CN105907700A

CN105907700A - 一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法

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Publication number: CN105907700A
Application number: CN201610277787.5A
Authority: CN
Inventors: 王晓冰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2016-08-31

Abstract

本发明公开了一种原代小鼠或大鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，开创性的引入了灌流的方法，灌流充分，无死角。制备的复合酶消化液，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。此外，本发明中细胞接种贴壁12h内，用pH值为6‑6.5的细胞培养基，可以极大的提高细胞的贴壁率，贴壁效果更好。本发明的原代小鼠或大鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法获得细胞总量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培养，本发明中大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞培养方法为基础的相关研究提供了良好的细胞培养方案。

Description

一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

胃黏膜上皮细胞具有很高的更新速度，各种上皮细胞具有不同的代谢周期，处于一种动态的、精致的平衡之中。胃黏膜由许多胃单位构成，每个胃单位由顶细胞、壁细胞、主细胞、颈黏液细胞、多能干细胞和少量的内分泌细胞等多种上皮细胞构成。其中顶细胞、壁细胞、主细胞是胃黏膜最主要的三种细胞。各种上皮细胞均来源于峡部的多能干细胞，每种细胞具有不同的功能和更新速率。细胞分化、增殖和凋亡的改变直接影响到胃黏膜结构的稳定，是导致胃相关疾病发生的原因。

目前在我国，几乎所有相关研究均采用各种细胞系，而非原代细胞。一个很重要的原因是，胃黏膜上皮细胞由多种细胞组成，对分离的条件要求较高，原代培养不易成功。从上世纪80～90年代开始，由于基础研究和临床的需要以及细胞培养技术的发展，国内外学者开始原代培养胃黏膜上皮细胞。但是既往的研究多采用非酶机械分离法或者单一的胶原酶分离法。其缺点在于机械分离法和单一的胶原酶分离法，对组织细胞的损伤极大，从而大大降低了细胞的得率以及活性，导致分离纯化的胃黏膜上皮细胞不像肝细胞等易于存活和生长，使进一步的持续深入的研究受到限制。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低污染的原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法。

为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：

一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

步骤1：小鼠或大鼠胃组织的提取

打开处死的小鼠或大鼠的腹腔，将胃组织分别在贲门部和幽门部断开，然后将取下的胃组织浸泡在PBS溶液里，放在冰上保存备用；

步骤2：清洗和预灌流

将离体的小鼠或大鼠胃组织使用D-Hanks溶液清洗后，从贲门到幽门使用针头被砂纸磨平的头皮针向胃组织内灌注预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；

步骤3：冲洗灌流

将步骤2处理后的小鼠或大鼠胃组织使用冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，2％双抗和1％两性霉素；

步骤4：胃粘膜层的剥离

将取下的胃组织剖开，仔细去除胃内容物，在解剖显微镜下，用无菌镊子仔细缓慢地撕下胃黏膜上皮；

步骤5：复合酶消化

将步骤4撕下胃黏膜上皮剪碎后，放置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；

步骤6：分离培养胃粘膜上皮细胞

步骤5中消化完毕的胃粘膜上皮细胞，用D-Hanks溶液进行吹打洗脱，过70um筛网后，再离心洗涤，然后重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到胃粘膜上皮细胞，将其放置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，上述步骤6中分离得到的胃粘膜上皮细胞，接种12h内使用pH值为6-6.5的细胞培养基，接种12h之后再换用pH值为7.0的细胞培养基。

优选地，上述细胞培养基用盐酸调pH，直至其pH值为6-6.5。

优选地，上述细胞培养基为含有1％上皮因子、1％青链霉素和2％胎牛血清的上皮专用培养基。

优选地，上述的细胞培养基还含有5ng/ml的EGF。

优选地，上述步骤2中预灌流的速度为2-8mL/min，预灌流时间为5-8分钟。

优选地，上述步骤3中冲洗灌流的速度为5-10mL/min，冲洗灌流时间为3-5分钟。

优选地，上述步骤5中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。

优选地，上述步骤5中复合酶消化过程为在4℃条件下消化4-20h，或者在37℃条件下消化10min-2h。

另一方面，本发明还提供根据上述的原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法所培养的原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

