CN1122147A - 快速大肠杆菌类检测*** - Google Patents
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Abstract
一种快速测定样品中是否存在粪便大肠杆菌类细胞的方法。将原始样品部分过滤并保留在微孔滤器上，在具有含荧光源底物的启动培养基的培养容器中放入微孔滤器。按约20分钟至6小时预定的时间长度培养样品。将pH值调至碱性水平，照射容器并测量所发射的荧光。用背景荧光值调整测量的荧光值，并用外源荧光值校正，当经校正的荧光值是正的且达到某一预定的标准时，可得出结论；在原始样品中存在粪便大肠杆菌类细胞(即，每100毫升样品中至少有一个粪便大肠杆菌类细胞)。
Description
本申请是申请日为1991年2月8日的美国申请号为07/653,869的部分继续申请，而07/653,869号申请是现在已放弃的美国申请号为07/117,481(申请日为1987年11月5日)的继续。
技术背景
本发明涉及检测人类消费或使用产品中的微生物之快速方法，更具体地说(但不是以限定的方式)，涉及检测水源中是否存在粪便大肠杆菌类细菌。
由于报道了许多水源性疾病的病例，U.S.EPA于1991年颁布了新法规，要求更严格地监测饮水的卫生质量。在世界范围内同样存在这一问题。在发展中国家中，估计80％的发病率和33％的死亡率由恶劣的水卫生质量引起。在检测水卫生质量的快速方法市场上，本发明的结果具有实质性的发展。
尽管迫切和随时需要对水质量进行快速监测和控制，但是自从70年前引用“细菌大肠杆菌”作为指示剂后，仅取得了很少的改进。当前使用的对“大肠杆菌组”的检测方法一般仍需24-48小时的培养。
很明显，依赖于使用或供给一种安全的水质量的产业(例如，水、食品、饮料、药品和能源)需要对卫生变化作出快速反应，以便能立即采取行动。
另外的市场方面是军队，在战争和自然灾害条件下，需要不断监测和鉴定安全饮水质量并防止细菌战争。这对于军事野外作战，或负责公众卫生的军事人员处理公民紧急事件情况下尤其关键。
市场调查表明，在饮水产业中存在下列市场容量：
斯堪的纳维亚：每年650到850000次试验；
EEC：每年6000到8000000次试验；
世界范围：每年高达20000000次试验。
使用改进的技术和由于水产业中内部质量控制中心的增多可能增大市场的容量。
使用膜过滤(MF)或最大可能数(MPN)技术的评估水卫生质量的标准方法需要24到72小时完成。人们认识到这浪费的时间太长而不能对低于法定标准的质量提供警戒和防止衰弱或威胁生命的疾病的发生。根据参考的标准方法(美国公共卫生协会，1989，检查水和废水的标准方法，第17版，美国公共卫生协会，华盛顿，D.C)，依据不同的检测原理，有许多种快速方法。然而，这些方法一般要么缺乏灵敏性，要么需要相当长的时间而限制了真正快速检测的可能性。因此，需要一种快速检测样品中粪便大肠杆菌类之存在的***。本文所用的术语“存在”定义为每100毫升样品中出现1个或更多粪便大肠杆菌类细胞。
本发明概述
本发明的内容之一包括一种当每100毫升原始液体或液化样品中至少含一个粪便大肠杆菌类细胞时用于检测所述细胞存在-不存在的方法。原始样品或液体样品分成几部分(例如3部分)，过滤每个部分以便将存在于样品中的微生物滞留在滤器上。
按这种方法，原始样品的第一部分通过第一滤器过滤，原始样品的第二部分通过第二滤器过滤，原始样品的第三部分通过第三滤器过滤，等等。
提供了含有用于产生荧光产物的荧光源底物的启动培养基。还提供第一、第二、和第三样品的样品容器以及与样品同时进行的对照之对照容器。每个容器都含有预定数量的启动培养基。过滤后，第一个滤器放入装入第一个样品容器的启动培养基中，第二个滤器放入装入第二个样品容器的启动培养基中，第三个滤器放入装入第三个样品容器的启动培养基中。
提供了具有热传递介质的培养箱，所述的介质与设置在培养箱中的每个容器保持密切物理接触。第一样品容器和第一对照容器培养一段短的第一时间长度。几乎同时开始，第二样品容器和第二对照容器培养一段第二时间长度，第三样品容器和第三对照容器培养一段第三时间长度。
经过短的第一时间长度后，第一样品容器的内容物和第一对照容器的内容物的pH调成碱性pH。同样地，第二时间长度后，第二样品容器的内容物和第二对照容器的内容物调成碱性pH，第三时间长度后第三样品容器的内容物和第三对照容器的内容物调成碱性pH。
样品容器和对照容器的pH调过后，用预定激发波长的光照射样品和对照容器。经过分别照射后，第一样品荧光值从第一样品容器中测量，第一对照荧光值从第一对照容器中测量。同样地，第二样品荧光值从第二样品容器中测量，第二对照荧光值从第二对照容器中测量，第三样品荧光值从第三样品容器中测量，第三对照荧光值从第三对照容器中测量。
第一对照荧光值和第一样品荧光值用于产生一个校正因子。然后，第二对照荧光值用于调整第二样品荧光值以得到一个调整的第二样品荧光值，第三对照荧光值用于调整第三样品荧光值以得到一调整过的第三样品荧光值。然后，校正因子用于校正调整过的第二样品荧光值以得到校正过的第二样品荧光值，校正因子用于校正调整过的第三样品荧光值以得到校正过的第三样品荧光值。
当校正过的第二样品荧光值为正的，校正过的第三样品荧光值是正的并超过校正过的第二样品荧光值时，得出的结论是每100毫升原始样品至少含一个粪便大肠杆菌类细胞。
附图说明
图1是显示如何使用本发明的方法将样品分成等分试样，过滤和在44.5℃下培养进行检测的图解。
图2是对本发明7小时直接计数法与24小时mFC标准方法的比较。符号代表不同的水来源。(+)Nidelva(Trondheim，Norway)，(c)稀释的未加工过的污水(Trondheim Norway)，(■)Akerselva(Oslo，Norway)，(O)供水设备，(Kathmandu，Nepal)。
图3显示了4-甲基-伞形酮浓度与荧光单位间的相关性。
图4显示了由未处理过的污水污染的饮用水中的大肠杆菌类从4-MU-β-D-半乳糖苷生成MU(O)；乳糖加入后增强了β-D-半乳糖苷酶的诱导作用(O)；加入十二烷基硫酸钠(一种去污剂)后，进一步增强活性( )；酶试验温度为41.5℃。
图5是显示培养时间对含3个粪便大肠杆菌类细胞浓度的样品荧光强度的例图。
图6是显示培养时间对含3个粪便大肠杆菌类细胞浓度的样品荧光强度的另一例图。
优选实施方案描述
本发明依赖于一种或两种产生荧光产物(4-甲基伞形酮)的荧光源底物(4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷和4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸)的酶促水解。可用标准荧光计定量测定水解速率或总荧光。
本发明的方法能适应于使用三列或连续的试验来检测大肠杆菌类污染。以这一方式，一种快速甄别阶段能在20-30分钟内鉴定出严重污染的水样品。在第二阶段，能在1到6小时内鉴定出以每100ml中至少一个大肠杆菌类细胞水平存在的轻度污染水样品。第三，在大约7小时内得到直接菌落计数以证实早期结果。图1是使用第二和第三阶段的方法的图解。
在实际应用中，小如2个的样品，但一般是4到10个的重复实验样品被过滤并在大约44.5℃±.2℃下培养。经过各种预定的培养时间后，依次取出样品以进行快速甄别或得出存在-不存在的结论。在优选的实施方案中培养期间同时进行。早期检测不出粪便细胞的存在可能影响在琼脂培养基上继续培养以进行微生物菌落直接计数之样品的选择性第三分析(直到大约经历了7小时的培养后进行)。消耗的总时间，甚至包括直接计数和样品过滤和资料的获得的时间一般不会超过7小时。
