CN105906642A - 罗丹明酰肼衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

罗丹明酰肼衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了罗丹明酰肼衍生物及其制备方法和应用，罗丹明酰肼衍生物由罗丹明酰肼与对羟基苯乙酮在乙醇溶液中通过席夫碱缩合反应制得，该化合物在pH 2‑5范围内与荧光强度具有很好的线性关系，因此可以作为pH响应荧光探针，并用于筛选产酸能力强的菌株，如高产聚苹果酸菌株，利用该方法筛选高产菌株具有灵敏度、准确度高，快速和高通量等优点。

Description

罗丹明酰肼衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种罗丹明酰肼衍生物，还涉及罗丹明酰肼衍生物的制备方法和在pH响应荧光探针中的应用。
背景技术
聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)发酵生产的一种新型高分子聚合物，以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，聚苹果酸具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性、安全无毒等优点，在药物载体、组织工程、食品等领域具有广泛的用途。
当前，由于聚苹果酸菌株产酸能力低下，一直制约其工业化生产，因此采用筛选经过诱变或代谢工程改造的高产聚苹果酸菌株是当务之急。如乔长晟等报道(一种大量产生聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法，授权专利号200910071018.X)，在含碳酸钙的固体平板上通过透明圈大小筛选紫外复合诱变的聚苹果酸高产菌株，但该方法准确度低，透明圈不易观察，初筛会导致大量高产菌株丢失。因此，亟需一种灵敏和准确度高、快速、高通量筛选高产聚苹果酸的探针或方法，用于快速、准确筛选经物理、化学方法诱变或代谢工程改造的菌株。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于避免高产菌株筛选过程中随机盲目、工作量大等技术缺陷，合成一种在pH值2～5范围内敏感的荧光探针，具体技术方案如下：
罗丹明酰肼衍生物，化学名：(E)-3'，6'-双(二甲氨基)-2-((1-(4-羟基苯基)亚乙基)氨基)螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-3-酮，其结构如式Ⅰ所示：
本发明还提供了罗丹明酰肼衍生物的制备方法，具体如下：以罗丹明酰肼与对羟基苯乙酮为原料，以乙醇作为溶剂，通过席夫碱缩合反应得罗丹明酰肼衍生物。
优选的，将罗丹明酰肼与对羟基苯乙酮按摩尔比1：4溶于乙醇，加热回流6～24h至罗丹明酰肼反应完全，然后除去溶剂，加水溶解，然后用乙酸乙酯萃取，经重结晶得罗丹明酰肼衍生物。
利用合成的罗丹明酰肼衍生物的荧光强度与酸性pH值响应的良好线性关系，可以用于制备pH响应荧光探针，该探针用于响应的pH范围为2～5的测试液。菌株的产酸能力越强，pH值越低，因此适用于筛选产酸能力强的菌株，产酸可以为有机酸也可以为无机酸，由于有机酸的pH范围为2～4，所以更适合产有机酸菌株的筛选，其有机酸选自苹果酸、富马酸、丁二酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、葡萄糖酸中的一种或多种。
本发明还用于筛选高产聚苹果酸菌株，利用菌株的产酸能力越强，pH值越低，在深孔板中通过高通量筛选pH低的菌株，筛选获得突变株AH-21，通过发酵验证发现pH低的菌株聚苹果产量得到提高，比原始出发菌株聚苹果酸发酵产量提高了13.8％，表明利用本发明公开的罗丹明酰肼衍生物筛选高产菌株具有灵敏高、准确度高、快速、高通量等优点。
本发明中使用的原始出发菌为产聚苹果酸菌种Aureobasidium pullulans CCTCC NO：M2012223，或者来源于美国农业部菌种保藏中心(NRRL)，美国典型培养物保藏中心(ATCC),中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)等机构保藏或自然分离产聚苹果酸的Aureobasidium属或Physarum菌种。
本发明中，ARTP是常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma)的简称，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。本发明使用ARTP技术诱变出芽短梗霉菌株，具体诱变参数为：处理功率50-200W，氦气气流量5-30SLM，处理距离0-10mm，诱变时间10-120s。稀释后，均匀涂布于YPD平板上，产生大量突变株。
本发明的有益效果在于：本发明合成了新的罗丹明酰肼衍生物，荧光强度在pH值2-5范围内具有良好线性关系，可以作为pH响应荧光探针，由于菌株的产酸能力越强，pH值越低，因此可以通过罗丹明酰肼衍生物荧光强度间接的反映出菌株的产酸能力。结合高通量筛选装置，可快速筛选得到高产的正突变株。利用本发明提供的筛选方法，相比传统的溴甲酚绿变色圈显色法等筛选方法，筛选准确度大幅度提高，并减少工作量，提高了筛选效率，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为荧光探针L的合成路线图。
图2为探针L荧光强度与pH值响应关系。
图3为部分突变株的荧光强度和pH值变化结果(λex＝563nm)。
图4为5L发酵罐突变株AH-21发酵验证结果(○表示出发菌株CCTCC M2012223聚苹果酸含量；●表示突变株AH-21聚苹果酸产量；△表示出发菌株CCTCC M2012223菌体生物量；▲表示突变株AH-21菌体生物量；□表示出发菌株CCTCC M2012223葡萄糖浓度；■表示变株AH-21葡萄糖浓度)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、罗丹明酰肼衍生物荧光探针的合成
