CN106572664A

CN106572664A - 用于生面团干燥的gh5木聚糖酶

Info

Publication number: CN106572664A
Application number: CN201580044199.0A
Authority: CN
Inventors: K·B·R·M·克罗; M·M·恩格尔森; F·贝克尔
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-18
Publication date: 2017-04-19
Also published as: EP3182830A1; AU2015306226B2; US20170303548A1; MX2017002018A; DK3182830T3; AU2015306226A1; WO2016026850A1; EP3182830B1; CA2957811A1

Abstract

本发明提供用于制备基于生面团的产品的方法，该方法包括将GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶(该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11)添加至生面团中。

Description

用于生面团干燥的GH5木聚糖酶

参照序列表

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶(该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11)在基于生面团的产品中的用途。

相关技术描述

木聚糖是在所有陆生植物中发现的半纤维素(波普尔(Popper)和陶西(Tuohy)，植物生理学(Plant Physiol.)，2010，153:373-383)。

基于序列相似性，将负责木聚糖主链水解的已知的酶分类为酶家族(www.cazy.org)。主要具有内切-木聚糖酶活性的这些酶已描述于糖苷水解酶家族(GH)5、8、10、11和30中。

家族内的酶共享一些特征，例如3D折叠，并且它们通常共同具有相同的反应机制。一些GH家族具有狭窄或单一底物特异性，然而其他家族具有宽泛的底物特异性。

通过对相关序列的亚家族进行定义已经澄清了GH5内序列之间的关系(阿斯博白(Aspeborg)等人BMC进化生物学(BMC Evolutionary Biology)，2012，12:186)。GH5、GH5_21和GH5_34的亚家族中的两个已经被描述为作用于***木聚糖的木聚糖酶。

发明概述

本发明的诸位发明人已经发现通过向生面团中添加GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶(该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11)，该生面团较少粘性，因此我们要求：一种用于制备基于生面团的产品的方法，该方法包括向生面团中添加GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11。

在一个实施例中，该木聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少70％一致性。

在一个实施例中，该基于生面团的产品是面包。

在一个实施例中，该生面团包括小麦和/或玉米。

在一个实施例中，将选自下组的另外的一种或多种酶添加到该生面团中，该组由以下各项组成：淀粉酶、抗老化淀粉酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、纤维素酶、半纤维素酶、酰基转移酶、蛋白质二硫键异构酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶、碳水化合物氧化酶、硫氢基(sulfurhydryl)氧化酶、以及葡糖淀粉酶。

在一个实施例中，要求保护通过用根据本发明所述的方法可获得的烘焙产品。

在一个实施例中，要求保护通过向生面团成分中添加GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶(该组由以下各项组成：GH8，GH10和GH11)制备的生面团。

在一个实施例中，要求保护烘焙组合物，该烘焙组合物包括木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶，该组由以下各项组成：GH8，GH10和GH11。

在一个实施例中，该烘焙组合物是生面团、面粉组合物、或面粉预混物。

在一个实施例中，根据本发明所述的烘焙组合物是处于颗粒或团聚粉末或液体的形式。

在一个实施例中，要求保护根据本发明所述的烘焙组合物用于制备生面团的用途。

在一个实施例中，与其中未加入GH5木聚糖酶的生面团相比，根据本发明所述的生面团更少粘性。

在一个实施例中，该GH5木聚糖酶是GH5_21或GH5_34木聚糖酶。

定义

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-***糖基木聚糖作为底物来确定。将一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-***糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有木聚糖酶活性。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQID NO:1。由相同多核苷酸表达的C-末端和/或N-末端氨基酸。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列以这样一种方式相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置，以使得控制序列指导编码序列的表达。

亲本：术语“亲本”意指对其做出改变以产生本发明的木聚糖酶变体的木聚糖酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。

出于本发明的目的，使用尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)的尼德尔(Needle)程序，优选地5.0.0版或更新版本中所执行的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

变体：术语“变体”是指具有木聚糖酶活性的、包含改变(即在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、***和/或缺失)的多肽。取代意指占据位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指去除占据位置的氨基酸；以及***意指在占据位置的氨基酸的毗邻处和紧邻处添加一个或多个氨基酸。

改进的特性：相对于其中不掺入木聚糖酶的生面团或烘焙产品，当将根据本发明所述的木聚糖酶以有效量掺入到生面团中时，可以改进生面团或由其获得的烘焙产品的一个或多个特性。术语“改进的特性”在此定义为生面团和/或从生面团获得的产品(特别是烘焙产品)的任何特性，相对于其中不掺入根据本发明所述的木聚糖酶或组合物，其通过根据本发明所述的木聚糖酶的作用或通过根据本发明所述的生面团或产品而改进。改进的特性可以包括但不限于生面团的增加的强度、生面团的增加的弹性、增加的稳定性、生面团的降低的粘性、生面团的改进的伸展性、生面团的改进的机械能力、烘焙产品的增加的体积、烘焙产品的改进的风味、烘焙产品的改进的瓤结构、烘焙产品的改进的瓤柔软性，和/或烘焙产品的改进的抗老化。