图2显示了使用本发明方法的6小时直接计数和标准方法的24hm-FC方法之间的相关性。大多数资料来自对挪威表层水的试验。该方法的例外是尼泊尔资料，由于高浊度和/或氯化，对样品进行了7小时培养。7小时是优选实施方案直接计数步骤的培养时间。
本发明的内容之一是一种当原始液体或液化样品中第100毫升至少含1个粪便大肠杆菌类细胞时用于快速检测所述细胞存在-不存在的方法。原始样品或液化样品分成几部分(例如3部分)，每部分被过滤以便将存在于样品中的微生物滞留于滤器上。按这种方法，第一部分的原始样品通过第一滤器过滤，第二部分的原始样品通过第二滤器过滤，第三部分的原始样品通过第三滤器过滤，等等。
提供了含有用于产生荧光产物的荧光源底物的启动培养基。也提供样品容器和对照容器，样品容器用于盛放第一、第二和第三样品，对照容器用于与样品同时进行对照。每个容器内含有预定数量的启动培养基。经过过滤步骤后，第一滤器放入装在第一样品容器内的启动培养基中，第二滤器放入装在第二样品容器内的启动培养基中，第三滤器放入装在第三样品容器内的启动培养基中。
提供了具有热传递介质的培养箱，所述热传递介质与置入培养箱中的每个容器保持密切的物理接触。第一样品容器和第一对照容器培养一段短的第一时间长度。几乎同时开始，第二样品容器和第二对照容器培养一段第二时间长度，第三样品容器和第三对照容器培养一段第三时间长度。
经过短的第一时间长度后，第一样品容器的内容物和第一对照容器的内容物的pH调成碱性pH。同样地，第二时间长度后，第二样品容器的内容物和第二对照容器的内容物调成碱性pH，第三样品容器的内容物和第三对照容器的内容物在经历第三时间长度后被调成碱性pH。
当样品容器和对照容器的pH值调过后，用预定的激发波长的光照射样品容器和对照容器。经过各照射步骤后，从第一样品容器测量出第一样品荧光值，从第一对照对照容器中测量出第一对照荧光值。同样地，从第二样品容器测量出第二样品荧光值，从第二对照容器中测量出第二对照荧光值，从第三样品容器中测量出第三样品荧光值，从第三对照容器中测出第三对照荧光值。
第一对照荧光值和第一样品荧光值用于获得一个校正因子，然后，第二对照荧光值用于调整第二样品荧光值以获得一个调整后的第二样品荧光值，第三对照荧光值用于调整第三样品荧光值以获得一个调整后的第三样品荧光值。然后，校正因子用于校正调整后的第二样品荧光值以获得一个校正后的第二样品荧光值，校正因子用于校正调整后的第三样品荧光值以获得一个校正后的第三样品荧光值。
据此可得出结论；当校正的第二样品荧光值为正的并且校正的第三样品荧光值是正的且超出校正后的第二样品荧光值时，每100毫升原始样品包含至少一个粪便大肠杆菌类细胞。
另外，该方法可能还包含用过滤的原始样品第四部分接种琼脂糖培养基，该琼脂糖培养基含有启动培养基，然后在培养箱中培养接种过的培养基大约7小时，接着用预定的激发波长照射培养基，获得在培养基上可见的微生物菌落的直接计数数目。这一步骤可能还包含在计数微生物菌落前给微生物菌落供给一种碱性溶液以增强荧光。
所述的短的时间长度通常大约不超过5分钟，可能是大约2到5分钟。第二时间长度可能从大约1小时到大约5小时。第三时间长度可能从大约2小时到大约6小时，前提条件为：第3时期大约比第2时期长1小时或更长。
第一时间长度可能在从大约2分钟到大约5分钟的范围内，第二时间长度大约1小时，第三时间长度大约2小时。另外，第一时间长度可能不超过大约5分钟，第二时间长度大约1小时，第三时间长度在从大约2小时到大约6小时的范围内。
第一时间长度可能不超过大约5分钟，第二时间长度大约2小时，第三时间长度大约4小时。第一时间长度可能不超过大约5分钟，第二时间长度大约4小时，第三时间长度大约6小时。第二时间长度和第三时间长度可能至少相差大约1小时。
在获得校正因子的步骤中，可以经从第一样品荧光值中减去第一对照荧光值获得校正因子。调整后的样品荧光值可经从样品荧光值中减去对照荧光值获得。校正样品荧光值可经从调整后的样品荧光值中减去校正因子。
在本发明中，启动培养基可能还包含维持活的粪便大肠杆菌细胞之代谢的营养成分，诱导与荧光源底物反应以产生荧光产物的反应中有效的酶的产生的诱导剂，以及对增强荧光有效的表面活性剂。所述诱导剂可以是乳糖，对增强荧光有效的表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠，所述酶可以是β-D-半乳糖苷酶，荧光源底物可以是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷，荧光部分可以是4-甲基伞形酮。启动培养基可以含有4-甲基-伞形酮-β-D-葡糖苷酸作为第二种荧光源底物，使用β-D-葡糖苷酸酶作为降解第二底物的酶。在照射步骤中，优选使用大约为365nm的激发波长，它能引起从荧光产物中发射大约465nm的波长。培养箱中的热传递介质可以是液体(如水或油)，或是固体(如金属)。当调节容器内的pH值时，可以将pH调到高于11或更优选的是调到pH大约为13。
本发明的另一种方法可能还包含原始样品的第四部分，按照上述第一、第二和第三部分进行过滤和处理。在这一方面，当得到下面结果时，可推测出每100毫升原始样品含至少一个粪便大肠杆菌类细胞：(1)校正后的第二样品荧光值为正的且校正后的第三样品荧光值超出校正后的第二样品荧光值，或(2)校正的第三样品荧光值是正的且校正的第四样品荧光值超出校正的第三样品荧光值。
当按上面所述分析第四部分时，短的时间长度可能不超过大约5分钟，可以是大约2到5分钟。第二时间长度可以是大约1小时到大约4小时。第三时间长度可以从大约2小时到大约5小时条件是第三时间长度大约比第二时间长度长1小时或更长。第四时间长度可以从大约3小时到大约5小时，条件是第四时间长度比第三时间长度大约长1小时或更长。
在一种优选形式中，第一时间长度的范围可以从大约2分钟到大约5分钟的范围内，第二时间长度大约2小时，第三时间大约4小时，第4时间大约6小时。
第一时间长度可以不超过大约5分钟，第二时间长度大约1到2小时，第三时间长度从大约3小时到大约5小时的范围内，第四时间长度从大约4小时到大约6小时的范围内，第三时间长度至少比第二时间长度长1小时，第四时间长度至少比第三时间长度长大约1小时。第二时间长度和第三时间长度可能至少相差1小时，第三时间长度和第四时间长度至少相差1小时，第二时间长度和第四时间长度至少相差大约2小时。
按上所述，调整过的样品荧光值可以通过从样品荧光值中减去相应的对照荧光值来获得。校正过的样品荧光值还可以经从调整过的样品荧光值中减去校正因子得到。
提供启动培养基的上述两种方法中，启动培养基可进一步限定为含水，4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷，大约.46％到.54％重量的胨，约.26％到.34％重量的酵母提取物，大约.4％到.6％重量的酶诱导物，约.73％到.77％重量的盐，大约.48％到.52％重量的丙酮酸，大约.01％到.03％重量的表面活性剂，大约.009％到.011％重量的胆汁盐。
酶诱导物可以是乳糖，表面活性剂十二烷基硫酸钠，和NaCl。启动培养基还可以包括大约.004％到.006％重量的4-甲基伞形酮β-D-葡糖苷酸。
按上面详细描述的本发明的另一种方法，第二样品容器和第二对照容器培养时间长度为大约20到30分钟。当校正的第二样品荧光值为正的时，得出的结论是：每100毫升原始样品中至少含1个粪便大肠杆菌类细胞(即证实“存在”)。在本方法中还可得出的结论是：每100毫升原始样品中含至少25个粪便大肠杆菌类细胞。在本方法中，短的第一时期可以不超过5分钟，它可以从大约2到大约5分钟。