罗丹明酰肼衍生物荧光探针的合成，包括如下步骤：
(1)罗丹明酰肼的合成：取1.5g罗丹明B溶于100mL乙醇中，常温(18～25℃)搅拌滴加5mL质量分数为80％的水合肼；加热回流12～48h，然后将反应液浓缩至反应液总体积的八分之一，静置过夜；次日抽滤白色沉淀、烘干，收集得到罗丹明酰肼；
(2)取步骤(1)所得的罗丹明酰肼0.168g(0.37mmol)和对羟基苯乙酮0.201g(1.48mmol)溶于10～100mL乙醇中，加热回流6～24h至罗丹明酰肼反应完全(TLC检测罗丹明酰肼反应是否完全)，然后在真空状态下加热除去溶剂，加入5～50mL水后，用20～100mL乙酸乙酯进行萃取，萃取三次后从乙酸乙酯中重结晶得到罗丹明酰肼衍生物荧光探针，化学名为：(E)-3'，6'-双(二甲氨基)-2-((1-(4-羟基苯基)亚乙基)氨基)螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-3-酮，简称为探针L，总反应路线如图1。
本实施例重结晶得到探针L 0.142g，产率为84.5％。
以DMSO为溶剂，配制浓度为50μM的探针L溶液，然后在pH值为1.82、2.25、2.98、3.52、4.07、4.65、5.47和6.23的缓冲液中，以激发波长和发射波长分别为563nm和580nm检测荧光探针L在不同pH条件下荧光强度(v/v＝1:1)，结果如图2所示。结果显示，合成的探针L在pH在2～5范围内，具有很好的线性范围(R2＝0.9951)，可以作为pH值在2～5范围内的pH响应荧光探针。由于产酸类菌株的产酸能力越强，pH值越低，由此可以通过荧光强度间接的反应出菌株的产酸能力，结合高通量筛选装置(深孔板)，可快速筛选得到高产菌株。由于有机酸属于弱酸，pH值通常在2～4范围内，因此合成的探针L特别适用于高产有机酸菌株筛选，如苹果酸、富马酸、丁二酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、葡萄糖酸等的菌株。
实施例2、利用探针L筛选高产聚苹果酸菌株
首先，构建聚苹果酸菌株突变库：以出芽短梗霉(A.pullulans)CCTCC M2012223为出发菌株，摇瓶培养48h后，玻璃珠打碎制备单细胞悬液，采用常压室温等离子体(Atmosphericand Room Temperature Plasma，ARTP)技术诱变菌株，具体诱变参数为：处理功率120W，氦气气流量10SLM，处理距离2mm，诱变时间50s；稀释后，均匀涂布于YPD平板上，产生大量突变株。
然后，利用探针L筛选高产聚苹果酸菌株，将ARPT所有的突变株接种于含2mL种子培养基的48孔深孔板中25℃培养48h后，然后取200μL种子液移种至含2mL发酵培养基的48孔深孔板中培养48h。深孔板离心，取100μL上清液到96孔板，然后加入溶剂为DMSA、浓度为50μM的100μL探针L溶液混匀，利用多功能酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)，在激发波长和发射波长分别为563nm和580nm检测其荧光强度，部分菌株的荧光强度如图3所示。结果显示，AH-21荧光强度最高，pH值最低，预测该菌株的聚苹果酸产量最高。
本实施例中，所述种子培养基为葡萄糖60g/L、KH2PO4 0.05g/L、NH4NO3 2g/L、ZnSO4 0.05g/L、MgSO4 0.05g/L、玉米浆1g/L和CaCO3 20g/L。
实施例3、发酵验证
采用5L发酵罐工艺，发酵配方为葡萄糖90g/L、氯化铵2g/L、KH2PO4 0.2g/L、ZnSO4 0.15g/L、MgSO4 0.2g/L，在发酵罐通气比(1:1，v/v)以上，搅拌转速400～700rpm，将突变株AH-21与原始出发菌株CCTCC M2012223进行发酵培养时间为76小时，然后检测聚苹果酸产量，结果如图4所示。结果显示，突变株AH-21产聚苹果酸42g/L，比出发菌株CCTCCM2012223提高了13.8％。结果表明，通过荧光探针筛选到的高产菌株经发酵后聚苹果酸产量也得到提高，因此可以通过利用探针L作为pH响应荧光探针能够筛选得到高产聚苹果酸的菌株。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.罗丹明酰肼衍生物，其特征在于：其结构如式Ⅰ所示：
2.权利要求1所述罗丹明酰肼衍生物的制备方法，其特征在于：以罗丹明酰肼与对羟基苯乙酮为原料，以乙醇作为溶剂，通过席夫碱缩合反应得罗丹明酰肼衍生物。
3.根据权利要求2所述罗丹明酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，将罗丹明酰肼与对羟基苯乙酮按摩尔比1：4溶于乙醇，加热回流6～24h至罗丹明酰肼反应完全，然后除去溶剂，加水溶解，然后用乙酸乙酯萃取，经重结晶得罗丹明酰肼衍生物。
4.权利要求1所述罗丹明酰肼衍生物在制备pH响应荧光探针中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述pH响应荧光探针响应的pH范围为2～5。
6.权利要求1所述罗丹明酰肼衍生物作为pH响应荧光探针筛选产酸能力强的菌株。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述酸为有机酸。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述有机酸为苹果酸、富马酸、丁二酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、葡萄糖酸。
9.权利要求1所述罗丹明酰肼衍生物作为pH响应荧光探针筛选高产聚苹果酸菌株中的应用。
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