii)后测定经处理的样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(1)经处理；(iii)在辐射存在下、以第二强度培养未处理的样品以诱导光修复及Fv由Fv(1)经处理的增加；以及(iv)在步骤(iii)后测定经处理的样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(2)Untreated；
·步骤(i)进行约10分钟至约120分钟；
·所述第一强度是在约2μmol光子m-2s-1至约4000μmol光子m-2s-1的范围内；
·步骤(i)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述辐射波长为从约400nm至约700nm；
·步骤(i)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长；
·步骤(ⅲ)进行约30分钟至约240分钟；
·所述第二强度是在约1μmol光子m-2s-1至约100μmol光子m-2s-1的范围内；
·所述第二强度是在约10μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1的范围内；
·步骤(iii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述辐射波长为约400nm至约700nm；
·步骤(iii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长；
·步骤(i)和步骤(iii)使用实质上相同的辐射；
·步骤(c)包括使用下列等式之一计算光修复指数：
或
或
·生物是微生物；
·含水液体是水；和/或
·含水液体是来自运输船舶的压载水。
在一个方面，本发明涉及荧光在测定含水液体中生物(优选微生物)存活力损失中的应用，所述荧光优选可变荧光，更优选可变叶绿素荧光。
通过可变叶绿素荧光(Fv)的灵敏的检测方法，可以快速检测光合***的损害。这可以通过例如使用具有调制激发器的荧光计来实现，所述荧光计包括例如泵和探针、PAM、FRRF或FIRe荧光计(例如Genty等1989；Schreiber等1995；Gorbunov和Falkowski 2004)。当与电子传递抑制剂例如3-(3，4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲共同使用时，可以通过使用具有恒定激发器的荧光计评估Fv(Cullen等1986；Vincent 1980)。
虽然被建议作为评估基于UV-C损伤的手段(First和Drake 2013b)，但Fv独自并不是光合微生物的延迟死亡和繁殖能力损伤的有效代表。光合***损伤的主要目标分子与UV-C-杀灭不同，且在荧光变化和存活力损失之间的关系上具有物种和生长条件之间的显著的可变性(例如Campbell等1998；Xiong 2001；Bouchard等2005；Bouchard等2008；Key等2010)。图2表示Fv独自不能用来可靠预测基于UV-C的死亡率。
由紫外线辐射(UVR)造成的对光合***的损害被修复机制抵消。这些涉及蛋白质合成以及，以及如果将细胞暴露于可见光中，还涉及减轻暴露期间的损害和恢复暴露后的光合能力(Vasilikiotis和Melis 1994；Neidhardt等1998；Adir等2005)。因此修复机制是UVR诱导的损伤和死亡的主要目标之一；来自UV-C的对光合修复机制的损害与导致代谢损害和繁殖能力损失的更普遍的对核苷酸的损害同时发生。本发明人发现光合修复过程的损害的测量值可以作为普遍的代谢损害和存活力损失的良好代表。
本发明人基于叶绿素荧光的测量值，开发了一种快速检测光合***损伤及修复该损伤的方法。如下面将进一步讨论的，本发明人已证实，基于这些测量值的指数能够用于可靠地预测经UV-C处理的光合微生物的存活率。在这方面，本发明人发现现有技术中仅凭借光合成的损害评估，不是UV-C处理后的存活力损失的可靠指示。
因此，本发明人提出了一种在UV-C处理后，在操控周围光环境期间测量荧光的方法。在一个优选的实施例中，它是一种快速评估光合生物的代谢损害的方法，作为存活力损失的测量，其相比基于活体染色或直接单独测定荧光参数的方法明显更准确。
优选通过使用带有调制激发器的荧光仪，如泵和探针、脉冲幅度调制(PAM)荧光计、快速重复率荧光计(FRRF)，荧光诱导和弛豫(FIRe)等，或通过使用具有恒定激发强度的荧光仪，其与电子传递抑制剂如3-(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲共同使用，测量可变叶绿素荧光，Fv(即，最大荧光(Fm)减去起始荧光(F0))。根据所使用的特定仪器的制造商说明进行数据收集步骤。