改进的特性可以根据以下描述的本发明的方法，通过比较生面团和/或烘焙产品(添加和不添加本发明的木聚糖酶或烘焙组合物制备)来确定。可以使用在烘焙工业中良好建立的程序来评估感官品质，并且可以包括例如使用一组训练有素的味道测试者。

增加的强度：术语“生面团的增加的强度”在此定义为通常具有更多弹性特性和/或需要更多工作输入到模具和形状的生面团的特性。

增加的弹性：术语“生面团的增加的弹性”在此定义为为生面团的特性，其在经受某一物理应变之后具有更高的恢复其原始形状的趋势。

生面团的增加的稳定性：术语“生面团的增加的稳定性”在此定义为面团的特性，其更不易受机械性滥用的影响，因此更好地维持其形状和体积，并且由正常和/或延长醒发之后跨越一条面包的截面的高度：宽度的比率来评估。

生面团的降低的粘性：术语“生面团的降低的粘性”在此定义为生面团的特性，其具有更小的粘附于表面(例如在面团生产机器中)的倾向，并且由熟练的测试面包师根据经验评估抑或通过使用如本领域已知的质地分析仪(例如TAXT2)测量。

改进的伸展性：术语“生面团的改进的伸展性”在此定义为生面团的特性，其可以经受增加的应变或拉伸而不破裂。

改进的机械能力：术语“生面团的改进的机械能力”在此定义为生面团的特性，其通常更少粘性和/或更坚固和/或更有弹性。

烘焙产品的增加的体积：术语“烘焙产品的增加的体积”被测量为给定的一条面包的体积。该体积可以通过油菜籽位移方法确定，或者可以如在实施例中描述的确定。

烘焙产品的改进的瓤结构：术语“烘焙产品的改进的瓤结构”在此定义为在瓤中具有更细小的泡孔和/或更薄的泡孔壁和/或瓤中的泡孔的更均一/均匀分布的烘焙产品的特性，并且通常通过面包师或通过如本领域已知的数字图像分析(例如，C-cell，口径控制国际有限公司(Calibre Control International Ltd)，阿普尔顿(Appleton)，沃灵顿(Warrington)，英国)进行视觉评估。

烘焙产品的改进的柔软性：术语“烘烤产品的改进的柔软性”与“坚固性”相反，并且在此定义为更容易压缩的烘焙产品的特性，并且由熟练的测试面包师根据经验来评估，抑或通过使用如本领域已知的质地分析仪(例如TAXT2或TA-XT加，来自稳定的微***公司(Stable Micro Systems Ltd)，萨里(surrey)，英国)进行测量。

发明详述

具有木聚糖酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的GH5木聚糖酶，特别是GH5_21或GH5_34木聚糖酶。

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:1的多肽具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的分离的多肽，这一分离的多肽具有木聚糖酶活性。

在一个方面中，该多肽与SEQ ID NO:1的多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。

本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；或是其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:1的多肽或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有木聚糖酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件下与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列，或其全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约)。

可以使用SEQ ID NO:2的多核苷酸或其子序列或其片段来设计核酸探针，以便根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸长度、至少300个核苷酸长度、至少400个核苷酸长度、至少500个核苷酸长度、至少600个核苷酸长度、至少700个核苷酸长度、至少800个核苷酸长度、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有木聚糖酶活性的多肽的DNA对由这类其他株系制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其他分离技术分离来自这些其他菌株的基因组或其他DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:2杂交的克隆或DNA或其子序列，在DNA印迹中使用载体材料。

出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在低至高严格度条件下与对应于SEQ IDNO:2的标记的核酸探针杂交。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或***的SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:1的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或***的数目不超过20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。

保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸变化是这样一种性质，使得多肽的理化特性被改变。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的木聚糖酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。也可以从与相关多肽的比对推断必需氨基酸的身份。

可以做出单个或多个氨基酸置换、缺失和/或***并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如Reidhaar-Olson和索尔(Sauer)，1988，科学，241:53-57；鲍威(Bowie)和索尔，1989，美国科学院院刊，86:2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中以翻译后方式产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以进一步包含在两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