按上面详细描述的本发明的另一种方法，第二样品容器和第二对照容器可培养一段大约为1小时的第二时间长度。当校正的第二样品荧光值相应于第二样品中4-甲基伞形酮的体积摩尔浓度至少约0.01μM时，可得出的结论是：每100毫升原始样品含至少一个粪便大肠杆菌类细胞。
在本发明的各种方法中，用于鉴定每100毫升原始液体或液化样品中是否含有至少一个粪便大肠杆菌类细胞的物质组合物可以包含一种含水混合物，4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷和一种干燥培养基。含水混合物还可以包括大约.46％到.54％重量的胨，大约.26％到.34％重量的酵母提取物，大约.4％到.6％重量的酶诱导物，大约.73％到.77％重量的盐，大约.48％到.52％重量的丙酮酸，大约.01％到.03％重量的去污剂，大约.009％到.011％重量的胆汁盐。
胨可以是胨蛋白的胨No.3，酶诱导物可以是乳糖，盐可以是NaCl，去污剂可以是十二烷基硫酸钠，加入混合物的培养基还可以包含4-甲基伞形酮β-D-葡糖苷酸作为第二种荧光源底物。混合物还可以包含大约.004％到.006％重量的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
与水和与一定量的4-甲基伞形酮β-D-半乳糖苷混合的所述组合物可以含有以干燥的形式的约17％到21％重量的胨，大约10％到14％重量的酵母提取物，大约15％到24％重量的酶诱导物，大约28％到30％重量的盐，大约18％到21％重量的丙酮酸，大约0.3％到.12％重量的去污剂，大约0.3％到0.5％重量的胆汁盐。胨可以是胨蛋白的胨No.3，酶诱导的可以是乳糖，盐可以是NaCl，去污剂可以是十二烷基硫酸钠。培养基还可以包含4-甲基伞形酮β-D-葡糖苷酸作为第二荧光源底物，4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸可以含有大约.1％到.3％重量的培养基。
实施例
图1代表了本发明的一种图解形式，其中1000ml原始液体样品被分成10个近似相等的部分。各个100ml部分通过一种微孔滤膜(如.45μm的微孔滤膜)。两个滤膜可放入含有本文所公开的启动培养基的营养琼脂糖培养基。其它8个滤膜放入含有大约5-10ml液体启动培养基的容器中。8个样品容器(和培养板，如果使用的话)放入一个大约为44.5℃±.2℃的培养箱(如水浴)中。含有启动培养基和反应试剂的对照同时进行培养。同时，对空白容器(仅含有空白培养基)和校准标准(含空的培养基4-甲基伞形酮)进行培养。
在培养期间，成对的样品容器按预定间隔或时期取出。第一培养时间长度较短，一般为大约2到5分钟。它也可称为“零样品”。这一短时间长度允许已存在于滤膜或在样品细胞中的外来荧光物质溶解到培养基中，但这一时期太短以致于培养基中的粪便大肠杆菌类细胞不能开始明显产生4-甲基伞形酮。其他重复的各对在经历预定间隔(如2、4和6小时)的培养后取出。培养后，加入碱性溶液(如NaOH)到样品中以增加4-甲基伞形酮检测的灵敏性。然后照射样品，分析荧光的发射。对空的容器，校准标准和试剂对照在每个时间间隔时也进行处理和照射以用于比较。
所有样品进行培养，照射和进行荧光检测后，分析数据。在每一步用空的容器和校准容器重新校准荧光计。
经平均两个重复样品检测每个间隔或时期的样品荧光值。从样品荧光值中减去从培养了特定时期的试剂对照中得到的荧光值以获得一个调整后的样品荧光值。当对“零样品”使用这一算法时，调整后的荧光值是“校正因子”，它随后运用于培养了更长期间的样品。每个调整后的样品荧光值通过从该值中减去校正因子来校正，以获得一个校正后的样品或“净”荧光值。
在本发明的这种方法中，如果2小时的校正荧光(净)值为正的，而且如果4小时校正荧光值是正的且比2小时值要大，可推断粪便大肠杆菌类细胞存在于原始样品中(即≥1个粪便大肠杆菌类细胞/100ml)。
如果4小时校正荧光值是正的，而且如果6小时校正荧光值是正的且比4小时值更大，可推断粪便大肠杆菌类细胞存在于原始样品中(即≥1个粪便大肠杆菌类细胞/100ml)。
如果在任一校正样品中校正的样品荧光值相应于样品中的至少大约0.01μM的4-甲基伞形酮的体积摩尔浓度，可推断粪便大肠杆菌类细胞存在于原始样品中(即≥1个粪便大肠杆菌细胞/100ml)。图3显示了4-甲基伞形酮体积摩尔浓度对标准的校准荧光强度的关系曲线。
如果不存在两个连续增长的校正荧光值，或如果校正值在6小时后不与至少为大约0.01μM的4-甲基伞形酮体积摩尔浓度相对应，可推断在原始样品中不存在粪便大肠杆菌类细胞，(即粪便细胞浓度＜1个粪便大肠杆菌类细胞/100ml)。
培养板样品在经历一段7小时的培养期后可进行分析以证实所说结论。
方法过滤
提供用于试验的液体样品，如用于饮用的水资源。样品按照美国公众卫生协会出版的检查水和废水的标准方法，第17版，9222D部分的膜过滤方法进行过滤。本文引用此方法作为参考。甄别或判断存在-不存在的方法
为进行甄别步骤或判断存在-不存在步骤，将滤膜置入含有启动培养基的样品容器中。启动培养基含有乳糖，和一种去污剂，这里出现的是十二烷基硫酸钠，用以增强4-甲基伞形酮的荧光(图4)。滤膜沿培养管的管壁放入使其被培养基浸没。
管在培养箱(如水浴)中在大约44.5℃±0.2℃下培养，在即将照射和荧光测量之前取出，使用调到预定波长的紫外光源照射含有样品的管。以预定的时间间隔如每小时一次或在启动培养后的1、2、4和6小时测量样品以判定存在-不存在所述细胞。用于甄别的样品在照射和荧光测量前先培养大约20到30分钟。为了在标准荧光计中进行测量，将3-10ml样品与约33μl 10MNaOH/ml试剂混合。
在第一次读数前，准备荧光计并经首先将空的和内校准标准的(工作液)预热到44.5℃来校准。先用3ml空白培养基(无MUGal)与100μl 10M NaOH混合将仪器调到零(零旋钮)，再用3ml内标物(0.27μm MU)与100μL 10M NaOH混合调到500(量程旋钮)。放大调到1000。使用来自Sequoia Turner，Model450-003的标准荧光计。
在优选的实施例中，培养箱是一种水浴。然而，培养箱可以是能维持稳定的培养温度的任一装置，该装置有一种热传递介质，该介质与容器表面保持密切的物理接触，包括具有液体介质如水或油的增产箱，具有固体或金属热传递介质的块状或坑状培养箱。直接计数方法
在直接计数方法中，滤膜放到直接计数板的直接计数培养基表面。制备的培养板放入防水塑料袋中，浸没在水浴中，44.5℃±0.2℃下培养约7小时±15分钟。重要的是确保培养板浸没以维持所需的恒定温度。
培养期后，培养板移出培养箱，用紫外光(如以商品形式从UVP.Inc(Model No.UVL-21)买到的)以预定波长照射。然后观察板上具荧光的微生物菌落。优选一种碱性形成剂如NaOH喷洒到滤膜上，计数蓝色荧光菌落的数目。在加入碱性形成剂前，需要试验进行证实的任何菌落必须移去。仪器和设备
用于7小时直接计数方法的仪器和设备包括膜过滤装置(如从Sartorius可购得的)，能维持大约44.5℃±0.2℃恒温的水浴培养箱(如可从Haake-Model SWB 20得到的)，长波紫外线手控灯(例如，可从UVP.Inc.得到的，UVL-21)，启动培养基，碱性形成剂溶液，稀释水(例如，0.1％无菌胨)，塑料培养皿，滤膜(例如，网的微孔为0.45μm)，4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(MUGal)，95％乙醇，十二烷基硫酸钠。