为了优化Fv测量值的准确度，优选在每次测量荧光前，将每个样品均进行一段足以恢复光化学淬灭的时间的暗适应处理。
优选地，对未处理的样品和经刺激(stress)处理后的一个或多个样品，评估其Fv随时间的变化。
在优选的实施例中，该刺激是以暴露于UV-C辐射的形式-如图6的示意图所示。
优选地，对未处理的样品和经处理的样品进行相同的实验方案。优选地，所有样品都维持在与其母体条件相对应的温度(即，从它们被收集的水体的温度)。
优选地，在随后连续辐照条件下进行的评估过程期间测定Fv。
首先，照射之前将样品进行暗适应，并测量Fv。如果是未处理的样品，此处记作Fv(0)未处理。
然后培养样品，优选在可见光下，辐照度足够高且培养样品一段足够长的时间以诱导未处理的样品的Fv产生指定或预定的减少(例如50％)。例如，该样品可以被暴露于光合有效辐射下约10分钟至约120分钟的时间，所述光合有效辐射的强度为约2μmol光子m-2s-1至约4000μmol光子m-2s-1。优选地，辐照的波长范围主要是约400nm至约700nm的波长。UV-B和UV-A辐射(约280至400nm)可以交替使用。用于此目的的合适的辐射源的非限制性例子选自于氙灯、石英卤素灯、荧光灯、发光二极管及其类似物。如将在下面进一步提出的，培养结束时的Fv值，作为一个单点值或由拟合时间序列的测量值的等式进行测量，被命名为Fv(1)。
随后该样品在较低辐照下培养，但该辐照仍然足够高至允许最后的(net)光修复和Fv的恢复。例如，在具有从约10μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1强度的PAR下，培养样品约30分钟至约240分钟。优选地，辐照的波长范围主要是约400nm至700nm，并且可通过例如使用在前文所述的辐射源得到。培养结束时Fv的值，作为一个单点值或由拟合时间序列的测量值的等式进行测量，被命名为Fv(2)。
光修复指数(PRI)是基于经处理的样品的Fv相对未处理的样品的起始Fv或恢复的Fv的比例：
或
或
其中Fv(1)和Fv(2)如上述定义，未处理指未暴露于处理如UVR的对照样品，经处理指UV处理后的样品，以及Fv(0)指任何处理前的样品。
在本发明的替代实施例中，也可以在经含有和不含叶绿体蛋白质合成抑制剂(例如抗生素，如链霉素、林可霉素、阿奇霉素等)处理而因此不能进行光修复的平行培养中测量Fv；结果可用来验证损害与修复的阐释-按图7所示。
当与蛋白质合成抑制剂进行测定时，再次优选未处理和经UVR-处理(经处理)的样品进行相同的检测步骤。优选地，该实验步骤如下所示。
将样品混合并分成两个等分试样。一等分试样用适当剂量的蛋白质合成抑制剂(例如，200-1000g l-1的林可霉素)处理。
未处理的样品是对照。在检测温度下，两个样品在黑暗中培养一段时间，至少约10分钟，更优选至少约15分钟，最优选20分钟。
对照射前测定未处理对照和经抗生素处理的子样品的Fv起始。
然后将两个子样品在足够高辐射下培养一段足够长的时间，以诱导未处理子样品产生指定或预定的减少(例如50％)-例如，使用上述时间期限和辐射强度。
光修复指数(PRI)是基于对照和经蛋白质合成抑制剂处理的子样品之间Fv的下降率的差异。优选地，下降率的特征在于拟合为一阶模型，如：
Fv，t＝Fv，起始·exp(-kt) (等式4)
其中Fv,t是在暴露于强光期间时间t的Fv，Fv,起始是暴露于强光前的Fv，和k是用于评估被抑制的和未被抑制的子样品(k被抑制，k对照)的一阶速率常数。等式4可被修改为包括Fv,∞，Fv,∞是Fv的非零渐近值。
Fv，t＝Fv，起始·exp(-kt)+Fv，∞ (等式5)
在任一种情况下，PRI计算为经处理的(例如用紫外线辐射)子样品和未处理的样品的被抑制和未被抑的速率常数之间的差异的函数
其中kI被抑制和kC对照分别是经蛋白质合成抑制剂处理后的子样品和对照子样品的速率常数，并且其中经处理指UVR处理后的样品，和未处理指未经受任何处理前的样品。
光修复指数与生存率的可能性有关，其是通过将微生物暴露于UVC的实验测定的，并且检测通过基于培养实验(例如最大或然数，MPN，图1-3)测定的PRI和存活力降低。
本申请的优选实施例将参考以下例子进行说明，其不视为对本发明范围的解释或限制：
实施例1
在实施例中使用海洋微藻培养基。这些可由Provasoli-Guillard国家海洋微藻中心(东布斯贝，缅因州，美国)获得，并且在18℃下以12:12L:D(明期：暗期)的循环维持在弱光强度中。
照明由具有80μmol光子m-2s-1PAR强度的冷白荧光灯泡提供。
通过每天用新鲜培养基稀释使得培养物在恒定浓度下，维持在营养充分的平衡生长中(MacIntyre和Cullen 2005)。每天使用10-AU荧光计(Turner Designs，圣何塞，加利佛尼亚州，美国)和FIRe荧光计(Satlantic，哈利法克斯，新斯科舍省，加拿大)监控培养物的暗适应叶绿素α荧光。两种荧光计每日调零，并且荧光被校正至200μM罗丹明标准。