具有木聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的具有木聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当指，由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经***了来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是***多肽，如具有[木聚糖酶]活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)糖丝菌属(Saccharothrix)、指孢囊菌属(Doctylosporangium)或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个方面中，该多肽是来自放线菌纲的细菌的木聚糖酶，例如来自放线菌目，或来自微单孢菌亚目，或来自微单孢菌科，或来自指孢囊菌属。在另一个方面中，该多肽是一种变孢指孢囊菌多肽。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。使用的菌株在登录号ATCC 31203或DSM 43911下是公开可获得的。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由指孢囊菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。

编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及包含与一个或多个控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中所述控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其***载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”。在WO 99/43835中公开了串联启动子的实例。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子和杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得用于酵母宿主细胞的适合的前导子。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。

控制序列也可以是编码信号肽的信号肽编码区，其中所述信号肽与多肽的N-末端连接并且指导多肽进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以内在地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含相对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993,微生物评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。

从酿酒酵母醹-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。

控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节***的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核***中的调节***包括lac、tac、以及trp操纵子***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核***中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处***或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合标记包括，但不限于，ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝***宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用以连接以上描述的这些元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员众所周知的。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝***孢子真菌(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人定义，引自：安斯沃斯(Ainsworth)和比斯比(Bisby)的真菌大词典(Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社(University Press)，剑桥(Cambridge)，英国)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫尔(Passmore)和达文波特(Davenport)编著，应用细菌学学会专题论文集系列9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)所描述那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及以本身已知的方式进行细胞壁再生的过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述在EP238023；约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474；和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及Hinnen等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

生产方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

包括GH5木聚糖酶的组合物

在一个实施例中，本发明涉及烘焙组合物，该烘焙组合物包括GH5木聚糖酶和另外的选自下组的木聚糖酶，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11，特别是GH5_21木聚糖酶或Gh5_34木聚糖酶。

该另外的木聚糖酶可以是微生物来源的，例如源自细菌或真菌，例如曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉或塔宾曲霉的菌株)，或来自木霉属的菌株(例如里氏木霉)，或来自腐质霉属的菌株(例如特异腐质霉)。

用于本发明的适合的可商购木聚糖酶制剂包括PANZEA BG^TM、PENTOPAN MONO BG^TM和PENTOPAN 500BG^TM(可得自诺维信公司)，GRINDAMYL POWERBAKE^TM(可得自丹尼斯克公司)，以及BAKEZYME BXP 5000^TM和BAKEZYME BXP 5001^TM(可得自DSM公司)。

Panzea是GH8木聚糖酶，以及戊聚糖酶(Pentopan)是GH11木聚糖酶。

该组合物可以根据本领域已知的方法制备，并且可以具有任何物理外观(例如液体、糊剂或固体)。例如，可以使用本领域已知的配制酶和/或药物产品的方法配制组合物，例如配制成包衣或未包衣的颗粒或微粒。可以根据本领域已知的方法稳定包括在组合物中的木聚糖酶和任何另外的酶，例如通过添加抗氧化剂或还原剂以限制氧化来稳定组合物中的多肽，或者其多肽可以通过添加已知有益于多肽在固体或液体组合物中的稳定性的聚合物(例如PVP、PVA、PEG或其他适合的聚合物)来稳定。当配制的木聚糖酶作为颗粒或团聚粉末时，颗粒特别地具有窄的粒度分布，其中在25至500μm范围内的颗粒多于95％(按重量计)。颗粒和团聚粉末可以通过常规方法制备，例如通过在流化床制粒机中，将木聚糖酶和乳化剂喷雾到载体上。该载体可以由具有适合的粒度的微粒核组成。该载体可以是可溶的或不溶的，例如盐(诸如NaCl或硫酸钠)、糖(诸如蔗糖或乳糖)、糖醇(诸如山梨糖醇)、淀粉、大米、玉米糁、或大豆。组合物优选地以干粉或颗粒(特别是无粉尘颗粒)或液体的形式。

因此，本发明还提供了组合物，该组合物包括包含GH5木聚糖酶的的颗粒和包含选自下组的木聚糖酶的颗粒，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11，特别是GH5_21木聚糖酶或GH5_34木聚糖酶；或包括包含GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶的液体，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11，特别是GH5_21木聚糖酶或GH5_34木聚糖酶。

在一个具体实施例中，该组合物是生面团组合物、或生面团改进添加剂、或包括GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶的预混物，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11。

术语“预混物”在此定义以其常规含义理解，即作为烘焙剂的混合物，通常包括粉，它不仅可以用于工业面包烘焙厂，而且可以用于零售面包店。

该预混物可以通过将本发明的烘焙组合物与适合的载体(如面粉、淀粉、糖、复合碳水化合物(例如麦芽糖糊精)、或盐)混合来制备。该预混物可以包含其他生面团和/或面包添加剂，例如在此提到的添加剂(包括酶)。