(1)本发明在分离细胞的操作中开创性的引入了灌流的方法。预灌流的预灌流液中添加了0.6mM/L的EGTA、双抗和两性霉素。EGTA一方面可以起到抗凝的作用(防止血凝块附着)，使灌流更充分，无灌流死角；另一方面，EGTA可以去除细胞间的Ca²⁺依赖性粘附因子，使细胞间连接变松散，提高所得胃粘膜上皮细胞的分离度。

(2)添加2％的双抗和两性霉素，可以有效地抑制组织或操作中存在的潜在的细菌和真菌污染。

(3)由于复合酶的包括多种胶原酶，而胶原酶的在具有Ca²⁺活化时可以达到最佳的消化效果，故本发明相应地引入了冲洗灌流的步骤，冲洗灌流液中含有CaCl₂，Ca²⁺可以有效螯合预灌流液残存于的EGTA，同时提供足够的钙离子增加复合酶消化液中胶原酶的活性。

(4)本发明使用复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，相比传统单一的胶原酶，避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题。

(5)本发明中细胞接种贴壁12h内，用pH值为6-6.5的细胞培养基，胃粘膜上皮细胞的耐受性更好，可以极大的提高细胞的贴壁率，贴壁效果更好。

(6)本发明的制备方法简便，技术稳定，重复性好。

附图说明

图1为普通显微镜视图下拍摄的本发明方法分离得到的小鼠胃粘膜上皮细胞(10×)；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

本实施例采用小鼠，使用本发明的分离培养方法分离胃粘膜上皮细胞，具体步骤如下：

1.小鼠胃组织的提取

首先处死新生或成年小鼠(冰冻10分钟或者颈椎脱臼)，酒精浸泡5分钟。打开腹腔，充分暴露腹腔，可见白色的胃组织。将其分别在贲门部和幽门部断开，幽门部断开时要远离幽门部，尽量取材胃底部组织。将取下的胃组织浸泡在含2％青链霉素的预冷PBS里，放在冰上保存，待所有组织取材完毕，统一进行处理。

2.清洗和预灌流

将离体的小鼠或大鼠胃组织使用含有2％双抗的37℃预热的D-Hanks溶液清洗后，从贲门到幽门使用针头被砂纸磨平的头皮针向胃组织内灌注37℃预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/LKCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；

3.冲洗灌流

将步骤2处理后的小鼠胃组织使用37℃预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，2％双抗和1％两性霉素；

4.胃黏膜层的剥离

在解剖显微镜下，用眼科剪或显微镊将取下的胃组织剖开，仔细去除胃内容物，并在含2％青链霉素的冰PBS里反复洗涤，去除胃内的杂质，至洗涤液澄清。将洗净的胃组织浸泡在1mg/ml的II型Dispase酶中，4度冰箱过夜。第2天，从冰箱取出组织，在解剖显微镜下，用无菌镊子仔细缓慢地撕下胃黏膜上皮。由于Dispase酶的作用，胃黏膜上皮与黏膜下层可以轻易地分离，故尽量将每一个胃组织的黏膜上皮层完整地撕下。撕下的胃黏膜上皮组织呈白色，没有黏膜下***的残留。

5.酶消化

将完整的胃黏膜上皮层剪碎，加入自制的复合酶(I型胶原酶+II型胶原酶+IV型胶原酶+Dispase酶＝1:1:1:1)，4种酶的初始浓度均为1mg/ml。放入37度水浴消化30分钟，轻微吹打不超过10次，根据情况可再次37度水浴消化30分钟，最后轻微吹打不超过10次，过70um筛网。

6.离心纯化

取过筛后的细胞滤液，根据体积加入对等的PBS，400g离心5分钟，即可获得纯化的小鼠胃黏膜上皮细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数。

7.培养基配制

为了提高胃黏膜上皮细胞的存活率，我们使用美国Sciencell公司的上皮专用培养基(货号：4101)。为了纯化胃黏膜上皮细胞，培养基里除了加入Sciencell公司配套的1％上皮因子、1％青链霉素和2％胎牛血清外，我们还额外加入：5ng/ml的EGF。另外，为了促进胃黏膜上皮细胞的贴壁效率，在原代培养、传代和复苏的第一天，我们将胎牛血清的浓度提高到10％，第2天更换为正常的2％。

8.二维培养

将纯化的小鼠胃黏膜上皮细胞用上述培养基重悬，制得胃黏膜上皮细胞重悬液，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5×10⁶/瓶。接种12h内使用pH值为6-6.5的细胞培养基，12h之后使用pH值为7.0的细胞培养基，置于37度，5％CO₂的培养箱中进行培养。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度达70％～80％，进行传代培养。