根据假定的指数增长的前24h的荧光的稀释校正的变化计算每日比生长率(μ，d-1)(MacIntyre和Cullen 2005)。使用MATLAB常规Fireworx 1.0.4(Barnett)拟合通过FIRe测量的单成交荧光诱导曲线从而预测最小和最大荧光(F0和Fm，Arb.)、可变荧光(Fv＝Fm-F0，Arb.)及光***II电子传递的量子效率(Fv/Fm,，无量纲)。当十代的最小值的μ和Fv/Fm的变异系数(C.V.)小于10％时，培养物被认为处于平衡生长。
平衡生长的培养物暴露于规定剂量的UV-C辐射，该辐射由传统低压准直光束源提供(Bolton和Linden 2003)。培养物在位于UV光束下的中心位置的反应容器(直径50mm，深25mm)中以50毫升等分试样被照射。在分剂量过程中使用微型磁搅拌棒搅拌培养物(约每分钟60转数)，以确保剂量的均匀应用。
UV光束的强度可通过NST-可追踪ILT1700辐射计(International Light Technologies，皮博迪，马萨诸塞州，美国)进行测量。确认反应容器表面的暴露均匀性为<5％(C.V.)，其是通过测量与反应容器中心对齐的垂直轴每5mm间隔的光束强度。使用UV254系列“P”测量仪(RealTech，惠特比市，安大略省)测量254nm光通过培养物的光束衰减。通过应用Lambert-Beer定律，根据254nm的入射强度和衰减计算反应容器中的平均剂量。通过计算合适的暴露持续时间来设置剂量，因为剂量(mJ cm-2)是反应容器平均强度(mW cm-2)和暴露持续时间(s)的产物。
根据先是弱辐射随后使用光抑制PAR光环境的Fv恢复，计算光修复指数-参见图4。呈指数增长的培养物被分为两份。第一份，未处理样品，被立即检测；第二份经处理样品，其在检测前通过UV-C照射。
两个样经受相同的测试条件。每一个进行最少20分钟的暗适应，以允许恢复光化学淬灭和短暂的荧光淬灭至弛豫。在该时期结束后得到子样品，并使用FIRe荧光仪测定Fv。样品的其余部分在550μmol光子m-2s-1的光合有效辐射(PAR，400nm-700nm)的照射下培养60分钟。
将样品置于处于生长温度下的水冷式多支管中，其由可编程的暖白光LED阵列(Photon Systems International，布尔诺，捷克)照射。以每10分钟间隔移除子样品，并在测定Fv.前进行最少20分钟的暗处理。这些在图4中被命名为“强光”样品。
在暴露于强光后，在生长温度下，通过相同LED阵列，剩余样品在PAR为20μmol光子m-2s-1的辐射下被培养。每15分钟间隔移除子样品，并且为了测定Fv进行最少20分钟暗处理。这些在图4中被命名为“弱光”样品。
针对每个未处理和经处理的样品，通过拟合Fv在两种不同方案下随着时间的动力学变化得到一组PRI的输入参数，结果如图4所示(几种不同处理的结果如图3所示)。
实施例2
在本实施例中，通过实施含有和不含抗生素林可霉素(一种叶绿体蛋白质合成抑制剂)的光抑制光照方案期间的Fv损失的差异计算光修复指数-参见图5。
呈指数增长的培养物分成两份。第一份，未处理样品，被立即检测；第二份经样品在检测前通过UV-C被照射。
然后将未处理和经处理的样品再分为对照和经抗生素-处理的子样品。对照样品不需做进一步修改而被检测。经抗生素-处理的样品使用最终浓度为500μg ml-1的林可霉素含水液体进行处理，然后在生长温度下，在黑暗中培养10分钟以允许其摄取抗生素。
随后，全部四个样品经受相同的试验条件。首先每个样品进行至少20分钟的暗适应，以允许短暂的荧光淬灭至弛豫。在该时期结束后得到子样品，并使用FIRe荧光仪测定Fv。样品的其余部分在550μmol光子m-2s-1的光合有效辐射(PAR，400nm-700nm)的照射下培养60分钟。将样品置于处于生长温度下的水冷式分支管中，其由可编程暖白光LED阵列(Photon Systems International，布尔诺，捷克)照射。每10分钟间隔移除子样品，并在测定Fv.前进行最少20分钟的暗处理。这些在图5中被命名为“强光”样品。
针对每个未处理和经处理的样品，通过拟合Fv在对照和经抗生素处理的子样品中随着时间的动力学变化得到一组PRI的输入参数。
实施例3
在培养基被UV-C处理后，通过最大或然数法(MPN)检测法评估培养基的存活力(Cochran 1950；Blodgett 2005a,b)。
因此，用新鲜生长培养基将培养物稀释成3种log间隔的系列(例如10-1、10-2和10-3)。在初步的范围-发现实验中，测定任意UV-C剂量的合适的稀释范围。