用于甄别或判断存在-不存在试验的仪器和设备包括：膜过滤装置，能维持大约44.5℃恒温的水浴培养箱，长波紫外线手控灯，启动培养基，稀释水(例如，0.1％的无菌胨)，滤膜(例如，0.45μm网孔)，4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(MUGal)，95％乙醇，十二烷基硫酸钠，荧光剂，空白培养基，10m NaOH溶液，无菌培养管，和4-甲基伞形酮(4-MU)。0.02％十二烷基硫酸钠(SLS)溶液的制备
0.1g十二烷基硫酸钠溶于500ml蒸馏水中，120℃高压灭菌15分钟。4-MU-β-D-半乳糖苷底物溶液的制备：
加入1.5ml 95％乙醇到0.0375g MUGal中，剧烈摇动2分钟，然后加入28.5ml 0.02％无菌SLS(十二烷基硫酸钠)充分混合。加热含底物溶液的管到60℃-80℃直到溶解。优选地，每次试验制备新鲜的该溶液。直接计数板的制备
溶解12.925g启动培养基于500ml无菌水中，20℃下调pH到7.3，加入5.0g琼脂到培养基中，加热到接近沸腾以溶化琼脂。移走热源，冷却到大约70℃并加入20ml MUGal溶液到培养基中。冷却培养基到45-50℃。分配5到7ml到塑料培养器中以产生直接计数板。优选地4℃贮存配好的培养基，14天后弃去未用的培养基。液态启动培养基的制备
溶解12.925g启动培养基(优选表1所示的组合物)于500ml无菌蒸馏水中，20℃下调pH至7.3。加热培养基至接近沸腾，移去热源。冷却到大约70℃并加入20ml MUGal溶液到培养基中，冷却培养基到45℃以下。吸取大约15ml培养基到无菌管中以制成样品容器。
表1启动培养基组合物
空白培养基的制备
| 启动培养基 | 干重(大约数) | 再水化时的重量％ |
| 胨蛋白胨no.3 | 2.5g±0.2 | .46-.54 |
| 酵母提取物 | 1.5g±0.2 | .26-.34 |
| 乳糖 | 2.5g±0.5 | .4-.6 |
| NaCl | 3.75g±0.1 | .73-.77 |
| 丙酮酸 | 2.5g±0.1 | .48-.52 |
| 十二烷基磺酸钠 | 0.10g±0.05 | .01-.03 |
| 胆汁盐 | 0.05g±0.005 | .009-.011 |
| 4-甲基伞形酮β-D-半乳糖苷 | 0.025g±0.005 | .004-.006 |
溶解25.80g空白培养基(优选表2所示的组合物)于1000ml无菌蒸馏水中，20℃调pH至7.3并过滤灭菌培养基。表2空白培养基组合物：
内校准标准物的制备
| 空白培养基 | 干重 | 再水化时的重量％ |
| 胨蛋白胨no.3 | 5.0g±0.4 | .46-.54 |
| 酵母提取物 | 3.0g±0.4 | .26-.34 |
| 乳糖 | 5.0g±1.0 | .4-.6 |
| NaCl | 7.5g±0.2 | .73-.77 |
| 丙酮酸 | 5.0g±0.2 | .48-.52 |
| 十二烷基磺酸钠 | 0.2g±0.1 | .01-.03 |
| 胆汁盐 | 0.1g±0.01 | .009-.011 |
先溶解6mg 4-MU于500ml空白培养基(无MUGal)中以制备68.1μm MU贮液。每第二周制备新鲜的贮液。用空白培养基将1ml贮液稀释到250ml以制备工作液(0.27μm MU)。将它用作校准标准物。新鲜工作液优选每周制备一次。
根据试验者所需的资料，甄别判断存在-不存在和直接计数方法可分别、同时或连续完成。例如，甄别方法可单独用于甄别大量水样品的高度污染。判断存在-不存在的方法用于进一步鉴别水样品可疑的大肠杆菌类水平。直接计数方法用于分别证实特定水样品中粪便大肠杆菌类的存在。这些方法也可结合使用。例如，水样品的试验可同时使用甄别方法和判断存在-不存在的方法，使用甄别方法和直接计数方法，或使用判断存在-不存在的方法和直接计数方法。最后，样品可同时用甄别方法，判断存在-不存在的方法，和直接计数法来检验。
本发明的结果用下面资料例来证实。
资料例1
使用本发明的一种方法和使用标准方法mFC 24h方法评价在美国表层水中自然形成的粪便大肠杆菌类种群。1992年3月26日从美国马里兰州Monocacy河收集水样并用本发明的方法分析粪便大肠杆菌类微生物。方法描述如上。以一式两份试验了3种稀释度。样品按上所述方法培养。在24小时计数mFC样品。使用Turner Model 450-003荧光计在“零时”，2、4和6小时测量在快速检测方法样品中的荧光。激发和发射波长分别为365和465nm。结果和讨论
结果如图5所示。与1、3和34FC/100ml相应的所有稀释度产生正的(+)结果，表明存在粪便细菌。最低值，1FC/100ml在6小时时检测为正的，3FC/100ml在2小时时检测为负的，34FC/100ml在≤2小时时检测为正的(第一次测量时)。因此，在本实施例中，对于最低计数，在6小时证实了其存在，对于次低值(3FC/100ml)在2小时证实了其存在，对于最高值(34FC/100ml)在2小时证实了其存在，如果在20分钟时进行测量，很可能在如此短的时间内就证实。
资料例2
在本实施例中使用本发明的一种形式和标准m-FC24小时方法分析了有或无污水污染的挪威表层水中自然粪便大肠杆菌类种群。1992年4月3日从挪威oslo的Aker河收集水样，使用本发明的方法分析粪便大肠杆菌类微生物。试验了3种样品：河水，含两种不同剂量的未处理的家庭污水的河水。按上述方法制备的样品在44.5℃水溶中培养。在24小时计数m-FC样品。使用Turner Model 450-003荧光计在“零时”，2、4和6小时测量快速检测方法样品中的荧光。激发和发射波长分别是365和465nm。结果如图6所示。相应于11、90和TNTC的所有3种样品产生正的(+)结果，证实了粪便大肠杆菌类的存在。所有结果在≤2小时内为正的。如果在1小时的培养间隔后进行测量，TNTC细胞/100ml和90细胞/100ml样品很可能被证实为正的。11细胞样品可能在培养1.5小时后证实为正的。
资料例3
在本实施例中，使用本发明的一种方法和标准m-FC 24小时方法分析了在几种表层水中自然形成的粪便大肠杆菌类的种群。从Monocacy河，Aker河和Loysa河收集新鲜样品并当天进行分析。也根据EPA指南，检测微生物学水纯度的标准和方案(1987)制备了一种“最劣例”水样品。样品的物理参数和组成如表3所示。表3试验样品的成份
| 参数 | 样品来源 | |||
| Monocacy河 | “最劣例”水 | Aker河 | Loysa河 | |
| 浊度(NTU)TDs(mg/l)导电性(μmhos)pH温度(℃)腐殖酸(加入)mg/l | 13-14 | 39 | -- | -- |
| 177-183 | 1500mg/l | -- | -- | |
| 253-262 | -- | -- | -- | |
| 7.34-7.45 | 7.4 | 7.2 | 6.5-6.8 | |
| 8 | -- | 8 | 17 | |
| -- | 10 | -- | -- | |
| *2天试验的值范围 | ||||
所有样品以一式两份进行试验。样品在44.5℃的水溶中培养并按上面所述方法制备。m-FC样品在24小时计数。使用Turner Model 450-003荧光计在“零时”，2、4和6小时测量快速检测方法样品的荧光值。激发和发射波长分别为365和465nm。
