CN105911081B - 一种鉴别甘露聚糖肽的方法 - Google Patents

一种鉴别甘露聚糖肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别甘露聚糖肽的方法，属于化学检测领域。本发明采用核磁共振测定得到甘露聚糖肽标准品及供试样品的氢谱，根据甘露聚糖肽的氢谱中异头氢区的谱峰化学位移值、峰形与甘露聚糖肽糖链结构重复单元中不同连接方式的甘露糖残基一一对应，用相似度进行比较，进行定性分析，可准确对甘露聚糖肽进行鉴定。本发明方法有很强的特异性，能显著区分与甘露聚糖肽组成类似的葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖；且重复性好、日间精密度高。为甘露聚糖肽的质量控制及质量标准的提高提供新的方法。

Description

一种鉴别甘露聚糖肽的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别甘露聚糖肽的方法，属于化学检测领域。
背景技术
目前，甘露聚糖肽质量标准中采用化学显色方法对其进行鉴别，主要作用机理为多糖在硫酸的作用下水解成单糖，再迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成有颜色的化合物，故只要有糖的结构均会显色，专属性不强。但这种鉴别方法专属性不强，主要原因是由于甘露聚糖肽结构不明确。因此需建立一种专属性强、操作简便、重复性好的鉴别方法，用于甘露聚糖肽的质量控制。
核磁共振氢谱法是多糖组成和重复单元结构鉴定的有效方法，在分析过程中无需对多糖进行降解或者衍生，能分析不同多糖结构之间的细微差异，也能显现少量内源性和外源性的污染物。但是采用核磁共振鉴别甘露聚糖肽存在诸多问题，包括各种糖残基的相对含量的测定、露聚糖肽核磁共振氢谱异头氢区谱峰的归属以及甘露聚糖肽核磁检测的具体条件。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种核磁共振鉴定甘露聚糖肽的方法。
所述方法是将待测样品的核磁共振氢谱图与甘露聚糖肽标准品的核磁共振氢谱图的峰型和谱峰位移值比对，选定谱图中用作特异性鉴定的光谱区，并计算选定光谱区的相似度。
在本发明的一种实施方式中，甘露聚糖肽样品与甘露聚糖肽标准品的相似度ρ>0.95。即，待测样品与甘露聚糖肽标准品的核磁共振氢谱图的n>0.95，判为甘露聚糖肽。
在本发明的一种实施方式中，所述用作特异性鉴定的光谱区，是δ4.89ppm～δ5.90ppm的异头氢区。
在本发明的一种实施方式中，δ5.29为1,2-连接的甘露糖残基的异头氢信号，δ5.14为1,3-连接的甘露糖残基的异头氢信号，δ5.12和δ5.08为1,2,6-连接的甘露糖残基的异头氢信号，δ5.04为1-连接的甘露糖残基的异头氢信号、δ4.90为1,6-连接的甘露糖残基的异头氢信号。
在本发明的一种实施方式中，所述相似度ρ采用相关系数法进行计算。
在本发明的一种实施方式中，获得待测样品的核磁共振氢谱图及甘露聚糖肽标准品的核磁共振氢谱图的步骤包括：
(1)样品的制备：
准确称取甘露聚糖肽标准品及待测样品各30mg，溶于0.5mL的D2O溶液中，超声至完全溶解，加入10μL 0.2％的TSP重水溶液，超声混合均匀，转移至5mm的核磁管中；
(2)NMR测定：
1H NMR的共振频率为400MHz，采样参数如下：脉冲序列为zgcppr，采样点数为64k，扫描次数为64，空扫次数为4，谱宽为8012.8Hz，脉冲角度为45，采样时间为3.7s，接收增益为10，测试温度为303K，弛豫延迟时间为1.0s，窗函数线宽因子为1Hz。
本发明还提供一种核磁共振检测甘露聚糖肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)样品的制备：
准确称取甘露聚糖肽标准品及待测样品各30mg，溶于0.5mL的D2O溶液中，超声至完全溶解，加入10μL 0.2％的TSP重水溶液，超声混合均匀，转移至5mm的核磁管中；
(2)NMR测定：
1H NMR的共振频率为400MHz，采样参数如下：脉冲序列为zgcppr，采样点数为64k，扫描次数为64，空扫次数为4，谱宽为8012.8Hz，脉冲角度为45，采样时间为3.7s，接收增益为10，测试温度为303K，弛豫延迟时间为1.0s，窗函数线宽因子为1Hz。