对于每种培养物，将每种稀释样品平行五份然后在最适宜生长的辐射和温度下培养(通常PAR为160μmol光子m-2s-1和22℃)，并且使用10-AU荧光计每隔48小时监测生长状况。如果荧光以超过检测极限(Anderson 1989)或起始荧光读数的一个数量级方式增长，无论哪个更高，试管(Tubes)被评分为阳性。
然后由查询(look-up)表获得活细胞的最大或然数(Blodgett 2010)，并且由每管的培养物体积和所使用的稀释范围将最大或然数转换为浓度。由MPN分析获得的活细胞的浓度被用于构建对于UV暴露的剂量-响应曲线和用于比较PRI-参见图3。如从图3中所见，物种之间响应的相似性和相对宽的动态范围优于如图1和2所示基于活体染色的检测和Fv。
虽然本发明已经参照说明性的实施例和例子进行描述，该描述并不能解释为限制意义。因此，参考本说明书，对说明性实施例以及本发明其它实施例的各种变型对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，虽然本发明的一个优选实施例涉及荧光在测定含水液体中生物(优选微生物)存活力损失中的应用，但也有可能将此优选实施例用于荧光在测定其它非含水液体中生物(优选微生物)存活力损失中的应用-例如从过滤器中被分离的或从它们通常存在的培养基中移除的生物(优选微生物)。因此修改图6所示的示意图、使其包括先于暗处理的过滤器元件或其它生物(优选微生物)分离元件或检测器元器件是可能的。因此，可以想到所附权利要求涵盖任意的这种变型或实施例。
在此所引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用的方式而全部并入，其等同于每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地通过引用而全部并入。
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Claims (65)
1.荧光的应用，用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失，所述应用包括评估生物进行光修复的能力。
2.荧光的应用，用于测定生物被暴露于辐射后在含水液体中的生物存活力损失，所述应用包括评估生物进行光修复的能力。
3.荧光的应用，用于测定生物被暴露于紫外线辐射后在含水液体中的生物存活力损失，所述应用包括评估生物进行光修复的能力。
4.可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失，所述应用包括评估生物进行光修复的能力。
5.可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于辐射后在含水液体中的生物存活力损失，所述应用包括评估生物进行光修复的能力。
6.可变荧光的应用，用于测定生物被暴露于紫外线辐射后在含水液体中的生物存活力损失，所述应用包括评估生物进行光修复的能力。
7.如权利要求1或4所述的应用，其中所述应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存和它们的任意组合。
8.如权利要求2或5所述的应用，其中所述辐射是UV-C辐射。
9.如权利要求1-8中任一项所述的应用，其中所述应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存和它们的任意组合。
10.如权利要求3或6所述的应用，其中所述紫外线辐射的波长范围是约100nm至约280nm。
11.如权利要求1-10中任一项所述的应用，其中所述生物是微生物。
12.如权利要求1-11中任一项所述的应用，其中所述含水液体是水。
13.如权利要求1-11中任一项所述的应用，其中所述含水液体是来自运输船舶的压载水。
14.一种用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失的方法，所述方法包括评估生物进行光修复的能力的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存和它们的任意组合。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述应激物是紫外线辐射。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述应激物是UV-C辐射。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述应激物是波长范围为约100nm至约280nm的紫外线辐射。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述评估步骤包括对所述生物进行荧光检测。
20.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述评估步骤包括对所述生物进行可变荧光检测。