结果总结在表4中。使用本发明的方法进行的粪便大肠杆菌类存在/不存在检测用+/-表示。报道了校正荧光值(量程为0至500)和最早正的“存在”检测时间(2到6小时)。表4
| 样品鉴定 | 样品号 | 本发明 | 标准方法 | |||
| 液态培养基方法(P/A | 7h直接计数 | m FC 24n | ||||
| +/- | 荧光值 | 检预时间(h) | ||||
| MonocacuyRiver(I)3-25-92 | 123 | +++ | 2365026 | 222 | 4020.5 | 524.30 |
| MonocacyRiver(II)3-26-92 | 456 | +++ | 1131610 | 226 | 4031 | 424.30 |
| “最劣例”水3-25-92 | 789 | ++- | 8650 | 266 | 246.50.5 | --91 |
| Aker河(I)4-03-92 | 101112 | +++ | 24411724 | 222 | TNTC9011 | -727 |
| Aker 河(II)4-07-92 | 1314 | ++ | 3121 | 24 | 84 | 154 |
| Aker 河(III)3-04-93 | 151617 | +-- | 39010 | 266 | --- | 15000.5 |
| Loysa河水样5-26-92 | 18 | - | 0 | 6 | 0 | 0 |
全部具有＞10FC/100ml的样品的正的结果在≤2小时测量出(样品1、4、7、10、11、12和15)。含1-10FC/100ml的样品在2-6小时内检测为正的(样品2、5、6、8、13和14)。所有例子的7h直接计数与标准m-FC 24h计数显示出密切的一致性。本文所用的TNTC意思是“数量太大无法计数”。
本文引用的全部专利或文献编入本文以供参考。
对本文所述的本发明实施例或本文所述实施例的部分要素或步骤或本文所述方法的步骤之顺序可进行改变而不偏离在下面权利要求书中所限定的本发明的实质和范围。
Claims (76)
1.一种当每100毫升原始液体或液化样品中含有至少一个粪便大肠杆菌类细胞时用于快速检测所述细胞有无的方法，包括：
(a)在第一滤器上过滤原始样品的第一部分，在第二滤器上过滤原始样品的第二部分以浓缩活的粪便大肠杆菌类细胞；
(b)提供具有荧光源底物的启动培养基，以产生荧光产物；
(c)提供第一样品容器和第二样品容器，每个中都含有预定量的启动培养基；
(d)将第一滤器放入第一样品容器所含的启动培养基中，第二滤器放入第二样品容器所含的启动培养基中；
(e)提供培养设备，它具有热传递介质，可保持与所放置的每个容器紧密的物理接触；
(f)以第一时间长度培养第一样品容器，以第二时间长度培养第二样品容器，其中第一时间长度处于约1至5小时的范围，而第二时间长度处于约2至6小时的范围，前提条件是第三时间长度至少应比第一时间长度长约1小时；
(g)第一时间长度后将第一样品容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(h)调节pH后，用预定激发波长的光照射第一样品容器和第一对照容器；
(i)第二时间长度后将第二样品容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(j)调节pH后，用预定激发波长的光照射第二样品容器；
(k)每次照射步骤后，测量第一样品容器中第一样品的荧光值以及第二样品容器中的第二样品的荧光值；
(l)得到校正因子；
(m)调节第一样品的荧光值以得到经调节的第一样品荧光值；
(n)调节第二样品的荧光值以得到经调节的第二样品荧光值；
(o)使用校正因子以校正经调整的第一样品荧光值，可得到经校正的第一样品荧光值；
(p)使用校正因子以校正经调整的第二样品荧光值，得到经校正的第二样品荧光值；和
(q)当经校正的第一样品荧光值是正的，经校正的第二样品荧光值也是正的并超出经校正的第一样品荧光值时，可推断每100毫升原始样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞。
2.如权利要求1的方法，进一步包括在含有启动培养基的琼脂培养基上至少培养原始样品的第三部分，在培养装置中用约7小时培养此培养基，培养期过后，用预定激发波长照射培养基，并对培养基上可见的微菌落计数。
3.如权利要求2的方法，进一步包括在对微菌落计数前，对徽菌落施用碱性溶液以加强荧光。
4.如权利要求1的方法，其中的启动培养基进一步包括：
(1)维持活的粪便大肠杆菌类细胞代谢的营养成分，
(2)能诱导产生可有效地与荧光源底物反应以产生发荧光产物的酶的诱导剂，和
(3)能有效加强荧光的表面活性剂。
5.如权利要求4的方法，其中的诱导剂是乳糖，能有效加强荧光的表面活性剂是十二烷基硫酸钠，酶是β-D-半乳糖苷酶，荧光源底物是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷，荧光部分是4-甲基伞形酮。
6.如权利要求5的方法，其中的培养基进一步包括作为第二荧光源底物的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
7.如权利要求1的方法，其中照射步骤使用的激发波长约为365nm，它可导致约465nm的发射波长。
8.如权利要求1的方法，其中培养装置中的液体热传递介质是液体。
9.如权利要求8的方法，其中液体热传递介质是水。
10.如权利要求8的方法，其中液体热传递介质是油。
11.如权利要求1的方法，其中培养装置中热传递介质是固体。
12.如权利要求11的方法，其中培养工具中的固体热传递介质是金属。
13.如权利要求1的方法，其中碱性pH大于11。
14.如权利要求13的方法，其中碱性pH大于13。
15.一种当每100毫升原始液体或液化样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞时用于快速检测所述细胞有无的方法，包括：
(a)在第一滤器上过滤原始样品的第一部分，在第二滤器上过滤原始样品的第二部分，在第三滤器上过滤原始样品的第三部分以浓缩活的粪便大肠杆菌类细胞；
(b)提供具有荧光源底物的启动培养基以产生荧光产物；
(c)提供第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、第一对照容器、第二对照容器、第三对照容器，每个中都含有预定量的启动培养基；
(d)将第一滤器放入第一样品容器所含的启动培养基中，第二滤器放入第二样品容器所含的启动培养基中，第三滤器放入第三样品容器所含的启动培养基中；
(e)提供培养工具，它具有热传递介质，可保持与所放置的每个容器紧密的物理接触
(f)在短的第一时间长度培养第一样品容器和第一对照容器；
(g)短的第一时间长度后，将第一样品容器中的内容物和第一对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(h)调节pH后，用预定激发波长的光照射第一样品容器和第一对照容器；
(i)以第二时间长度培养第二样品容器和第二对照容器；
(j)第二时间期限后，将第二样品容器中的内容物的pH和第二对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(k)调节pH后，用预定激发波长的光照射第二样品容器和第二对照容器；
(l)以第三时间长度培养第三样品容器和第三对照容器；
(m)第三时间长度后将第三样品容器中内容物的pH和第三对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(n)调节pH后，用预定激发波长的光照射第三样品容器和第三对照容器；
(o)每次照射步骤后，测量第一样品容器中第一样品的荧光值，第一对照容器的第一对照荧光值，第二样品容器中的第二样品的荧光值，第二对照容器中的第二对照荧光值，第三样品容器中的第三样品荧光值以及第三对照容器中的第三对照荧光值；
(p)使用第一对照荧光值和第一样品荧光值以得到校正因子；
(q)用第二对照荧光值调整第二样品荧光值以得到经调整的第二样品荧光值；
(r)用第三对照荧光值调整第三样品荧光值以得到经调整的第三样品荧光值；
(s)用校正因子校正经调整的第二样品荧光值以得到经校正的第二样品荧光值；
(t)用校正因子校正经调整的第三样品荧光值以得到经校正的第三样品荧光值；和
(u)得出结论，当经校正的第二样品荧光值是正的，经校正的第三样品荧光值也是正的并超出经校正的第二样品荧光值时，可推断每100毫升原始样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞。
16.如权利要求15的方法，进一步包括在含有启动培养基的琼脂培养基上至少培养原始样品的第四部分，在培养装置中用约7小时培养此培养基，培养期过后，用预定激发波长照射培养基，并对培养基上可见的微菌落计数。
17.如权利要求16的方法，进一步包括在对微菌落计数前，对微菌落施用碱性溶液以加强荧光。
18.如权利要求15的方法，其中短的时间长度少于约5分钟。
19.如权利要求18的方法，其中第一时间长度约为2至5分钟。
20.如权利要求15的方法，其中第二时间长度约为1至5小时。
21.如权利要求15的方法，其中第三时间长度约为2至6小时，前提条件是第三时间长度比第二时间长度长约1小时或更长时间。
22.如权利要求15的方法，其中第一时间长度在约2分钟至5分钟的范围内，第二时间长度约为1小时，第三时间长度约为2小时。
23.如权利要求15的方法，其中第一时间长度少于约5分钟，第二时间长度约为1小时，第三时间长度在约为2小时至约6小时的范围内。
24.如权利要求15的方法，其中第一时间长度少于约5分钟，第二时间长度约为2小时，第三时间长度约为4小时。
25.如权利要求15的方法，其中第一时间长度少于约5分钟，第二时间长度约为4小时，第三时间长度约为6小时。
26.如权利要求15的方法，其中第二时间长度和第三时间长度至少相差约1小时。
27.如权利要求15的方法，其中得到校正因子的步骤进一步包括从第一样品荧光值中减去第一对照荧光值。
28.如权利要求15的方法，其中得到经调整的第二样品荧光值的步骤进一步包括从第二样品荧光值中减去第二对照荧光值。
29.如权利要求15的方法，其中得到经校正的第二样品荧光值的步骤进一步包括从经调整的第二样品荧光值中减去校正因子。
30.如权利要求15的方法，其中的启动培养基进一步包括：
(1)维持活的粪便大肠杆菌类细胞代谢的营养成分，
(2)能诱导产生可有效地与荧光源底物反应以产生发荧光产物的酶的诱导剂，和
(3)能有效加强荧光的表面活性剂。
31.如权利要求30的方法，其中的诱导剂是乳糖，能有效加强荧光的表面活性剂是十二烷基硫酸钠，酶是β-D-半乳糖苷酶，荧光源底物是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷，荧光部分是4-甲基伞形酮。
32.如权利要求31的方法，其中培养基进一步包括作为第二荧光源底物的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
33.一种当每100毫升原始液体或液化样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞时用于快速检测所述细胞有无的方法，包括：
(a)在第一滤器上过滤原始样品的第一部分，在第二滤器上过滤原始样品的第二部分，在第三滤器上过滤原始样品的第三部分，在第四滤器上过滤原始样品的第四部分以浓缩活的粪便大肠杆菌类细胞；
(b)提供具有荧光源底物的启动培养基，以产生荧光产物；
(c)提供第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、第四样品容器、第一对照容器、第二对照容器、第三对照容器和第四对照容器，每个中都含有预定量的启动培养基；
(d)将第一滤器放入第一样品容器所含的启动培养基中，第二滤器放入第二样品容器所含的启动培养基中，第三滤器放入第三样品容器所含的启动培养基中，第四滤器放入第四样品容器所含的启动培养基中；
(e)提供培养装置，它具有热传递介质，可保持与所放置的每个容器紧密的物理接触；
(f)以短的第一时间长度，培养第一样品容器和第一对照容器；
(g)第一时间长度后，将第一样品容器内容物和第一对照容器内容物的pH调节至碱性pH；
(h)调节pH后，用预定激发波长的光照射第一样品容器和第一对照容器；
(i)以第二时间长度培养第二样品容器和第二对照容器；
(j)第二时间长度后，将第二样品容器内容物和第二对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(k)调节pH后，用预定激发波长的光照射第二样品容器和第二对照容器；
(l)以第三时间长度培养第三样品容器和第三对照容器；
(m)第三时间长度后，将第三样品容器内容物和第三对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(n)调节pH后，用预定激发波长的光照射第三样品容器和第三对照容器；
(o)以第四时间长度培养第四样品容器和第四对照容器；
(p)第四时间长度后，将第四样品容器内容物和第四对照容器内容物的pH调节至碱性pH；
(q)调节pH后，用预定激发波长的光照射第四样品容器和第四对照容器；
(r)每次照射步骤后，测量第一样品容器中第一样品的荧光值，第一对照容器的第一对照荧光值，第二样品容器中的第二样品荧光值，第二对照容器中的第二对照荧光值，第三样品容器中的第三样品荧光值，第三对照容器中的第三对照荧光值，第四样品容器中的第四样品荧光值，第四对照容器中的第四对照荧光值；
(s)使用第一对照荧光值和第一样品荧光值以得到校正因子；
(t)用第二对照荧光值调整第二样品荧光值以得到经调整的第二样品荧光值；
(u)用第三对照荧光值调整第三样品荧光值以得到经调整的第三样品荧光值；
(v)用第四对照荧光值调整第四样品荧光值以得到经调整的第四样品荧光值；
(w)用校正因子校正经调整的第二样品荧光值以得到经校正的第二样品荧光值；
(x)用校正因子校正经调整的第三样品荧光值以得到经校正的第三样品荧光值；
(y)用校正因子校正经调整的第四样品荧光值以得到经校正的第四样品荧光值；和
(z)得出结论，在下列情况下时每100毫升原始样品中含有至少一个粪便大肠杆菌类细胞：
(1)经校正的第二样品荧光值是正的，经校正的第三样品荧光值超出经校正的第二样品荧光值，或者
(2)经校正的第三样品荧光值是正的，经校正的第四样品荧光值超出经校正的第三样品荧光值。
34.如权利要求33的方法，其中短的时间长度少于约5分钟。
35.如权利要求34的方法，其中第一时间长度约为2至5分钟。
36.如权利要求33的方法，其中第二时间长度约为1小时至4小时。
37.如权利要求33的方法，其中第三时间长度约为2小时至5小时，前提条件是第三时间长度比第二时间长度要长约1小时或更长。
38.如权利要求33的方法，其中第四时间长度约为3小时至5小时，前提条件是第四时间长度比第三时间长度要长约1小时或更长。
39.如权利要求33的方法，其中第一时间长度在从约2分钟至5分钟的范围内，第二时间长度约为2小时，第三时间长度约为4小时，第四时间长度约为6小时。
40.如权利要求33的方法，其中第一时间长度少于约5分钟，第二时间长度约为1至2小时，第三时间长度在从约3小时至5小时的范围内，第四时间长度在约4小时至6小时的范围内，前提条件是第三时间长度至少约比第二时间长度长1小时，第四时间长度至少约比第三时间长度长1小时。
41.如权利要求33的方法，其中第二时间长度和第三时间长度至少相差约1小时，第三时间长度和第四时间长度至少相差约1小时，第二时间长度和第四时间长度至少相差约2小时。
42.如权利要求33的方法，其中得到校正因子的步骤进一步包含从第一样品荧光值中减去第一对照荧光值。
43.如权利要求33的方法，其中得到经调整的样品荧光值的步骤进一步包括从样品荧光值中减去相应的对照荧光值。
44.如权利要求33的方法，其中得到经校正的样品荧光值的步骤进一步包括从经调整的样品荧光值中减去校正因子。
45.如权利要求33的方法，进一步包括在含有启动培养基的琼脂培养基上培养原始样品的第二部分，在培养装置中培养此培养基约7小时，培养期过后，用预定激发波长照射培养基，并对培养基上可见的微菌落计数。
46.如权利要求45的方法，进一步包括对微菌落计数前，对微菌落施用碱性溶液以加强荧光。
47.一种当每100毫升原始液体或液化样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞时用于快速检测所述细胞有无的方法，包括：
(a)在第一滤器上过滤原始样品的第一部分，在第二滤器上过滤原始样品的第二部分，在第三滤器上过滤原始样品的第三部分以浓缩活的粪便大肠杆菌类细胞；
(b)提供启动培养基，它含有水、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷以及
约占重量.46％至.54％的蛋白胨，
约占重量.26％至.34％的酵母浸出汁，
约占重量.4％至.6％的酶诱导物，
约占重量.73％至.77％的盐，
约占重量.48％至.52％的丙酮酸盐，
约占重量.01％至.03％的表面活性剂，以及
约占重量.009％至.011％的胆汁盐；
(c)提供第一样品容器、第二样品容器、第三样品容器、第一对照容器、第二对照容器、第三对照容器，每个中都含有预定量的启动培养基；
(d)将第一滤器放入第一样品容器所含的启动培养基中，第二滤器放入第二样品容器所含的启动培养基中，第三滤器放入第三样品容器所含的启动培养基中；
(e)提供培养装置，它具有热传递介质，可保持与所放置的每个容器紧密的物理接触；
(f)以短的第一时间长度培养第一样品容器和第一对照容器；
(g)第一时间长度后将第一样品容器中的内容物和第一对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(h)调节pH后，用预定激发波长的光照射第一样品容器和第一对照容器；
(i)以第二时间长度培养第二样品容器和第二对照容器；
(j)第二时间长度后将第二样品容器内容物和第二对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(k)调节pH后，用预定激发波长的光照射第二样品容器和第二对照容器；
(l)以第三时间长度培养第三样品容器和第三对照容器；
(m)第三时间长度后，将第三样品容器内容物和第三对照容器内容物的pH调节至碱性pH；
(n)调节pH后，用预定激发波长的光照射第三样品容器和第三对照容器；
(o)每次照射步骤后，测量第一样品容器中的第一样品荧光值，第一对照容器的第一对照荧光值，第二样品容器中的第二样品荧光值，第二对照容器中的第二对照荧光值，第三样品容器中的第三样品荧光值和第三对照容器中的第三对照荧光值；
(p)使用第一对照荧光值和第一样品荧光值以得到校正因子；
(q)用第二对照荧光值调整第二样品荧光值以得到经调整的第二样品荧光值；
(r)用第三对照荧光值调整第三样品荧光值以得到经调整的第三样品荧光值；
(s)用校正因子校正经调整的第二样品荧光值以得到经校正的第二样品荧光值；
(t)用校正因子校正经调整的第三样品荧光值可得到经校正的第三样品荧光值；和
(u)得出结论，当经校正的第二样品荧光值是正的，经校正的第三样品荧光值超出经校正的第二样品荧光值时，可推断每100毫升原始样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞。
48.如权利要求47的方法，进一步包括在含有启动培养基的琼脂培养基上培养原始样品的第二部分，在培养装置中培养此培养基约7小时，培养期过后，用预定激发波长照射培养基，并对培养基上可见的微菌落计数。
49.如权利要求48的方法，进一步包括在对微菌落计数前，对微菌落施用碱性溶液以加强荧光。
50.如权利要求47的方法，其中酶诱导物是乳糖，表面活性剂是十二烷基硫酸钠，由诱导物诱导的酶是β-D-半乳糖苷酶，盐是NaCl。
51.如权利要求47的方法，其中启动培养基进一步包括约占重量.004％至.006％的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
52.一种当每100毫升原始液体或液化样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞时用于快速检测所述细胞有无的方法，包括：
(a)在第一滤器上过滤原始样品的第一部分，在第二滤器上过滤原始样品的第二部分以浓缩活的粪便大肠杆菌类细胞；
(b)提供具有荧光源底物的启动培养基以产生荧光产物；
(c)提供第一样品容器、第二样品容器、第一对照容器和第二对照容器，每个中都含有预定量的启动培养基；
(d)将第一滤器放入第一样品容器所含的启动培养基中，第二滤器放入第二样品容器所含的启动培养基中；
(e)提供培养装置，它具有热传递介质，可保持与置入培养装置中的每个容器紧密的物理接触；
(f)以短的第一时间长度培养第一样品容器和第一对照容器；
(g)第一时间长度后，将第一样品容器中的内容物和第一对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(h)调节pH后，用预定激发波长的光照射第一样品容器和第一对照容器；
(i)以约为20至30分钟的第二时间长度培养第二样品容器和第二对照容器；
(j)第二时间长度后，将第二样品容器中内容物和第二对照容器中的内容物的pH调节至碱性pH；
(k)调节pH后，用预定激发波长的光照射第二样品容器和第二对照容器；
(l)每次照射步骤后，测量第一样品容器中的第一样品荧光值，第一对照容器中的第一对照荧光值，第二样品容器中的第二样品荧光值，第二对照容器中的第二对照荧光值；
(m)使用第一对照荧光值和第一样品荧光值得到校正因子；
(n)用第二对照荧光值来调整第二样品荧光值得到经调整的第二样品荧光值；
(o)用校正因子校正经调整的第二样品荧光值得到经校正的第二样品荧光值；和
(p)得出结论，当经校正的第二样品荧光值是正的时，每100毫升原始样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞。
53.如权利要求52的方法，其中推断的步骤进一步包括可推断出每100毫升原始样品中至少含有25个粪便大肠杆菌类细胞。