组合物中GH5木聚糖酶的量可以是0.5-5000mg多肽/kg干物质、1.0-1000mg多肽/kg干物质、5.0-100mg多肽/kg干物质、5.0-50mg多肽/kg干物质、5.0-25mg多肽/kg干物质，5.0-15mg多肽/kg干物质、或更优选5.0-10mg/kg干物质之间。

任选地，另外的酶(例如淀粉酶、抗老化淀粉酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、纤维素酶、半纤维素酶、酰基转移酶、蛋白质二硫键异构酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶、碳水化合物氧化酶、硫氢基(sulfurhydryl)氧化酶、以及葡糖淀粉酶)可以与生面团或组合物中的一种或多种木聚糖酶一起使用。

另外的酶可以具有任何来源，包括哺乳动物和植物，并且优选地具有微生物(细菌、酵母或真菌)来源。

用于本发明的葡糖淀粉酶包括黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，(1984)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3(5)，1097-1102页)，或披露在WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，或米曲霉葡糖淀粉酶(农业生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)(1991)，55(4)，941-949页)。

淀粉酶可以是真菌或细菌的，例如来自嗜热脂肪芽孢杆菌的产麦芽糖α-淀粉酶或来自芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌)的α-淀粉酶，例如来自植物(例如大豆)或来自微生物来源(例如芽孢杆菌)的β-淀粉酶，或例如来自米曲霉的真菌α-淀粉酶。

适合的商业产麦芽糖α-淀粉酶包括NOVAMYL^TM和NOVAMYL 3D^TM(可得自诺维信公司)。

适合的商业真菌α-淀粉酶组合物包括例如BAKEZYME P 300^TM(可得自DSM公司)和FUNGAMYL 2500SG^TM、FUNGAMYL 4000BG^TM、FUNGAMYL 800L^TM、FUNGAMYL ULTRA BG^TM和FUNGAMYL ULTRA SG^TM(可得自诺维信公司)。

葡糖氧化酶可以是真菌葡糖氧化酶，特别是黑曲霉葡糖氧化酶(例如GLUZYME^TM，可得自诺维信公司，丹麦)。

蛋白酶可以来自芽孢杆菌，例如解淀粉芽孢杆菌。

磷脂酶可以具有磷脂酶A1、A2、B、C、D或溶血磷脂酶活性；它可以具有或可以不具有脂肪酶活性。它可以具有动物来源，例如来自胰腺、蛇毒或蜂毒，或它可以具有微生物来源，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如曲霉属或镰孢菌属，例如黑曲霉、米曲霉或尖孢镰孢菌。来自尖孢镰孢菌的优选的脂肪酶/磷脂酶披露于WO 98/26057中。而且，可以使用描述于WO 00/32758中的变体。

适合的磷脂酶组合物是LIPOPAN F^TM和LIPOPAN XTRA^TM(可得自诺维信公司)或PANAMORE GOLDEN^TM和PANAMORE SPRING^TM(可得自DSM公司)。

生面团

在一方面，本发明披露了用于制备生面团或由生面团制备烘焙产品的方法，该方法包括将根据本发明所述的一种或多种木聚糖酶掺入到生面团中。

在另一方面，本发明提供生面团，该生面团包含面粉、水和有效量的根据本发明所述的烘焙组合物或预混物。

本发明还涉及用于制备生面团或烘焙产品的方法，该方法包括将有效量的本发明的烘焙组合物掺入到生面团中，相对于其中不掺入一种或多种木聚糖酶的生面团或烘焙产品，该方法改进生面团或由面团获得的烘焙产品的一个或多个特性。

短语“掺入生面团中”在此定义为将根据本发明所述的烘焙组合物添加到生面团中、添加到要制作生面团的任何成分中和/或添加到将要制作生面团的生面团成分的任何混合物中。换言之，本发明的烘焙组合物可以在生面团制备的任何步骤中添加，并且可以在一个、两个或更多个步骤中添加。将组合物添加到生面团的成分中，使用本领域熟知的方法将生面团捏合并烘焙以制备烘焙产品。

术语“有效量”在此定义为根据本发明的烘焙组合物的量，其足以对面团和/或烘焙产品的至少一种感兴趣的特性提供可测量的效果。

术语“生面团”在此定义为面粉和其他成分的混合物，其足够坚固以捏合或滚动。

本发明的生面团可以包含源自任何谷粒(包括小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、稻和黍，特别是小麦和/或玉米)的粉。

该生面团还可包含其他常规生面团成分，例如：蛋白质，如奶粉、面筋和大豆；鸡蛋(全蛋、蛋黄或蛋清)；氧化剂如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，如L-半胱氨酸；糖；盐，如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。

生面团还可以包含选自下组的乳化剂，该组由以下各项组成：单甘油酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、乙氧基化甘油单酯和甘油二酯(EMG)、聚山梨酯(PS)、琥珀酰单甘油酯(SMG)及其混合物。

本发明的生面团可以是新鲜的、冷冻的或半烘焙的(预烘焙的)。

本发明的生面团通常是经发酵的生面团或将要经受发酵的生面团。该生面团可以各种方式来发酵，诸如通过添加化学膨松剂(例如碳酸氢钠)或通过添加发酵剂(发酵生面团)，但优选的是通过添加适合的酵母培养物如酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)(面包酵母)的培养物(例如可商购的酿酒酵母菌株)来发酵该生面团。

根据本发明，生面团中的GH5木聚糖酶的量典型地可以是在生面团中在0.01-0.10mg多肽/kg面粉，特别是0.01-05mg多肽/kg面粉之间。

根据本发明，生面团中GH8、GH10和GH11木聚糖酶的量典型地可以是在生面团中0.01-100mg多肽/kg面粉之间；特别地，生面团中GH8、GH10和GH11木聚糖酶的量典型地可以是在生面团中0.1-100mg多肽/kg面粉之间；特别是生面团中GH8、GH10和GH11木聚糖酶的量典型地可以是在生面团中1-100mg多肽/kg面粉之间。

产品

本发明的工艺可被用于从生面团制备的任何种类的产品，无论是柔软的或脆的特性，无论是白色、浅色或深色类型。实例是面包(特别是白面包，全麦面包或黑麦面包)，典型地处于以下形式：面包条或面包卷，平锅面包(pan bread)、吐司面包(toast bread)、切开面包(open bread)、有和没有盖的平锅面包、果子面包(buns)、汉堡面包、面包卷、法棍面包、黑面包、全麦面包、丰沃面包(rich bread)、麸皮面包、扁平面包(flat bread)、玉米饼、圆面饼(pita)、***面包(Arabic bread)、印度扁面包(Indian flat bread)、蒸面包及其任何品种。

通过以下实例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实例

材料(SEQ ID:1)：

从居住在德国汉堡的动物园中的六岁雌性亚洲象(名字是“康堤(Kandy)”)获得大象粪便。如在生产商的方案中所述，用来自凯杰公司(Qiagen)(希尔登，德国)的QIAamp DNA粪便试剂盒进行DNA分离。

基因测序，随后的读取和基因发现的装配(即基因功能的注释)对于本领域技术人员是已知的并且该服务是可商购的。

基于核苷酸序列，合成并且商业购买一个密码子优化的合成基因。

这些表达质粒(BcSP-His-标签-木聚糖酶)被转化到枯草芽孢杆菌表达宿主中。在转化时将木聚糖酶BcSP-融合基因通过同源重组整合至枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。

在三联启动子***的控制下表达该基因构建体(如描述于WO 99/43835中)。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记物(如描述于狄代丽柯森(Diderichsen)等人，1993，质粒(Plasmid)30:312-315中)。在每ml补充有6毫克氯霉素的LB培养基琼脂上选择转化体。选择一个包含木聚糖酶表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆，并且在旋转摇床上在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中进行培养，每个锥形瓶包含100ml基于酵母提取物的培养基。在30℃至37℃下的3-5天培养时间后，通过离心收获包含酶的上清液并通过His-标签纯化对这些酶进行纯化。

实例1：

GH5木聚糖酶(SEQ ID No:1)，在烘焙中

所做的工作：

根据具有正常和延长醒发的直生面团方法使用以下配方和工艺烘焙面包：

配方：

+根据表1的酶：酶的剂量

表1：酶的剂量(在面粉基础上)

程序：

1.成分的称量。

2.将盐、蔗糖、酵母、抗坏血酸和酶添加至混合器钵中。

3.调节温度(以在混合后给出26℃的生面团温度)，称量并且将水添加至混合器钵中。

4.将面粉添加至混合器钵中。

5.使用针式混合器(Bear Varimixer RN20/VL2，Wodschow&Co.，丹麦)在50rpm混合1min并在150rpm混合6min。

6.从混合器钵中取出生面团，并且确定温度以确保每个面团具有相同的温度(生面团温度在不同面团之间可以变化1℃)。确定生面团参数(混合后的生面团评估)，并模制生面团。

7.在塑料盖下在室温(21℃)下给予生面团20min的等待时间，并且进行第二次生面团评估(等待时间后的生面团参数)。

8.将生面团称重(350g/面包)，并且然后模制。

9.将模制的生面团在塑料覆盖下给予15分钟的等待时间。

10.将用于面包的生面团在压片机(M0671MPB-001，Glimek，SE)中成形。将片状生面团转移到1200ml平底锅(最大160x 110x 85mm)中，该平底锅放在烤板上。