21.如权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述生物是微生物。
22.如权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述含水液体是水。
23.如权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述含水液体是来自运输船舶的压载水。
24.一种用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失的方法，所述方法包括在生物被暴露于应激物后，将含水液体中生物的光修复指数与生物的存活率相关联的步骤。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述应激物选自由以下构成的组：暴露于化学试剂、暴露于机械能、热冲击、避光贮存和它们的任意组合。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述应激物是紫外线辐射。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述应激物是UV-C辐射。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述应激物是波长范围为约100nm至约280nm的紫外线辐射。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述光修复指数通过对生物进行荧光检测而计算得到。
30.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述光修复指数通过对生物进行可变荧光检测而计算得到。
31.如权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述生物是微生物。
32.如权利要求24-31中任一项所述的方法，其中所述含水液体是水。
33.如权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述含水液体是来自运输船舶的压载水。
34.一种用于测定生物被暴露于应激物后在含水液体中的生物存活力损失的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)测量暴露于应激物之前未处理的生物样品的可变荧光(Fv)；
(b)测量暴露于应激物之后经处理的生物样品的可变荧光(Fv)；
(c)使用步骤(a)和(b)中获得的测量值计算光修复指数；和
(d)将步骤(c)中计算得到的光修复指数与生物归一化存活力相关联。
35.如权利要求34所述的方法，其中步骤(a)包括下列中的一种以上：
(i)测量暴露于辐射之前未处理的生物样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(0)未处理；
(ii)在辐射存在下，以第一强度培养未处理的样品，以诱导Fv相对Fv(0)未处理产生预定的减少量；
(iii)在步骤(ii)之后测定未处理的样品的可变荧光(Fv)从而得到Fv(1)未处理；
(iv)在辐射存在下，以第二强度培养未处理的样品，以诱导光修复以及Fv相对Fv(1)未处理增加；以及
(v)在步骤(iv)之后测量未处理的样品的可变荧光从而得到Fv(2)未处理。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述步骤(ii)进行约10分钟至约120分钟。
37.如权利要求35-36中任一项所述的方法，其中所述第一强度的范围是在约2μmol光子m-2s-1至约4000μmol光子m-2s-1。
38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品。
39.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长。
40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中Fv的所述预定的减少量是在约20％至100％的范围内。
41.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中Fv的所述预定的减少量是在 约30％至80％的范围内。
42.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中Fv的所述预定的减少量是在约35％至55％的范围内。
43.如权利要求35-42中任一项所述的方法，其中所述步骤(iv)进行约30分钟至约240分钟。
