CN105916504B - 用于治疗癌症的组合制剂 - Google Patents

Abstract

描述了用于治疗癌症的组合制剂。所述组合制剂包含：(a)能够与MHC II类分子结合的LAG‑3蛋白或其衍生物；和(b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂是基于铂的抗肿瘤剂或拓扑异构酶I抑制剂。还描述了使用所述组合制剂治疗癌症的方法。

Description

用于治疗癌症的组合制剂

本发明涉及组合制剂和药物组合物以及其作为药物，特别是用于治疗癌症之药物的用途以及用于治疗癌症的方法。

可以用一种或更多种细胞毒性抗肿瘤药物(“化学治疗剂”)作为标准化方案的一部分治疗癌症。化学疗法的目的可以是治愈患者或延长寿命或减轻症状。

常规的化学治疗剂通过杀伤快速***的细胞，利用大多数癌细胞的一种特性起作用。然而，化学疗法还损害在正常情况下快速***的细胞，例如在骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这引起化学疗法最常见的副作用：骨髓抑制(血细胞的产生减少，因此也引起免疫抑制)、粘膜炎(消化道内衬的炎症)和秃头症(脱发)。

需要提供更有效的癌症治疗以及提供副作用减少的有效的癌症治疗。

淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)是具有四个胞外Ig超家族结构域的CD4同源I型膜蛋白。与CD4类似，LAG-3在T细胞的表面寡聚化并且以比CD4显著更高的亲和力与抗原呈递细胞(APC)上的MHC II类分子结合。LAG-3在活化的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上表达，在那里其与在细胞表面处的CD3-TCR复合体缔合并负调控信号转导。因此，它负调控T细胞的增殖、功能和稳态。

已显示LAG-3衍生的可溶性融合蛋白以比CD4高得多的亲合力与MHC II类分子结合以提高MHC II类阳性巨噬细胞和未成熟树突细胞在体外诱导T细胞应答的能力，并增加病毒和肿瘤特异性细胞毒性T细胞的体外诱导。因此，LAG-3融合蛋白被用作全身免疫刺激剂以及作为癌症疫苗的佐剂。

WO 2009/044273描述了使用重组LAG-3蛋白或其衍生物以用于加强单核细胞介导的免疫应答，特别是诱导血液中单核细胞数目的提高以用于治疗癌症。

现在已经出人意料地发现，施用能够与MHC II类分子结合的LAG-3蛋白或其衍生物，以及基于铂的抗肿瘤剂(anti-neoplastic agent)或拓扑异构酶I抑制剂对于减少肿瘤生长聚有协同作用。

根据本发明提供了组合制剂，其包含：(a)能够与MHC II类分子结合的LAG-3蛋白或其衍生物；和(b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂是基于铂的抗肿瘤剂或拓扑异构酶I抑制剂。

本文使用的术语“组合制剂”是指“成套药盒(kit of parts)”，在该意义上如上定义的组合组分(a)和(b)可独立地给药或通过使用具有不同量的组合组分(a)和(b)的不同固定组合给药。所述组分可以同时施用或相继施用。如果组分相继施用，则优选地选择施用的时间间隔以使得组合使用所述组分的治疗效果高于仅使用组合组分(a)和(b)中任一种将获得的效果。

组合制剂的组分可以以一个组合单位剂型或者作为组分(a)的第一单位剂型和分开的组分(b)的第二单位剂型存在。在组合制剂中待施用的组合组分(a)与组合组分(b)总量的比可以变化，例如以应对待治疗的患者亚群的需求或单个患者的需求，这可能是由于，例如患者的特定疾病、年龄、性别或体重。

优选地，存在至少一种有益效果，例如增强抗肿瘤剂的效果，或相互增强组合组分(a)和(b)的效果，例如与有效剂量的组合组分(a)和(b)的一个或两个相比，大于叠加效应、额外的有利效果、较小的副作用、较低的毒性或组合的治疗效果，以及非常优选地组合组分(a)和(b)的协同作用。

本发明的组合制剂可作为用于向哺乳动物(优选人)施用的药物组合制剂提供。LAG-3蛋白或其衍生物可任选地与可药用载体、赋形剂或稀释剂一起提供，和/或抗肿瘤剂可任选地与可药用载体、赋形剂或稀释剂一起提供。

LAG-3或其衍生物可以以摩尔当量为0.25mg至30mg、1mg至30mg或6mg至30mg的LAG-3衍生物LAG-3Ig融合蛋白IMP321的剂量存在。已示出每次皮下(s.c.)注射6mg至30mg剂量的IMP321是安全的并基于在转移性肾细胞癌患者中获得的药代动力学数据的结果提供可接受的全身性暴露。在注射有剂量超过6mg的IMP321的患者中在皮下(s.c)注射后至少24小时获得高于1ng/ml的IMP321的血浓度。

本发明的组合制剂可包含多个剂量的LAG-3蛋白或其衍生物。

抗肿瘤剂的剂量将取决于所使用的特定抗肿瘤剂。

基于铂的抗肿瘤剂是在癌症化学疗法中使用的铂的配位络合物。认为它们在DNA中形成抑制DNA修复和/或DNA合成的交联，从而导致细胞死亡。使用铂化合物的癌症治疗的主要剂量限制性副作用是外周神经毒性。基于铂的抗肿瘤剂的实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂和Triplatin。