本发明采用核磁共振测定得到甘露聚糖肽标准品及供试样品的氢谱，根据甘露聚糖肽的氢谱中异头氢区的谱峰化学位移值、峰形与甘露聚糖肽糖链结构重复单元中不同连接方式的甘露糖残基一一对应，用相似度进行比较，进行定性分析，可准确对甘露聚糖肽进行鉴定。本发明方法有很强的特异性，能显著区分与甘露聚糖肽组成类似的葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖；且重复性好、日间精密度高。为甘露聚糖肽的质量控制及质量标准的提高提供新的方法。
附图说明
图1甘露聚糖肽标准品的1HNMR谱图
图2经重水交换预处理过的样品的1HNMR谱图
图3温度对1HNMR谱图的影响
图4不同温度下TSP的裂分情况
图5葡甘露聚糖(2)、半乳甘露聚糖(3)及甘露聚糖肽(1)的1H-NMR谱叠加图(截取4.85～6.00ppm区)
图6板蓝根糖肽(2)、云芝糖肽(3)、腊梅花多糖(4)及甘露聚糖肽(1)的1H-NMR叠加谱图(截取4.85～6.00ppm区)
图7三份平行制备的甘露聚糖肽供试品的1H-NMR谱图
图8甘露聚糖肽供试品不同日期检测三次的1H-NMR谱图
图9甘露聚糖肽供试品1H-NMR叠加谱图(截取4.85～66.00ppm区)；1.甘聚聚糖肽标准品；2～10.甘露聚糖肽供试品；批号：091202、110901、G100102、131101注射粉、131102注射粉、131101口服粉、140401注射粉、140501注射粉、140502注射粉。
具体实施方式
试剂与仪器
甘露聚糖肽标准品(140652-200401，中国药品生物制品检验所)；TSP(trimethylsilylpropionic，氚代三甲基硅烷丙酸钠盐)，美国Sigma公司；重水，北京希凯创新科技有限公司；甘露聚糖肽样品，成都利尔有限公司；板蓝根糖肽(广州白云山和记黄埔中药有限公司)；云芝糖肽(南京森贝伽生物科技有限公司)；壳寡糖(上海伟康生物科技有限公司)；腊梅花多糖(实验室提取)。腊梅花多糖的制备步骤包括：(1)腊梅花的预处理：制备前用50℃恒温干燥箱将新鲜腊梅花烘干至恒重，用粉碎机粉碎，放入密封袋，置于干燥器中密封保存。(2)腊梅花粗多糖的提取：称取80.0g干燥的腊梅花粉末，加入1600mL去离子水(料液比为1:20)，在2L的圆底烧瓶中100℃回流冷凝2小时，冷却至室温，先用纱布过滤，再用布氏漏斗抽滤，所得残渣用同样的方法再提取一次。将两次抽滤得到的滤液合并，用旋转蒸发仪在50℃下浓缩到30～40mL，加入4倍体积乙醇，置于4℃冰箱里过夜沉淀，离心，冷冻干燥，称重。
DD2 400-MR核磁共振谱仪(安捷伦有限公司)；METTLER AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)。
TSP重水溶液的配制
准确称取10mg氘代TSP[3-(三甲基硅基)丙酸钠]，溶于5mL的D2O(W/V)中，配成0.2％的TSP重水溶液。
样品溶液的配制
准确称取甘露聚糖肽标准品及供试样品各30mg，溶于0.5mL的D2O溶液中，超声至完全溶解，加入10μL 0.2％的TSP重水溶液，超声混合均匀，转移至5mm的核磁管中。
核磁(NMR)测试条件
1H NMR的共振频率为400MHz，采样参数如下：脉冲序列(PULPROG)zgcppr，采样点数(TD)64k，扫描次数(NS)64，空扫次数(DS)4，谱宽(SWH)8012.8Hz，脉冲角度(PW)45，采样时间(AQ)3.7s，接收增益(RG)10，测试温度(TE)303K，弛豫延迟时间(D1)＝1.0s，窗函数线宽因子(Lb)1Hz。
实施例1甘露聚糖肽的结构分析
从甘露聚糖肽口服原料中分离出四种均一糖肽，通过分子量分布、单糖组成、甲基化分析、核磁共振波谱、氨基酸分析等手段研究表明，四种均一糖肽，相对分子质量和氨基酸含量不同，但各均一糖肽单糖组成、糖残基连接方式、核磁共振氢谱几乎完全相同。同时，不同批次甘露聚糖肽注射级原料中分离出2种均一糖肽，对其单糖组成、糖残基连接方式和核磁共振氢谱进行了测定，得到了相同的结论。从而可以确定甘露聚糖肽为相对分子质量、氨基酸含量不同但糖链结构基本相同的均一糖肽的混合物，可以通过核磁共振氢谱法进行鉴定。