44.如权利要求35-43中任一项所述的方法，其中所述第二强度是在约1μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1的范围内。
45.如权利要求35-43中任一项所述的方法，其中所述第二强度是在约10μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1的范围内。
46.如权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述步骤(iv)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品。
47.如权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述步骤(iv)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长。
48.如权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述步骤(ii)和步骤(iv)使用实质上相同的辐射。
49.如权利要求35-48中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)包括下列中的一种以上：
(i)在光合有效辐射存在下，以第一强度培养经处理的样品，以诱导Fv相对Fv(0)未处理产生预定的减少量；
(ii)在步骤(ii)之后测量经处理的样品的可变荧光从而得到Fv(1)经处理；
(iii)在辐射存在下，以第二强度培养未处理的样品以诱导光修复以及Fv相对Fv(1)经处理的增加；以及
(iv)在步骤(iii)之后测量经处理的样品的可变荧光从而得到Fv(2)经处理。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述步骤(i)进行约10分钟至约120分钟。
51.如权利要求49-50中任一项所述的方法，其中所述第一强度是在约2μmol光子m-2s-1至约4000μmol光子m-2s-1的范围内。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述步骤(i)包括在光合有效辐射存在 下培养所述未处理的样品。
53.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述步骤(i)包括在光合有效辐射存在下培养所述未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长。
54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其中步骤(ⅲ)进行约30分钟至约240分钟。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述第二强度是在约1μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1的范围内。
56.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述第二强度是在约10μmol光子m-2s-1至约50μmol光子m-2s-1的范围内。
57.如权利要求49-56中任一项所述的方法，其中所述步骤(iii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品。
58.如权利要求49-56中任一项所述的方法，其中所述步骤(iii)包括在光合有效辐射存在下培养未处理的样品，所述光合有效辐射具有实质上在约400nm至约700nm范围内的一种以上波长。
59.如权利要求49-58中任一项所述的方法，其中步骤(i)和步骤(iii)使用实质上相同的辐射。
60.如权利要求35-59中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括使用下列等式之一计算光修复指数：
或
或
61.如权利要求35-60中任一项所述的方法，其中所述生物是微生物。
62.如权利要求35-61中任一项所述的方法，其中所述含水液体是水。
63.如权利要求35-61中任一项所述的方法，其中所述含水液体是来自运输船舶的压载水。
64.用于测定含水液体中的生物存活力损失的***，所述***包括：
(a)用于接收含水液体样品的样品壳体；和
(b)被配置用于测量含水液体的荧光的荧光计；和
(c)计算机元件，被配置用于将生物暴露于应激物后含水液体中生物的光修复指数与生物存活率相关联。
65.如权利要求64所述的***，其中所述***被配置用于实施如权利要求14-63中任一项所述的方法。
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