54.如权利要求52的方法，其中短的期间约低于5分钟。
55.如权利要求54的方法，其中短的第一期间约为2至5分钟。
56.如权利要求52的方法，进一步包括在含有启动培养基的琼脂培养基上培养原始样品的第二部分，在培养装置中培养此培养基约7小时，培养期过后，用预定激发波长照射培养基，并对培养基上可见的微菌落计数。
57.如权利要求56的方法，进一步包括在对微菌落计数前，对微菌落施用碱性溶液以加强荧光。
58.如权利要求52的方法，其中培养基中进一步包括作为第二发荧光底物的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
59.当每100毫升原始液体或液化样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞时的快速检测该细胞有无的方法，包括：
(a)在第一滤器上过滤原始样品的第一部分，在第二滤器上过滤原始样品的第二部分以浓缩活的粪例大肠杆菌类细胞；
(b)提供具有发荧光底物的启动培养基以产生荧光产物；
(c)提供第一样品容器、第二样品容器、第一对照容器和第二对照容器，每个中都含有预定量的启动培养基；
(d)将第一滤器放入第一样品容器所含的启动培养基中，第二滤器放入第二样品容器所含的启动培养基中；
(e)提供培养装置，它具有热传递介质，可保持与所放置的每个容器紧密的物理接触；
(f)在短的第一期间内，培养第一样品容器和第一对照容器；
(g)第一期间后，将第一样品容器中的内容物和第一对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(h)调节pH后，用预定激发波长的光照射第一样品容器和第一对照容器；
(i)在约为1小时的第二期间内，培养第二样品容器和第二对照容器；
(j)第二期间后，将第二样品容器中内容物和第二对照容器中内容物的pH调节至碱性pH；
(k)调节pH后，用预定激发波长的光照射第二样品容器和第二对照容器；
(l)每次照射步骤后，测量第一样品容器中的第一样品荧光值，第一对照容器中的第一对照荧光值，第二样品容器中的第二样品荧光值，第二对照容器中的第二对照荧光值；
(m)使用第一对照荧光值和第一样品荧光值以得到校正因子；
(n)用第二对照荧光值来调整第二样品荧光值可得到经调整的第二样品荧光值；
(o)用校正因子校正经调整的第二样品荧光值可得到经校正的第二样品荧光值；和
(p)当经校正的第二样品荧光值相应于第二样品中4-甲基伞形酮的至少约为0.01μmolar的体积克分子浓度时，可推断每100毫升原始样品至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞。
60.如权利要求59的方法，其中短的期间约低于5分钟。
61.如权利要求60的方法，其中第一期间约为2至5分钟。
62.如权利要求59的方法，进一步包括在含有启动培养基的琼脂培养基上培养原始样品的第二部分，在培养装置中培养此培养基约7小时，培养期过后，用预定激发波长照射培养基，并对培养基上可见的微菌落计数。
63.如权利要求62的方法，进一步包括在对微菌落计数前，对微菌落施用碱性溶液以加强荧光。
64.如权利要求59的方法，其中培养基进一步包括作为第二发荧光底物的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
65.一种物质组合物，包括水、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷和培养基，此组合物是用于测定每100毫升原始液体或液化样品中是否含有至少一个粪便大肠杆菌类细胞的试验，此培养基进一步包括：
约占重量.46％至.54％的蛋白胨，
约占重量.26％至.34％的酵母浸出汁，
约占重量.4％至.6％的酶诱导物，
约占重量.73％至.77％的盐，
约占重量.48％至.52％的丙酮酸盐，
约占重量.01％至.03％的表面活性剂，和
约占重量.009％至.011％的胆汁盐。
66.如权利要求65的方法，其中蛋白胨是3号胨蛋白胨，酶诱导物是乳糖，盐是NaCl，去污剂是十二烷基硫酸钠。
67.如权利要求65的方法，其中培养基进一步包括作为第二发荧光底物的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
68.如权利要求67的方法，其中启动培养基进一步包括约占重量.004％至.006％的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
69.一种物质组合物，当它与水混合并联合大量4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷时可提供培养基，以用于测定每100毫升原始液体或液化样品中是否含有至少一个粪便大肠杆菌类细胞的试验，此组合物包括：
约占重量17％至21％的蛋白胨；
约占重量10％至14％的酵母浸出汁；
约占重量15％至24％的酶诱导物；
约占重量28％至30％的盐；
约占重量18％至21％的丙酮酸盐；
约占重量0.3％至1.2％的去污剂；和
约占重量O.3％至0.5％的胆汁盐。
70.如权利要求69的方法，其中蛋白胨是3号胨蛋白胨，酶诱导物是乳糖，盐是NaCl，去污剂是十二烷基硫酸钠。
71.如权利要求70的方法，其中培养基进一步包括作为第二发荧光底物的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
72.如权利要求71的方法，其中活性培养基进一步包括约占重量.1％至.3％的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
73.测定每100毫升原始液体或液化样品中至少含有1个粪便大肠杆菌类细胞时的快速直接计数法，包括：
(a)在滤器中过滤原始样品部分以浓缩活的粪便大肠杆菌类细胞；
(b)提供含有启动培养基的培养基，包括：
约占重量.46％至.54％的蛋白胨，
约占重量.26％至.34％的酵母浸出汁，
约占重量.4％至.6％的酶诱导物，
约占重量.73％至.77％的盐，
约占重量.48％至.52％的丙酮酸盐，
约占重量.01％至.03％的去污性剂，
约占重量.009％至.011％的胆汁盐，和
进一步包括一定量的4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷以产生作为荧光产物的4-甲基伞形酮；
(c)将滤器放在培养基上，培养基包含在容器中；
(d)提供培养装置，它具有热传递介质，可保持与所放置的每个容器紧密的物理接触；
(e)在约为7小时的期间内培养培养容器；
(f)培养期间后，用预定激发波长的光照射培养容器；
(g)对培养基上的可见微菌落计数；和
(h)当至少可见一个荧光微菌落时，可推断每100毫升原始样品中至少含有一个粪便大肠杆菌类细胞。
74.如权利要求73的方法，其中蛋白胨是3号胨蛋白胨，酶诱导物是乳糖，盐是NaCl，去污剂是十二烷基硫酸钠。
75.如权利要求73的方法，其中启动培养基进一步包括占重量.004％至.006％的4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸。
76.如权利要求73的方法，进一步包括在对微菌落计数前，对微菌落施用碱性溶液以加强荧光。
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