卡铂或顺式-二氨(环丁烷-1，1-二羧酸酯-O，O′)铂(II)(商品名Paraplatin和Paraplatin-AQ)用于针对一些形式的癌症(主要是卵巢癌、肺癌、头颈癌以及子宫内膜癌、食道癌、膀胱癌、乳腺癌和***；中枢神经***或生殖细胞肿瘤；骨原性肉瘤，以及作为用于干细胞或骨髓移植物的制剂)。与其母体化合物顺铂相比，它大大降低了副作用。卡铂给药的指南可从美国食品和药物管理局(FDA)获得。

奥沙利铂或[(1R，2R)-环己烷-1，2-二胺(乙二酸-O，O′)铂(II)(商品名Eloxatin)包含正方形平面铂(II)中心。与顺铂和卡铂相反，奥沙利铂包含二齿配体1，2-环己二胺代替二个单齿氨合物配体。它还具有二齿草酸盐基团。奥沙利铂具有针对结肠癌的抗肿瘤活性。奥沙利铂通过在DNA中形成链内和链间交联而发挥功能。在DNA中的交联阻止DNA复制和转录，从而导致细胞死亡。在辅助治疗情形下奥沙利铂的推荐剂量为每两周静脉内重复注射85mg/m²，进行12个周期。在治疗转移性结直肠癌中奥沙利铂的推荐剂量为每两周静脉内重复注射85mg/m²，直至出现疾病进展或不可接受的毒性。

拓扑异构酶抑制剂是设计来干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)之作用的药剂，拓扑异构酶是在正常细胞周期中通过催化DNA链的磷酸二酯骨架断裂和再连接而控制DNA结构变化的酶。认为拓扑异构酶抑制剂阻断细胞周期的连接步骤，从而产生损害基因组完整性的单链和双链断裂。这些断裂的引入随后导致凋亡和细胞死亡。

人DNA拓扑异构酶I(Top1)是在复制和转录期间使DNA超螺旋松弛的必需酶。Top1产生DNA单链断裂，这使得经切割的链绕双螺旋轴旋转。Top1还将经切割的链重新连接成重新建立的完整双链DNA。Top1-DNA中间体(称为切割复合物)是瞬时的且在正常情况下以低水平存在。然而，用Top1抑制剂(例如喜树碱)的治疗稳定了可切割复合物、阻止DNA再连接并诱导致命的DNA链断裂。癌细胞对这些DNA损伤的产生选择性地敏感。

拓扑替康(topotecan)或(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3’，4’：6，7]氮茚并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮单盐酸盐(商品名：Hycamtin)是拓扑异构酶I抑制剂类的化学治疗剂。它是喜树碱的水溶性衍生物。它以盐酸盐的形式用于治疗卵巢癌和肺癌以及其他癌症类型。拓扑替康是喜树碱的半合成衍生物。喜树碱是从喜树(Camptotheca acuminata)的树皮中提取的一种天然产物。拓扑异构酶I是通过打开单链断裂释放DNA中扭转应变(torsional strain)的核酶。一旦拓扑异构酶I产生单链断裂，则DNA可以在前进的复制叉前面旋转。拓扑替康***DNA碱基之间。当DNA复制机器到达拓扑替康***位点时，这种***破坏了DNA复制机器。这种破坏阻止DNA复制，并最终导致细胞死亡。哺乳动物细胞不能有效地修复这些双链断裂。该过程引起DNA链断裂，从而导致凋亡。

Hycamtin胶囊的推荐剂量为2.3mg/m²身体表面积/天，连续施用五天，在每个疗程开始之间间隔3周。

另一种喜树碱衍生物伊立替康(CPT11)被批准用于治疗结肠癌。

本发明的组合制剂可包含多个剂量的抗肿瘤剂。

LAG-3蛋白可以是分离的天然或重组LAG-3蛋白。LAG-3蛋白可包含来自任何合适物种的LAG-3蛋白(例如灵长类动物或鼠LAG-3蛋白，但优选人LAG-3蛋白)的氨基酸序列。在Huard等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，11∶5744-5749，1997)的图1中提供了人和鼠LAG-3蛋白的氨基酸序列。在下图13中重复了人LAG-3蛋白的序列(SEQ ID NO：1)。在Huard等的图1中还鉴定了人LAG-3的四个胞外Ig超家族结构域(D1、D2、D3和D4)的氨基酸序列，其在以下氨基酸残基处：1-149(D1)；150-239(D2)；240-330(D3)；和331-412(D4)。

LAG-3蛋白的衍生物包括能够与MHC II类分子结合的LAG-3蛋白的片段、变体或突变体。已知LAG-3蛋白的几种衍生物能够与MHC II类分子结合。在Huard等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，11：5744-5749，1997)中描述了这样的衍生物的许多实例。该文件描述了在LAG-3蛋白上MHC II类结合位点的特征。描述了用于制备LAG-3突变体的方法以及用于确定LAG-3突变体与II类阳性Daudi细胞结合能力的定量细胞粘附测定。测定了LAG-3的几个不同突变体与MHC II类分子的结合。一些突变能够减少II类结合，而其他突变则提高LAG-3对II类分子的亲和力。许多对于结合MHC II类蛋白所必需的残基在LAG-3 D1结构域之大的30个氨基酸额外环结构的碱基处簇集。人LAG-3蛋白D1结构域之额外环结构的氨基酸序列为图13中加下划线的序列GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(SEQ ID NO：2)。

LAG-3蛋白衍生物可包含人LAG-3D1结构域的30个氨基酸的额外环序列或具有一个或更多个保守氨基酸替换的这样的序列的变体。所述变体可包含与人LAG-3D1结构域的30个氨基酸的额外环序列具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。

LAG-3蛋白的衍生物可包含LAG-3蛋白(优选人LAG-3蛋白)的结构域D1和任选结构域D2的氨基酸序列。

LAG-3蛋白的衍生物可包含与LAG-3蛋白(优选人LAG-3蛋白)的结构域D1或结构域D1和D2具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。

LAG-3蛋白的衍生物可包含LAG-3蛋白(优选人LAG-3蛋白)的结构域D1、D2、D3和任选D4的氨基酸序列。

LAG-3蛋白的衍生物可包含与LAG-3蛋白(优选人LAG-3蛋白)的结构域D1、D2和D3或结构域D1、D2、D3和D4具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。

氨基酸序列之间的序列同一性可通过比较序列的比对来确定。当被比较的序列中的等效位置被相同的氨基酸占据时，那么该分子在该位置是相同的。将比对评分为同一性百分比，其是在被比较序列共有位置上相同氨基酸数目的函数。当比较序列时，最佳比对可能需要将空位引入一个或更多个序列中以考虑所述序列中可能的***和缺失。序列比较方法可采用空位罚分以使得对于所比较序列中相同数目的相同分子具有尽可能少空位的序列比对(这反映了两个比较序列之间更高的相关性)将比具有许多空位的序列实现更高的得分。考虑到空位罚分，最大百分比同一性的计算包括产生最佳比对。

用于进行序列比较的合适的计算机程序可从商业和公共部门广泛获得。实例包括MatGat(Campanella等，2003，BMC Bioinformatics 4：29；可从http：//bitincka.com/ledion/matgat获得程序)、Gap(Needleman&Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；可从http：//www.ebi.ac.uk/fasta获得程序)、Clustal W 2.0和X 2.0(Larkin等，2007，Bioinformatics 23：2947-2948；可从http：//www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2获得程序)和EMBOSS成对比对算法(Needleman&Wunsch，1970，同上；Kruskal，1983，在：Time warps，string edits and macromolecules：the theory and practice of sequence comparison，Sankoff&Kruskal(编辑)，第1-44页，Addison Wesley；可从http：//www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align获得程序)。所有程序都可以使用默认参数运行。

例如，可以使用EMBOSS成对比对算法的“needle”法进行序列比较，当考虑两个序列的整个长度时，其决定了这两个序列的最佳比对(包括空位)并提供百分比同一性得分。氨基酸序列比较(“蛋白质分子”选项)的默认参数可能是空位延伸罚分：0.5，空位开放罚分：10.0，矩阵：Blosum 62。

序列比较可以在参照序列的全长上进行。

LAG-3蛋白衍生物可任选地通过接头氨基酸序列与免疫球蛋白Fc氨基酸序列(优选人IgG1 Fc氨基酸序列)融合。

可使用如Huard等(同上)中所述的定量细胞粘附测定来确定LAG-3蛋白的衍生物与MHC II类分子结合的能力。LAG-3蛋白的衍生物对MHC II类分子的亲和力可以是人LAG-3蛋白对II类分子亲和力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。优选地，LAG-3蛋白的衍生物对MHC II类分子的亲和力是人LAG-3蛋白对II类分子的亲和力的至少50％。

能够与MHC II类分子结合的合适的LAG-3蛋白衍生物的实例包括包含以下的衍生物：

人LAG-3序列的23至448位氨基酸残基；

LAG-3的结构域D1和D2的氨基酸序列；

LAG-3的结构域D1和D2的氨基酸序列，其中在一个或更多个以下位置具有氨基酸替换：73位ARG被替换为GLU；75位ARG被替换为ALA或GLU；76位ARG被替换为GLU；30位ASP被替换为ALA；56位HIS被替换为ALA；77位TYR被替换为PHE；88位ARG被替换为ALA；103位ARG被替换为ALA；109位ASP被替换为GLU；115位ARG被替换为ALA；

54至66位氨基酸残基缺失的LAG-3D1结构域的氨基酸序列；

重组可溶性人LAG-3Ig融合蛋白(IMP321)-在转染有编码与人IgG1 Fc融合的hLAG-3的胞外结构域的质粒之中国仓鼠卵巢细胞中产生的200-kDa二聚体。

根据本发明，还提供了药物组合物，其包含(a)能够与MHC II类分子结合的LAG-3蛋白或其衍生物；(b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂是基于铂的抗肿瘤剂或拓扑异构酶I抑制剂；和(c)可药用载体、赋形剂或稀释剂。

根据本发明，还提供了本发明的组合制剂或药物组合物，其用作药物。

本发明还提供了本发明的组合制剂或药物组合物，其用于预防、治疗或改善癌症。

根据本发明还提供了本发明的组合制剂或药物组合物在制备用于预防、治疗或改善癌症的药物中的用途。

根据本发明还提供了预防、治疗或改善癌症的方法，其包括向有此预防、治疗或改善需要的对象施用能够与MHC II类分子结合的LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂是基于铂的抗肿瘤剂或拓扑异构酶I抑制剂。