11.将该生面团在32℃，86％相对湿度下醒发55分钟。

12.将面包在柜式烤炉(Infra，Wachtel，DE)中在230℃下用蒸汽(风门在25min后打开，以便从烤箱中排出蒸汽)烘焙35min。

13.将面包在烘焙后从盘中取出并且放置在烤板上。

14.允许面包冷却至室温。

15.关于体积评估面包。

手工生面团评估

在混合后并且在20min等待时间后，使用如在以下表表1中所描述的参数、定义和评估方法来直接评估生面团特性。使用0-10之间的标度，其中对照生面团(没有任何酶添加的生面团1)给出评分5，并且相对于对照评估添加酶的其他生面团。离对于对照生面团所判断的越远，对该生面团给出的得分越高/越低。

表1生面团评估

体积确定

使用在Volscan轮廓仪软件上运行的Volscan轮廓仪600(稳定微***公司(Stablemicrosystems)，英国)测量比体积。

每个面包安装在机器中。

每个面包条的重量用Volscan仪器的内置天平自动确定。

当每个面包条以1.5rps(每秒的转数)的速度旋转时，同时用激光束以每转3mm垂直步幅扫描它，由仪器产生的3D图像计算每个面包条的体积。

仪器的输出是每个面包的重量(g)和体积(ml)。从重量和体积，根据等式1计算每个面包的比体积，并且根据等式2计算比体积指数。报告的值是来自同一生面团的2个面包的平均值。

等式1

比体积(ml/g)＝体积(按ml计)/重量(按g计)

等式2

比体积指数(％)＝具有酶的面包的比体积(按ml/g计)/无酶的面包的比体积(按ml/g计)*100

结果

当0.02mg EP/kg面粉的GH5木聚糖酶(SEQ ID NO:1)添加至具有额外2％水的面包生面团中以增加体积时，粘性从生面团评估分数5降低到3，这与具有最佳水位的对照生面团可比较。

看到GH5木聚糖酶的这种粘性降低效果，而不影响面包的任何其他特性，例如面包体积(表4)。

生面团特性

表2混合之后的生面团特性

表3在20min等待时间后的生面团特性

面包体积

表4醒发55min的面包的体积和比体积

结论：

GH5木聚糖酶(0.02mg Ep/kg面粉)能够减少由向生面团中添加2％(w/w)额外的水引起的生面团粘性。添加2％额外的水导致增加的体积，并且添加GH5，生面团粘性降低而不影响体积。

实例2：

GH5木聚糖酶(SEQ ID NO:1)和戊聚糖酶(Pentopan)，在烘焙中

所做的工作：

根据具有正常和延长醒发的直接生面团方法使用以下配方和工艺烘焙面包。

配方：

+根据表6的酶：酶的剂量

表6酶的剂量(基于面粉)

程序：

1.成分的称量

2.将盐、蔗糖、酵母、抗坏血酸和酶添加至混合器钵中。

4.将面粉添加至混合器钵中。

5.使用螺旋式混合器(SPK8,Diosna公司，DE)，在63rpm混合3min以及在90rpm混合6min。

7.在塑料盖下在室温(21℃)下将生面团给予20min的等待时间，并进行第二次面团评估(等待时间后的生面团参数)。

8.将生面团称重(350g/面包)，并且然后模制。

9.将模制的生面团在塑料覆盖下给予15分钟的等待时间。

10.将用于面包的生面团在压片机(M0671 MPB-001，Glimek，SE)中成形。将片状生面团转移到1200ml平底锅(最大160x 110x 85mm)中，该平底锅放在烤板上。

11.将生面团在32℃下醒发，86％相对湿度55min或80min。

13.将面包在烘焙后从盘中取出并且放置在烤板上。

14.允许面包冷却至室温。

15.关于体积、外部和内部面包评估来评估面包。

手工生面团评估

在混合后并且在20min等待时间后，使用如在以下表7中所描述的参数、定义和评估方法来直接评估生面团特性。使用0-10之间的标度，其中对照生面团(没有任何酶添加的生面团1)给出评分5，并且相对于对照评估添加酶的其他生面团。离对于对照生面团所判断的越远，对该生面团给出的得分越高/越低。

表5生面团评估

体积确定

每个面包安装在机器中。

每个面包条的重量用Volscan仪器的内置天平自动确定。

等式1

比体积(ml/g)＝体积(按ml计)/重量(按g计)

等式2

面包评估

使用以下表8和表9中所描述的参数、定义和评估方法来评估外部和内部面包特性。使用0-10之间的标度，其中对照面包(来自没有任何酶添加的生面团1的面包)给出评分5，并且相对于对照评估其他面包。离对于对照面包所判断的越远，对该面包给出的得分越高/越低。

表6外部面包评估

内部面包评估

将面包在吐司切片机(Daub Verhoeven，NL)上切片。将面包切片并列放置用于视觉评估。

表7内部面包评估

结果

当将40ppm戊聚糖酶添加至面包生面团时，从生面团评估分数5至7，粘性和柔软度增加。如在表10中可以看出，如果0.04mg EP/kg面粉的木聚糖酶GH5与40ppm木聚糖酶一起添加，则在等待时间后，粘性和柔软度分数保持在与对照可比较的生面团评估分数。

看到GH5_21的这种粘性和柔软性降低效果不影响面包的任何其他特性，例如面包体积(表12和表13)或面包特性(表14和表15)。

生面团特性

表8混合后生面团特性

表9 20min等待时间后生面团特性

面包体积

表10面包醒发55min的体积和比体积

表11醒发80min的面包的体积和比体积

面包特性

表12面包醒发55min的外部和内部评估

表13面包醒发80min的外部和内部评估

结论：

与40ppm戊聚糖酶单独不影响体积或面包特性相比，GH5木聚糖酶(SEQ ID NO:1)(0.04mg Ep/kg面粉)与40ppm戊聚糖酶一起能够减少生面团粘性。

序列表

<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)

<120> 用于生面团干燥的GH5木聚糖酶

<130> 12984-WO-PCT

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 598

<212> PRT

<213> 大象粪便宏基因组

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(598)

<400> 1

Trp Arg Gly Met Arg Met Pro Glu Leu Phe Ile Lys Gly Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Met Ala Lys Asp Met Asn Gly Asn Asp Ser Ile Val Asn Leu His Gly

20 25 30

Phe Gly Gln Thr Tyr Ser Ala Tyr Phe Asn Gly Tyr Ala Trp Cys Lys

35 40 45

Asn Pro Asp Gly Ser Val Asn Trp Gly Lys Thr Lys Asp Ala Ala Ala

50 55 60

Cys Val Lys Trp Asn Lys Glu Gln Ile Gly Leu Met Leu Asp His Gly

65 70 75 80

Trp Lys Val Asn Trp Leu Arg Leu His Met Asp Pro Ala Trp Ser Asn

85 90 95

Asn Glu Thr Lys Val Asn Gln Trp Gln Ser Gln His Pro Gly Thr Tyr

100 105 110

Tyr Ser Glu Asn Leu Ile Val Ala Phe Asp Met Asn Leu Phe Lys Lys

115 120 125

Tyr Leu Asp Glu Ile Phe Ile Pro Met Ala Glu Tyr Ala Ile Glu Asn

130 135 140

Gly Ile Tyr Val Val Met Arg Pro Pro Gly Val Cys Pro Gln Lys Leu

145 150 155 160

Thr Val Gly Asp Glu Tyr Gln Gln Tyr Leu Ile Lys Val Trp Thr Tyr

165 170 175

Val Cys Ser His Glu Lys Leu Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Met Phe Glu

180 185 190

Leu Ala Asn Glu Pro Ile Asp Met Asn Asp Gly Asn Gly Asn Tyr Thr

195 200 205

Ser Trp Ser Asp Gly Ser Gln Lys Asn Cys Thr Lys Phe Phe Gln Lys

210 215 220

Ile Val Asp Glu Ile Arg Ala Val Gly Cys Asn Asn Ile Leu Trp Val

225 230 235 240

Pro Gly Leu Ala Tyr Gln Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Val Lys Tyr Pro

245 250 255

Ile Val Gly Glu Asn Ile Gly Phe Ala Val His Cys Tyr Pro Gly Trp

260 265 270

Tyr Gly Ser Asp Ser Glu Val Ala Ser Ala Glu Gln Gln Ile Val Thr

275 280 285

Asn Gly Asn Thr Tyr Ala Asp Phe Gln Ser Gly Trp Ser Ala Ser Ile

290 295 300

Asp Gly Val Ser Lys Leu Arg Pro Ile Ile Val Thr Glu Met Asp Trp

305 310 315 320

Ala Pro Lys Lys Tyr Asn Ser Ser Trp Gly Lys Ala Thr Thr Gly Lys

325 330 335

Leu Gly Gly Val Gly Phe Gly Asn Asn Phe Lys Tyr Ile Met Asp Lys

340 345 350

Thr Gly Asn Val Ser Trp Met Leu Phe Thr Asp Ala Asp Lys Leu Ala

355 360 365

Lys Tyr Asp Asp Ser Lys Ala Asp Gly Ser Thr Phe Leu Thr Asp Pro

370 375 380

Glu Ala Cys Pro Arg Pro Val Tyr Arg Trp Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu

385 390 395 400

Pro Gly Trp Lys Phe Val Glu Thr Leu Ala Asp Glu Phe Tyr Met Phe

405 410 415

Pro Gly Thr Asn Ser Ile Phe Ser Pro Asn Ile Trp Glu Lys Gly Thr

420 425 430

Leu Thr Lys Asn Asp Asp Gly Ser Arg Thr Leu Val Thr Gly Gln Tyr

435 440 445

Gly Phe Gly Gly Trp Lys Phe Gly Gly Gly Leu Asp Met Ser Gly Tyr

450 455 460

Lys Tyr Leu Val Leu Asn Leu Thr Lys Ala Pro Ala Ser Asn Gln Trp

465 470 475 480

Ser Leu Arg Leu Phe Asp Val Asp Asn Tyr Trp Thr Asp Pro Tyr Met

485 490 495

Lys Asp Val Lys Ser Ser Thr Arg Val Val Val Asp Leu Gln Asn Met

500 505 510

Lys Asn Ser Lys Gly Val Lys Val Asp Pro Ser His Ile Tyr Ile Leu

515 520 525

Gly Leu Trp Ser Thr Gly Gly Thr Pro Ile Thr Ile Lys Asp Ile Tyr

530 535 540

Leu Thr Asn Asn Ser Asp Tyr Ser Pro Glu Ser Thr Gly Ile Ser Glu

545 550 555 560

Thr Leu Ala Glu Lys Arg Leu Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Leu Ser Gly

565 570 575

Gln Arg Val Thr Glu Pro Arg Asn Gly His Val Tyr Ile Arg Asn Gly

580 585 590

Lys Lys Phe Ile Tyr Lys

595

<210> 2

<211> 1797

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 2

tggcgtggca tgagaatgcc ggaactgttt atcaaaggca gatatctgat ggcgaaagat 60

atgaatggca acgatagcat tgttaatctg catggctttg gccaaacata tagcgcgtat 120

tttaacggct atgcgtggtg caaaaatccg gatggctcag ttaattgggg caaaacaaaa 180

gatgcagcag catgcgttaa atggaataaa gaacaaattg gcctgatgct ggatcatggc 240

tggaaagtta attggctgag actgcatatg gatccggcat ggtcaaataa tgaaacaaaa 300

gtcaatcaat ggcagagcca acatccggga acatattatt cagaaaatct gatcgtcgcg 360

tttgatatga acctgtttaa aaaatatctg gatgaaatct ttattccgat ggcggaatat 420

gcgattgaaa acggcattta tgttgttatg cgtccgcctg gcgtttgtcc gcaaaaactg 480

acagttggag atgaatatca gcagtacctg attaaagtct ggacatatgt ttgcagccat 540

gaaaaactga aaaacaatcc gtatattatg tttgaactgg cgaacgaacc gatcgatatg 600

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gaaccgagaa atggccatgt ctatattcgc aacggcaaaa aattcattta caaataa 1797

Claims

1.一种用于制备基于生面团的产品的方法，该方法包括向生面团中添加GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该GH5木聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少70％一致性。

3.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该基于生面团的产品是面包。

4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该生面团包含小麦和/或玉米。

5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中另外的一种或多种酶选自下组，该组由以下各项组成：淀粉酶、抗老化淀粉酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、蛋白酶、转谷氨酰胺酶、纤维素酶、半纤维素酶、酰基转移酶、蛋白质二硫键异构酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶、碳水化合物氧化酶、硫氢基氧化酶、以及葡糖淀粉酶，将其添加至生面团中。

6.一种通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法可获得的烘焙产品。

7.通过将GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11，添加至生面团成分中制备生面团。

8.烘焙组合物，该烘焙组合物包括GH5木聚糖酶和选自下组的木聚糖酶，该组由以下各项组成：GH8、GH10和GH11。

9.根据权利要求8所述的烘焙组合物，该烘焙组合物是生面团、面粉组合物、或面粉预混物。

10.根据权利要求8-9中任一项所述的烘焙组合物，该烘焙组合物是处于颗粒或团聚粉末或液体的形式。

11.将根据权利要求8-10中任一项所述的烘焙组合物用于制备生面团的用途。

12.根据权利要求1所述的方法，其中与其中未添加GH5木聚糖酶的生面团相比，该生面团更少粘性。

13.根据权利要求1所述的方法，其中该GH5木聚糖酶是GH5_21或GH5_34木聚糖酶。