对甘露聚糖肽中分离的均一糖肽进行精细结构研究，结果表明其组成以甘露糖为主，并含有少量的葡萄糖；主链由1,6-甘露糖残基构成，支链由1,2-甘露糖残基，1,3-甘露糖残基和末端甘露糖残基构成，分支点为1,2,6-甘露糖残基的O-2位。含有苏氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸等16种氨基酸。
实施例2核磁(NMR)测定甘露聚糖肽的条件
1定标物的选择
定标物的选择要考虑定标物与样品的相溶性及定标物对谱图的信号不产生干扰等因素。NMR实验所用定标物一般有TMS(四甲基硅烷)、DSS[3-(三甲基硅基)丙磺酸钠盐]、TSP[3-(三甲基硅基)丙酸钠]等。TMS不溶于水，而甘露聚糖肽样品由于极性较大，易溶于水，必须采用重水作为溶剂，因此可采用DSS或TSP作为定标物。但DSS结构中有3个亚甲基在1H NMR谱中均有强信号出现，且为多重峰，可能与样品中的信号相干扰。因此，本发明选择氘代TSP为定标物。
2测试温度的选择
由于甘露聚糖肽中1,6-连接的甘露糖残基含量很低，25℃下，其异头氢信号(图2中D峰)很弱，另外由于其化学位移与水峰很接近，所以在常温下以肩峰形式出现在水峰的左侧。
如图3所示，随着温度的升高，水峰移向高场，而1,6-连接的甘露糖残基异头氢信号位移改变很小。但随着温度的升高，内标物TSP的谱峰出现一定程度的裂分(图4)，从而使样品谱峰化学位移难以准确测定；此外，温度升高也对核磁探头的寿命有一定影响。当温度升至30℃，内标物谱峰与25℃相比，未出现明显裂分，1,6-连接的糖残基异头氢信号也基本与水峰分离。
3样品浓度的选择
在采样64次情况下，考察不同浓度甘露聚糖肽样品的δ5.29峰的信噪比(表1.1)和样品溶液的均匀性(目测)。当浓度达到60mg/mL时，信噪比良好，继续增大浓度会导致样品的溶解性和流动性比较差，增加前处理及匀场的困难。
表1样品浓度的影响
4扫描次数的选择
扫描8、16、32、64、128次，δ5.29处谱峰信噪比的变化，结果见表2。
表2扫描次数的影响
综合考虑仪器的时间效率、信噪比等因素，将样品测定的扫描次数定为64次。
5弛豫延迟时间的选择
不同弛豫延迟时间(1、2、5、10s)对δ5.29处峰信噪比的影响，结果见表3。
表3弛豫延迟时间的影响
弛豫延迟时间对δ5.29处谱峰信噪比影响不大，考虑仪器测试的时间效率，将弛豫延迟时间设定为1s。
选择NMR检测条件为：1H NMR的共振频率为400MHz，采样参数如下：脉冲序列(PULPROG)zgcppr，采样点数(TD)64k，扫描次数(NS)64，空扫次数(DS)4，谱宽(SWH)8012.8Hz，脉冲角度(PW)45，采样时间(AQ)3.7s，接收增益(RG)10，测试温度(TE)303K，弛豫延迟时间(D1)＝1.0s，窗函数线宽因子(Lb)1Hz。
实施例3甘露聚糖肽标准品的标准谱图
参照实施例2的NMR检测条件，甘露聚糖肽标准品的1HNMR如图1所示，谱图信号主要集中在δ3.20～5.80ppm之间，分为两个区域：①异头氢区，5.80～4.40ppm；②环质子区，δ4.40～3.20ppm。其中，δ5.29；δ5.14；δ5.12，δ5.08；δ5.04；δ4.90分别为1,2-；1,3-；1,2,6-；1-和1,6-连接甘露糖残基的异头氢信号。葡萄糖和氨基酸因含量较少，未显示出明显的核磁信号。
实施例4方法特异性
为了验证方法的专属性，在相同条件下测定了与甘露聚糖肽组成类似的葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖的核磁谱图(图5)。葡甘露聚糖的单糖组成同甘露聚糖肽相似，也是由葡萄糖和甘露糖两种单糖组成，但连接方式目前认为是由葡萄糖和甘露糖通过β-1,4-吡喃糖苷键结合的杂多糖，在主链甘露糖C3位上存在着通过β-1,3键结合的支链结构。半乳甘露聚糖是由半乳糖和甘露糖构成的杂多糖，与甘露聚糖肽类似，糖链主链也是由甘露糖组成，但其结构是由β-(1-4)-D-甘露糖构成的主链上，通过α-(1-6)-糖苷键连接有单个的D-半乳糖分支。从图5可以看出，由于连接方式的差异，导致两种甘露聚糖异头氢区域的信号与甘露聚糖肽信号差异很大，两者与甘露聚糖肽标准品的相关系数ρ仅有-0.280 1，-0.157 9(远远小于0.95)，可见，该方法具有很强的特异性。
此外，在相同测定条件下，对市售的几种其他多糖及糖肽类产品进行了核磁测定(图6)。结果表明，几种样品在异头氢区域峰型及峰位移值与甘露聚糖肽对照品谱图差别更大，腊梅花粗多糖，云芝糖肽，板蓝根糖肽的谱图与甘露聚糖肽对照品谱图的相关系数ρ分别只有0.560 4，0.045 7，-0.039 8(远远小于0.95)，进一步说明该方法具有很高的特异性。
实施例5方法重复性
三份平行制备的甘露聚糖肽供试品溶液谱图如图7，可以看出，三个样品谱图各特征质子化学位移和峰型均一致，和对照品之间的相关系数分别为0.990 9，0.991 3，0.9976，可见该方法具有较好的重复性。
实施例6日间精密度
同一甘露聚糖肽供试品于不同日期同一时间下测定，结果如图8。各谱图特征质子化学位移和峰型均一致，和甘露聚糖肽对照品之间的相关系数分别为0.991 1，0.994 8，0.990 5，可见该方法具有较高的日间精密度。
实施例7核磁共振氢谱图相似度的测定
以甘露聚糖肽标准品的1H-NMR谱作为标准谱，选择δ(4.89～5.90)ppm异头氢区作为“指纹”鉴定区用作特性鉴定的光谱区。
具体计算方法如下：将对照品及供试品的1H-NMR谱数据转化为ASCII形式的XY数据文件(其中X＝化学位移，Y＝信号强度)，采用Microsoft EXCEL软件来分析所选定光谱区的数据，将光谱文件的Y轴坐标与标准图谱的Y轴坐标进行比较，计算相关系数ρ。如果计算所得的样品图谱与标准图谱峰型和峰位移值一致，并且两者间相关系数大于0.95，则可认为鉴定的样品与对照样品结构一致；反之，测试样品与对照品结构不一致。谱图相似性结果如表4。
从图9可以看出，9个不同批次的甘露聚糖肽供试品的核磁谱图与对照品谱图峰型及峰位移值几乎完全一致，相关系数均大于0.96，说明该方法可以定性鉴别甘露聚糖肽样品。
相关系数法及向量夹角余弦法均可用于计算谱图相似度，但计算结果有所差异。采用夹角余弦法计算，不同批次的甘露聚糖肽原料谱图与甘露聚糖肽标准品谱图相似度均大于0.95，壳寡糖、腊梅花多糖、板蓝根糖肽及云芝糖肽与甘露聚糖肽标准谱图的相似度则分别为：0.7578、0.8398、0.6761和0.6641。采用相关系数法计算，不同批次的甘露聚糖肽原料谱图与甘露聚糖肽标准品谱图相似度均大于0.95，而壳寡糖、腊梅花多糖、板蓝根糖肽及云芝糖肽与甘露聚糖肽标准谱图的相似度分别为：0.1016、0.5604、-0.0398和0.0457。相比之下，采用相关系数法具有更好的特异性。
表4供试品与对照品谱图的相似度
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种核磁共振鉴定甘露聚糖肽的方法，其特征在于，将待测样品的核磁共振氢谱图与甘露聚糖肽标准品的核磁共振氢谱图的峰型和谱峰位移值比对，选定谱图中用作特异性鉴定的光谱区，并计算选定光谱区的相似度；甘露聚糖肽样品与甘露聚糖肽标准品的相似度ρ>0.95；所述用作特异性鉴定的光谱区，是δ4.89ppm～δ5.90ppm的异头氢区；获得待测样品的核磁共振氢谱图及甘露聚糖肽标准品的核磁共振氢谱图的步骤包括：
(1)样品的制备：
准确称取甘露聚糖肽标准品及待测样品各30mg，溶于0.5mL的D2O溶液中，超声至完全溶解，加入10μL 0.2％的TSP重水溶液，超声混合均匀，转移至5mm的核磁管中；
(2)NMR测定：
1H NMR的共振频率为400MHz，采样参数如下：脉冲序列为zgcppr，采样点数为64k，扫描次数为64，空扫次数为4，谱宽为8012.8Hz，脉冲角度为45，采样时间为3.7s，接收增益为10，测试温度为303K，弛豫延迟时间为1.0s，窗函数线宽因子为1Hz。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，δ5.29、δ5.14、δ5.04、δ4.90分别对应1,2-、1,3-、1-和1,6-连接甘露糖残基的异头氢信号；δ5.12和δ5.08对应1,2,6-连接甘露糖残基的异头氢信号。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相似度ρ采用相关系数法进行计算。
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