可向对象依次施用LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂，即可以在抗肿瘤剂之前、同时与之后施用LAG-3蛋白或其衍生物。

LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂可在相差96小时、72小时、48小时、24小时或12小时内向对象施用。

或者，可向对象共施用LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂，例如作为包含LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂的组合物，或通过同时施用分开剂量的LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂。

根据一些实施方案，向对象施用多个剂量的LAG-3蛋白或其衍生物和/或多个剂量的抗肿瘤剂。

根据一些实施方案，在每次施用两个或更多个剂量的抗肿瘤剂之前、同时或之后施用一个剂量的LAG-3蛋白或其衍生物。

例如，可以在每次施用两个或更多个剂量的抗肿瘤剂的96小时、72小时、48小时、24小时或12小时内施用一个剂量的LAG-3蛋白或其衍生物。

根据本发明在组合治疗中使用的组分之合适剂量的选择可由技术人员来确定和优化，例如，通过对患者进行观察，包括患者的整体健康状况和对组合治疗的响应。例如，如果确定患者没有表现出所期望的治疗效果或相反地，如果患者正在经历数量过多或引起麻烦的严重程度的不期望的或不良副作用，则可能需要优化。

应该对根据本发明在组合治疗中使用的组分的剂量进行选择以提供治疗有效量的组合中的组分。组合治疗的“有效量”是导致与癌症相关的至少一种病理参数降低的量。例如，在一些实施方案中，组合治疗的有效量是与没有进行组合治疗的癌症相关参数的预期降低相比，有效实现参数降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。例如，所述参数可以是肿瘤生长。

根据本发明，与作为单一疗法的抗肿瘤剂或者LAG-3蛋白或其衍生物的效果相比，可采用组合治疗来提高抗肿瘤剂或者LAG-3蛋白或其衍生物的治疗效果，或降低所得组合中单个组分的剂量，同时防止或进一步降低单个组分不期望的或有害的副作用的风险。

在一个实施方案中，规定LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂的剂量各自在各化合物作为单一疗法的通常所规定剂量范围内。可以规定化合物为单独剂量或组合剂量。与任一化合物作为单一疗法的效果相比，这样的组合提供了提高的效力。

在另一个实施方案中，规定LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂的剂各自低于各组分作为单一疗法的通常所规定剂量，但为在组合中具有治疗效力的剂量。可以规定组分为单独剂量或组合剂量。可以选择组合中成分的剂量以提供与LAG-3蛋白或其衍生物或者抗肿瘤剂作为单一疗法之类似水平的治疗效力，但是与各化合物作为单一疗法的规定剂量相比，其优点是较低剂量的LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂降低了不利的副作用的风险。

在另一个实施方案中，抗肿瘤剂的规定剂量在单一疗法的通常所规定剂量范围内，并且规定LAG-3蛋白或其衍生物的剂量低于单一疗法的通常所规定剂量。

在又一个实施方案中，抗肿瘤剂的规定剂量低于单一疗法的通常所规定剂量，并且规定LAG-3蛋白或其衍生物的剂量在单一疗法的通常所规定剂量范围内。

低于单一疗法的通常所规定剂量的优选剂量是通常所规定剂量的至多50％或至多25％的剂量。

当以单独剂量施用时，LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂可以基本上同时施用(例如，在相差约60分钟、约50分钟、约40分钟、约30分钟、约20分钟、约10分钟、约5分钟或约1分钟内)或者在时间上间隔约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约72小时、或约96小时、或更长时间。

技术人员将能够确定并优化依次施用的合适的时间过程，这取决于LAG-3蛋白或其衍生物和抗肿瘤剂的特定组合。优选地选择所述时间过程以使得存在至少一种有益效果，例如增强LAG-3蛋白或其衍生物或者抗肿瘤剂的效果，或者相互增强组合组分的效果，例如与非有效剂量的组合组分的一个或两个相比，大于叠加效应、额外的有利效果、较小的副作用、较低的毒性或者组合治疗效果，以及非常优选组合组分的协同作用。

应理解，最佳时间过程将取决于这样的因素，例如在施用后达到化合物的峰血浆浓度所花费的时间以及每个化合物的消除半衰期。优选地，时间差小于待施用的第一组分的半衰期。

技术人员还将能够确定用于施用的适当时机。在某些实施方案中，抗肿瘤剂可以在早晨施用，而LAG-3蛋白或其衍生物在当天晚些时候施用至少一次。在另一些实施方案中，抗肿瘤剂和LAG-3蛋白或其衍生物可以在基本上相同的时间施用。

在一些实施方案中，可以(例如，由医务人员)向对象施用抗肿瘤剂，以及可以为对象提供一定剂量的LAG-3蛋白或其衍生物(例如以预填充注射器的形式)以随后施用(例如在同一天的晚些时候或第二天)。

对象可以在数周、数月或数年的时间段内接受抗肿瘤剂和LAG-3蛋白或其衍生物的剂量。例如，1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年或更长时间。

优选地，对象是哺乳动物对象，更优选人对象。

根据本发明可治疗的癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头癌、颈癌、子宫内膜癌、食道癌、膀胱癌、***、骨原性肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、淋巴瘤和中枢神经***或生殖细胞肿瘤。

一般而言，本发明组合的组分或本发明的组合物可通过已知的方法，以任何合适的制剂，通过任何合适的途径施用。在一些实施方案中，LAG-3蛋白或其衍生物经胃肠外施用(包括皮下、静脉内或肌内注射)。在一些实施方案中，抗肿瘤剂是静脉内施用的。在一些具体的实施方案中，LAG-3蛋白或其衍生物是皮下施用的，而抗肿瘤剂是静脉内施用的。

可使用药物制剂领域的技术人员已知的和在相关文本和文献例如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Easton，Pa.：Mack Publishing Co.，1995)中描述的常规方法来制备合适的药物组合物和剂型。

为了使施用方便和剂量均匀，以单位剂型配制本发明的组合或组合物是特别有利的。本文使用的术语“单位剂型”是指适合以单元剂量(unitary dosage)用于待治疗个体的物理离散单位。换言之，组合物被配制成离散剂量单位，各自含有经计算以产生与所需药物载体相关的期望治疗效果之预定“单位剂量”量的活性剂。本发明的单位剂型的规格取决于待递送的活性剂的独特特征。还可以通过参考成分的常用剂量和施用方式来确定剂量。应指出，在一些情况下，组合中两个或更多个单独的剂量单位提供治疗有效量的活性剂，例如，一起服用的两个片剂或胶囊剂可提供治疗有效剂量，以使得各片剂或胶囊剂中的单位剂量是治疗有效量的约50％。

用于肠胃外施用的根据本发明的制剂包括无菌的水性和非水性溶液、混悬液和乳剂。可注射的水性溶液含有水溶性形式的活性剂。非水性溶剂或载剂的实例包括脂肪油，例如橄榄油和玉米油；合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯；低分子量醇，例如丙二醇；合成的亲水聚合物，例如聚乙二醇、脂质体等。肠胃外制剂还可含有助剂，例如增溶剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂和稳定剂，水性混悬液可含有提高混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和葡聚糖。可通过并入灭菌剂、通过截留细菌的过滤器过滤、辐照或加热来使可注射的制剂无菌。还可使用无菌可注射介质制备它们。活性剂还可以是干燥的形式，例如，冻干的形式，其可在即将通过注射施用前用合适的载剂再水化。

除了先前描述的制剂，活性剂还可被配制为用于活性剂受控释放(优选在延长的时间段内持续释放)的长效制剂(depot preparation)。这些持续释放剂型通常通过植入施用(例如，皮下或肌内或通过肌内注射)。

本发明的组合制剂可以与组合的组分施用的说明书一起包装。说明书可以记录在合适的记录介质或基质上。例如，说明书可以被印刷在基质(例如纸或塑料)上。说明书可以作为在容器或其组件的标签中的包装插页存在(即，与包装或分包装有关)。在另一些实施方案中，说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、磁盘)上的电子存储数据文件存在。组合制剂的一些或所有组分可以包装在合适的包装中以保持无菌。

在下面的实施例中参考附图描述了本发明的一些实施方案，其中：

图1示出了在癌症治疗中施用LAG-3衍生物和拓扑替康的作用；

图2示出了在癌症治疗中施用LAG-3衍生物和卡铂的作用；

图3示出了在癌症治疗中施用(A)LAG-3衍生物和卡铂，或(B)LAG-3衍生物和奥沙利铂的作用；

图4示出了在癌症治疗中施用LAG-3衍生物和奥沙利铂的作用：(A)示出了对肿瘤尺寸的作用，和(B)示出了对存活的作用；

图5示出了与免疫球蛋白Fc(IgFc)序列融合的LAG-3蛋白的衍生物的示意图；

图6示出了LAG-3衍生物与MHC II类阳性细胞的结合；

图7示出了通过阻断LAG-3与MHC II类分子结合的抗体抑制LAG-3衍生物与MHC II类阳性细胞的结合；

图8示出了通过LAG-3衍生物活化THP-1细胞，如通过CCL4分泌确定的；

图9示出了通过LAG-3衍生物活化THP-1细胞，如通过TNF-α分泌确定的；

图10示出了通过阻断LAG-3与MHC II类分子结合的抗体抑制LAG衍生物诱导的单核细胞活化；

图11示出了通过LAG-3衍生物活化抗原呈递细胞(APC)；

图12示出了通过LAG-3衍生物活化CD8阳性T细胞；和

图13示出了成熟人LAG-3蛋白的氨基酸序列。四个胞外Ig超家族结构域在以下氨基酸残基处：1-149(D1)；150-239(D2)；240-330(D3)；和331-412(D4)。人LAG-3蛋白D1结构域之额外环结构的氨基酸序列以下划线粗体示出。

实施例1

在癌症治疗中施用LAG-3衍生物和拓扑异构酶I抑制剂的作用

使用结直肠腺癌细胞系CT26建立鼠同源皮肤肿瘤模型。

在第0天通过皮下(s.c.)注射，向四组BALB/c小鼠(5周龄)的右侧胁(flank)植入四分之一最小致瘤剂量(minimum tumorigenic dose，MTD)的肿瘤细胞(0.5×10⁵个细胞)。按照下列时间表，用磷酸缓冲盐水(PBS)(第1组小鼠)、LAG-3衍生物IMP321(第2组小鼠)、IMP321和拓扑替康(第3组小鼠)或拓扑替康单独(第4组小鼠)注射小鼠：

第1组(8只小鼠)：阴性对照：在D11、D14、D18、D21、D25和D28皮下(s.c.)注射PBS；

第2组(7只小鼠)：在D11、D14、D18、D21、D25和D28皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，1.9mg/ml)；

第3组(8只小鼠)：在D11、D14、D18、D21、D25和D28皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，1.9mg/ml)，并且在D10、D13和D17腹膜内(i.p.)注射拓扑替康(45μg，2.5mg/kg)；

第4组(8只小鼠)：在D10、D13和D17腹膜内(i.p.)注射拓扑替康(45μg，2.5mg/kg)。

每周两次通过使用卡尺测量两个垂直的肿瘤直径监测肿瘤生长。结果示于图1中。肿瘤尺寸意指以mm²计的截面面积。

结果表明，IMP321单独对肿瘤生长没有作用，拓扑替康对减少肿瘤生长有一些作用，但IMP321和拓扑替康的组合治疗具有更大的(即，协同)作用。

实施例2

在癌症治疗中施用LAG-3衍生物和基于铂的抗肿瘤剂的作用

使用淋巴瘤细胞系EL4建立鼠同源皮肤肿瘤模型。

在第0天通过皮下(s.c.)注射向C57B1/6小鼠(5周龄)的右侧胁植入最小致瘤剂量(MTD)的肿瘤细胞(5×10⁵个细胞)。按照以下时间表，用磷酸缓冲盐水(PBS)(第1组小鼠)、IMP321(第2组小鼠)、IMP321和卡铂(第3组小鼠)或卡铂单独(第4组小鼠)注射小鼠：

第1组(8只小鼠)：阴性对照：在D7、D11、D14、D19、D21和D24皮下(s.c.)注射PBS；

第2组(8只小鼠)：在D7、D11、D14、D19、D21和D24皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，3.96mg/ml)；

第3组(8只小鼠)：在D7、D11、D14、D19、D21和D24皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，3.96mg/ml)，并且在D6、D10、D13和D17腹膜内(i.p.)注射卡铂(288μg，16mg/kg)；

第4组(8只小鼠)：在D6、D10、D13和D17腹膜内(i.p.)注射卡铂(288μg，16mg/kg)。

每周两次通过使用卡尺测量两个垂直的肿瘤直径监测肿瘤生长。结果示于图2中。肿瘤尺寸意指以mm²计的截面面积。

结果表明，IMP321单独对肿瘤生长没有作用，卡铂单独有很小的作用(如果有的话)，但IMP321和卡铂的组合治疗减少了肿瘤生长，从而证明了组合施用的协同作用。

实施例3

在癌症治疗中施用LAG-3衍生物和不同的基于铂的抗肿瘤剂的作用

使用淋巴瘤细胞系EL4建立鼠同源皮肤肿瘤模型。

在第0天通过皮下(s.c.)注射向C57B1/6小鼠(5周龄)的右侧胁植入最小致瘤剂量(MTD)的肿瘤细胞(5×10⁵个细胞)。按照以下时间表，用磷酸缓冲盐水(PBS)(第1组小鼠)、IMP321(第2组小鼠)、IMP321和卡铂(第3组小鼠)、卡铂单独(第4组小鼠)、IMP321和奥沙利铂(第5组小鼠)或奥沙利铂单独(第6组小鼠)注射小鼠：

第1组(10只小鼠)：阴性对照：在D7、D11、D14、D18、D21和D25皮下(s.c.)注射PBS；

第2组(10只小鼠)：在D7、D11、D14、D18、D21和D25皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，1.9mg/ml)；

第3组(9只小鼠)：在D7、D11、D14、D18、D21和D25皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，1.9mg/ml)，并且在D6、D10、D13和D17腹膜内(i.p.)注射卡铂(288μg，16mg/kg)；

第4组(10只小鼠)：在D6、D10、D13和D17腹膜内(i.p.)注射卡铂(288μg，16mg/kg)；

第5组(10只小鼠)：在D7、D11、D14、D18、D21和D25皮下(s.c.)注射IMP321(50μg，1.9mg/ml)，并且在D6和D10腹膜内(i.p.)注射奥沙利铂(54μg，3mg/kg)；

第6组(10只小鼠)：在D6和D10腹膜内(i.p.)注射奥沙利铂(54μg，3mg/kg)。

每周两次通过使用卡尺测量两个垂直的肿瘤直径监测肿瘤生长。结果示于图3A(对于卡铂)和图3B(对于奥沙利铂)中。肿瘤尺寸意指以mm²计的截面面积。

结果表明，IMP321单独具有很小的作用(如果有的话)，卡铂单独具有一些作用，而IMP321和卡铂的组合治疗有更大的(即，协同)作用。奥沙利铂单独具有作用，但IMP321和奥沙利铂的组合治疗具有甚至更大的(即，协同)作用，在第17天肿瘤生长被完全抑制。

实施例4

在治疗癌症中施用LAG-3衍生物和基于铂的抗肿瘤剂的作用

评估了在C38结肠腺癌肿瘤模型中LAG-3衍生物IMP321(也称为hLAG-3Ig)和奥沙利铂的组合治疗的作用。在该模型中，肿瘤碎片经手术皮下植入。当治疗开始时(在第12天，当平均肿瘤体积为200mm³时)，肿瘤相对成熟，因此为现实的肿瘤提供了很好的模型。

从Division of Cancer Treatment，Tumor Repository，NCI(Frederick，MD，USA)冷冻获得小鼠结肠38(C38)肿瘤碎片。将C38碎片在DMSO/SVF/RPMI 1640培养基(10/10/80)中于液氮中冷冻储存直至使用。将该碎片在37℃下解冻5分钟，在RPMI 1640培养基中润洗两次，之后皮下(SC)植入小鼠中。将C38肿瘤连续地移植到C57Bl/6小鼠中。

将小的C38肿瘤碎片(20-30mg)经皮下植入12只C57BL/6小鼠的右侧胁。当肿瘤尺寸达到500mm³-1000mm³时，经手术切除肿瘤并将小的C38肿瘤碎片(20-30mg)经皮下植入接受者C57BL/6小鼠的右侧胁。

当肿瘤达到200-300mm³的平均体积时开始处理。处理时间表如下：

第1组(10只小鼠)：每周一次皮下(SC)注射PBS，连续4周；

第2组(10只小鼠)：每周一次以5mg/kg/注射静脉内(IV)注射奥沙利铂，连续4周；

第3组(10只小鼠)：每周一次皮下(SC)注射20μg IMP321，连续4周；

第4组(10只小鼠)：每周一次以5mg/kg/注射静脉内(IV)注射奥沙利铂并且与每周一次皮下(SC)注射20μg IMP321组合，连续4周。

在第12天(D12)当不同的组具有200mm³的平均肿瘤体积时开始处理。在D12、D19、D26和D33注射PBS或奥沙利铂。在注射奥沙利铂后一天，也就是在D13、D20、27和D34注射IMP321。当皮下肿瘤达到2000mm³的最大体积时，处死动物。

^＊在用奥沙利铂处理后一天进行

结果示于图4A中。结果表明IMP321单独对延缓肿瘤生长没有作用。奥沙利铂具有轻微的作用。奥沙利铂和IMP321的组合具有较大的作用。在图4B所示的存活曲线中发现了相同的协同作用。

实施例5

LAG-3的衍生物与MHC II类阳性细胞的结合

对LAG-3的几个衍生物与MHC II类阳性细胞结合的能力进行了测试：

i)通过第一接头与免疫球蛋白Fc(Ig Fc)序列连接的LAG-3的结构域D1-D4(LAG-3D1D4-接头1-Ig，sLAG-3 D1D4-Ig或IMP321)；

ii)通过第二接头与Ig Fc序列连接的LAG-3的结构域D1-D4(LAG-3D1D4-接头2-Ig或sLAG-3D1D4-接头B-Ig)；

iii)通过第二接头与Ig Fc序列连接的LAG-3的结构域D1和D2(LAG-3D1D2-接头2-Ig或sLAG-3D1D2接头B-Ig)；和

iv)通过第一接头与Ig Fc序列连接的LAG-3的结构域D1-D4，但在LAG-3D1结构域的MHC II类结合位点中于R75位具有突变(R75A)，这使与MHC II类分子的结合增强了三倍或更多(Huard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：5744)(IMP321R75A)。

在图5中示出了所述衍生物。

用不同浓度的LAG-3衍生物或用人IgG1抗体(hIgG1)作为阴性对照将MHC II类+Raji细胞在4℃下孵育45分钟。用FITC-缀合的山羊抗小鼠Ig(Coulter)显示与细胞表面结合的LAG-3分子。通过流式细胞术分析细胞。表示为荧光强度单位的结果示于图6中。结果表明，所有的LAG-3衍生物均与MHC II类阳性细胞结合。

实施例6

通过阻断LAG-3与MHC II类分子结合的抗体抑制LAG-3衍生物IMP321与MHC II类 阳性细胞的结合

17B4和11E3是已知阻断LAG-3与MHC II类分子结合的抗LAG-3单克隆抗体。在IMP321标签缀合物(LAG-3Ig-Alexa 488)(4μg/ml在4℃)与17B4或11E3阻断抗体或与同种型匹配的阴性对照单克隆抗体(mIgG1)预孵育之后，测定该缀合物与MHC II类-阳性B细胞(Raji细胞)的结合。使用荧光激活细胞分选(FACS)进行细胞结合荧光的分析。结果示于图7中。

结果表明通过阻断LAG-3与MHC II类分子结合的LAG-3特异性单克隆抗体抑制了IMP321与Raji细胞的结合。

实施例7

通过LAG-3衍生物活化单核细胞

将THP-1细胞与图5中所示的LAG-3衍生物或与作为阴性对照的人IgG1在4℃下孵育4小时。测定了THP-1细胞分泌的趋化因子CCL4和细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)量，并用作单核细胞活化的量度。使用细胞计量微珠阵列(Cytometric Beads Array)在细胞上清液中定量CCL4和TNF-α分泌。CCL4测定的结果示于图8中，TNF-α测定的结果示于图9中。

结果表明，LAG-3衍生物均能够活化THP-1单核细胞。

实施例8

通过阻断LAG-3与MHC II类分子结合的抗体抑制IMP321诱导的单核细胞活化

将IMP321(20ng/ml)与17B4或11E3抗体预孵育(在+37℃下)，之后将该混合物与THP-1细胞孵育4小时。使用THP-1细胞分泌的CCL4的量来确定单核细胞活化的水平。两次实验的结果示于图10中。

结果证明，IMP321诱导的单核细胞活化被阻断性抗LAG-3单克隆抗体17B4和11E3所抑制。这表明IMP321活化单核细胞的能力依赖于IMP321与MHC II类分子的结合。

实施例9

通过LAG-3衍生物活化原代抗原呈递细胞(APC)

在布雷菲德菌素(brefeldin)(一种分泌抑制剂)的存在下，将人外周血单核细胞(PBMC)与图5中所示的LAG-3衍生物或与作为阴性对照的人IgG1孵育4小时。通过CCL4(一种已知有利于Th1和CD8阳性应答的趋化因子)和TNF-α(一种直接抑制肿瘤发生的多功能细胞因子)的胞内染色来确定存在于PBMC中的APC的细胞因子应答。通过细胞计量术分析结果。由在MHC II类阳性细胞中表达CCL4和/或TNF-α的细胞百分比所表示的结果示于图11中。

结果表明，所有经测试的LAG-3衍生物均能诱导产生CCL4和TNF-α。

实施例10

通过LAG-3衍生物活化T细胞

将人PBMC与图5中所示的LAG-3衍生物，或与作为阴性对照的人IgG1孵育18小时。在孵育的最后16小时存在布雷菲德菌素。在暴露于LAG-3衍生物18小时之后，通过CCL4、IFN-γ和TNF-α的胞内染色追踪CD8阳性T细胞的细胞因子应答并通过细胞计量术分析。由在CD3阳性/CD8阳性T细胞中表达CCL4、IFN-γ和/或TNF-α的细胞百分比所表示的结果示于图12中。

结果表明，所有经测试的LAG-3衍生物均能诱导1型细胞毒性CD8阳性T细胞(Tc1细胞)的活化。得出结论，通过与APC表达的MHC II类分子结合，LAG-3衍生物诱导了Tc1细胞的活化。Tc1细胞的活化形成主要抗肿瘤免疫应答。

Claims (16)

1.组合制剂在制备用于预防、治疗或改善癌症的药物中的用途，其中所述组合制剂包含：(a)LAG-3Ig融合蛋白IMP321；和(b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂是奥沙利铂或卡铂的基于铂的抗肿瘤剂，或拓扑替康的拓扑异构酶I抑制剂，并且其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头癌、颈癌、子宫内膜癌、食道癌、膀胱癌、***、骨原性肉瘤、或结肠直肠癌、淋巴瘤、或中枢神经***或生殖细胞肿瘤。

2.根据权利要求1所述的用途，其用于共施用或依次施用所述IMP321和所述抗肿瘤剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述IMP321与所述抗肿瘤剂是分开的。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述IMP321以0.25mg至30mg的剂量存在。

5.根据权利要求1所述的用途，其包含多个剂量的所述IMP321。

6.根据权利要求1所述的用途，其包含多个剂量的所述抗肿瘤剂。

7.药物组合物在制备用于预防、治疗或改善癌症的药物中的用途，其中所述药物组合物包含：(a)LAG-3Ig融合蛋白IMP321；(b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂是奥沙利铂或卡铂的基于铂的抗肿瘤剂，或拓扑替康的拓扑异构酶I抑制剂；和(c)可药用载体，并且其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头癌、颈癌、子宫内膜癌、食道癌、膀胱癌、***、骨原性肉瘤、或结肠直肠癌、淋巴瘤、或中枢神经***或生殖细胞肿瘤。

8.LAG-3Ig融合蛋白IMP321和抗肿瘤剂在制备用于在有此预防、治疗或改善需要的对象中预防、治疗或改善癌症的药物中的用途，其中所述抗肿瘤剂是奥沙利铂或卡铂的基于铂的抗肿瘤剂，或拓扑替康的拓扑异构酶I抑制剂，并且其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头癌、颈癌、子宫内膜癌、食道癌、膀胱癌、***、骨原性肉瘤、或结肠直肠癌、淋巴瘤、或中枢神经***或生殖细胞肿瘤。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述IMP321和所述抗肿瘤剂向所述对象依次施用。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述IMP321在所述抗肿瘤剂之后施用。

11.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述IMP321和所述抗肿瘤剂在相差96小时内向所述对象施用。

12.根据权利要求8所述的用途，其中所述IMP321和所述抗肿瘤剂向所述对象共施用。

13.根据权利要求8所述的用途，其中所述IMP321以0.25mg至30mg的剂量向所述对象施用。

14.根据权利要求8所述的用途，其包括向所述对象施用的多个剂量的所述IMP321。

15.根据权利要求8所述的用途，其包括向所述对象施用的多个剂量的所述抗肿瘤剂。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中一个剂量的所述IMP321在每次施用两个或更多个剂量的所述抗肿瘤剂之前、同时或之后施用。

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