9.传代培养

当细胞融合度达70％～80％时，每瓶细胞加0.25％胰酶-EDTA 1ml，在37度培养箱中孵育消化5～10分钟。显微镜下观察，当细胞变圆、间隙增大时，用含血清的培养基终止消化，并将细胞吹打下来。400g离心5分钟，获得的细胞再加入含10％胎牛血清的上皮专用培养基，接种于T25培养瓶中，接种密度为0.5×10⁶/瓶。第2天，更换培养基为含2％胎牛血清的上皮专用培养基，置于37度，5％CO₂的培养箱中继续扩增培养。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况。

对比实施例

对比实施例采用传统的方法，分离获得胃组织后，剥离胃粘膜层，使用含有双抗的PBS冲洗，在无菌操作下剪碎，并使用II胶原酶37℃消化2h，使用缓冲液吹打组织，分散细胞，过筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到小鼠胃粘膜上皮细胞，细胞计数后，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5×10⁶/瓶，置于37度，5％CO₂的培养箱中进行培养并观察和测定相关指标。

上述的实施例和对比例实验，申请人进行了多次实验，并进行了相关指标的比较和数据统计。如表1所示：

表1

同时申请人使用大鼠进行了若干次实验，实验结果同小鼠相同，证明本发明的方法对大鼠和小鼠的骨骼肌分离培养的良好效果真实有效。

综上所述，本发明在分离细胞的操作中开创性的引入了灌流的方法。预灌流的预灌流液中添加了0.6mM/L的EGTA、双抗和两性霉素。EGTA一方面可以起到抗凝的作用(防止血凝块附着)，使灌流更充分，无灌流死角。另一方面，EGTA可以去除细胞间的Ca²⁺依赖性粘附因子，使细胞间连接变松散，提高所得胃粘膜上皮细胞的分离度。另外，由于复合酶的包括多种胶原酶，而胶原酶的在具有Ca²⁺活化时可以达到最佳的消化效果，故本发明相应地引入了冲洗灌流的步骤，冲洗灌流液中含有CaCl₂，Ca²⁺可以有效螯合预灌流液残存于的EGTA，同时提供足够的钙离子增加复合酶消化液中胶原酶的活性。此外，本发明中细胞接种贴壁12h内，用pH值为6-6.5的细胞培养基，胃粘膜上皮细胞的耐受性更好，可以极大的提高细胞的贴壁率，贴壁效果更好。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

步骤1：小鼠或大鼠胃组织的提取

步骤2：清洗和预灌流

将步骤1中的胃组织使用D-Hanks溶液清洗后，从贲门到幽门使用针头被砂纸磨平的头皮针向胃组织内灌注预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；

步骤3：冲洗灌流

将步骤2处理后的小鼠或大鼠胃组织用冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，2％双抗和1％两性霉素；

步骤4：胃粘膜层的剥离

将步骤3中处理得到的胃组织剖开，仔细去除胃内容物，在解剖显微镜下，用无菌镊子撕下胃黏膜上皮；

步骤5：复合酶消化

将步骤4中撕下的胃黏膜上皮剪碎后，放置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；

步骤6：分离培养胃粘膜上皮细胞

2.根据权利要求1所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤6中分离得到的胃粘膜上皮细胞，接种12h内使用pH值为6-6.5的细胞培养基，接种12h之后再换用pH值为7.0的细胞培养基。

3.根据权利要求2所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的细胞培养基用盐酸调pH，直至其pH值为6-6.5。

4.根据权利要求2所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的细胞培养基为含有1％上皮因子、1％青链霉素和2％胎牛血清的上皮专用培养基。

5.根据权利要求4所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的细胞培养基还含有5ng/ml的EGF。

6.根据权利要求1所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤2中预灌流的速度为2-8mL/min，预灌流时间为5-8分钟。

7.根据权利要求1所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中冲洗灌流的速度为5-10mL/min，冲洗灌流时间为3-5分钟。

8.根据权利要求1所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤5中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。

9.根据权利要求1所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤5中复合酶消化过程为在4℃条件下消化4-20h。

10.根据权利要求1所述的一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤5中复合酶消化过程为在37℃条件下消化10min-2h。

11.一种根据权利要求1-10中任意一项所述的原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法所培养的原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞。