CN105886581A - 一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体地提供一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法。根据本发明的重组人胸腺法新的高密度发酵方法，包括以下步骤：1)工作种子培养；2)接种于发酵罐发酵；3)诱导前补料；4)诱导表达。本发酵方法可实现在55L规模发酵中重组人胸腺法新的高效表达，最终菌体浓度OD₆₀₀可达90以上，且融合蛋白表达量占菌体总蛋白的45％以上，使重组人胸腺法新的发酵工艺规模达到了世界先进水平，并解决了重组人胸腺法新表达量低和产率达不到规模化要求的技术难题，为重组人胸腺法新的产业化奠定了坚实基础。

Description

一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法

(一)技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体地涉及一种重组人胸腺法新的高密度、高表达发酵方法。

(二)背景技术

胸腺法新是由胸腺分泌的免疫功能较强的小分子多肽，由28个氨基酸组成。在体内、外试验中，胸腺法新对细胞因子的分泌、淋巴细胞表面标志及淋巴细胞功能均有影响，在机体免疫应答过程中起着重要的作用，被认为是生物反应调节物，因此被广泛用于免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂、治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、癌症以及自身免疫性疾病。

胸腺法新的制备有化学合成与基因工程两种方法。化学合成胸腺法新：于上世纪90年代初由美国赛生药业国际有限公司研发，商品名为日达仙。自2002年以来，国内也有多家公司开发出化学合成胸腺法新，如迈普新、基泰以及和日等。基因工程胸腺法新：目前仍处于研究阶段，国内外尚未有基因工程胸腺法新产品上市。

化学合成胸腺法新采用固相合成法制备，需要用肽合成仪合成胸腺法新，经化学修饰后，再用高效液相色谱进行纯化，对原料纯度要求高，合成仪器和设备投资大，生产工艺复杂，环境污染严重，成本高。因此，产品价格昂贵，医疗费用较高，合成过程可能引入一定的毒性，在一定程度上限制了临床上广泛应用。

基因工程胸腺法新是用生物工程技术构建胸腺法新基因表达载体，主要在大肠杆菌中表达，经分离纯化而制成，可以克服化学合成法存在的不足。因此，国内外一些单位正在研发基因工程胸腺法新，但大多数单位目前尚未解决小分子多肽表达量低的技术难题，其产率达不到规模化要求，有待进一步研究。例如，林陈水在15L发酵罐中(发酵规模9L)进行分批补料培养，最终菌体浓度OD₆₀₀可达40以上，目的产物占菌体总蛋白25％以上(林陈水等，浙江工业大学学报.2006；34(3)：277-280)。程波在5L发酵罐中(发酵规模3L)进行了补料分批培养，最终获得菌体的干重达10g/L(相当于菌体浓度OD₆₀₀ 25)，融合蛋白表达量达23.25％(程波等，武汉工程大学学报.2007；29(3)：21-25)。颜真在5L发酵罐中(发酵规模3.5L)进行分批补料培养，最终菌体浓度OD₆₀₀达到60以上，融合蛋白表达占菌体总蛋白的42.4％左右(颜真等，药物生物技术.2000；7(4)：209-212)。总之，在现有关重组人胸腺法新的发酵工艺报道中，所涉及的发酵规模仍处于9L以下小规模研究阶段，并且在较小规模发酵时虽然可以获得较高的菌体浓度和融合蛋白表达量，但是在较大规模发酵时却获得较低的菌体浓度和融合蛋白表达量，因此，现报道的发酵工艺中存在大问题是发酵规模、菌体浓度和融合蛋白表达量三者不能以较高水平同时呈现，从而导致其产率达不到规模化要求。

基于上述，因而目前急需一套可实现重组人胸腺法新高密度、高表达，而且能够到达规模化要求的发酵工艺，为其生产制备提供充足的原料以及应用奠定基础，使基因工程胸腺法新成为化学合成胸腺法新的有效替代品。

(三)发明内容

发明的目的是提供一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法，从而实现高密度、高表达生产重组人胸腺法新。

根据本发明的重组人胸腺法新的高密度发酵方法，包括以下步骤：

1)工作种子培养：

将工作种子库的菌种接种于一级种子培养基中，置于摇床进行培养，控制温度35-37℃，转速200-230rpm，培养7-9h，得到一级种子液；将一级种子液以2-5％的接种量接种于二级种子培养基中，置于摇床进行培养，控制温度35-37℃，转速200-230rpm，培养15-17h，即得到发酵工作种子液；

2)接种于发酵罐发酵：

将制备好的发酵工作种子液以5-15％的接种量接种于含发酵培养基的发酵罐中进行发酵，机械搅拌转速为150-500rpm，通气量为10-80L/min，罐压为0.2-0.4par，维持溶氧水平在20-60％，发酵温度为35-37℃，加入25-28％(v/v)氨水控制发酵pH在6.8-7.2；

3)诱导前补料：

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为1.0-1.5时，开始以2.5mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，发酵过程中每隔1h进行离线检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度反馈补料，控制葡萄糖浓度在0.8-1.2g/L；紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为30-35时，以5-7mL/L·h的流速开始补加有机氮源补料培养基；其中所述的碳源补料培养基为50％葡糖糖溶液，所述的有机氮源补料培养基为200％胰蛋白胨与酵母粉(1∶3)混合溶液；

4)诱导表达：

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为70-90时，向发酵罐中加入含异丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，至IPTG终浓度为0.5-0.7mM，10min后开始以12-14mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，同时以12-14mL/L·h的流速补加有机氮源补料培养基，同时将发酵温度调为30℃，开始进行目的蛋白诱导表达4-5h。

本发明的优点在于根据菌体生长规律，结合底物浓度反馈补料，调节碳源和有机氮补料液流加速度，维持葡糖糖浓度在0.8-1.2g/L和控制C∶N比例，从而调节菌体的生长速度以及目的产物的合成效率。本发酵方法可实现重组人胸腺法新的高密度、高表达发酵，在100L中试发酵罐(发酵规模55L)发酵获得的最终菌体浓度OD₆₀₀可高达90以上，且融合蛋白表达量占菌体总蛋白的45％以上，使其发酵规模、最终菌体浓度和融合蛋白表达量三者能够以较高水平同时呈现，即使其发酵工艺的实用性和效率性更强，从而解决了重组人胸腺法新表达量低的技术难题和产率达不到规模化要求问题，为重组人胸腺法新的产业化奠定了坚实基础。

(四)附图说明

图1为30L发酵罐中试高密度发酵时菌体生长曲线图；图中，横坐标为发酵时间，纵坐标为菌体浓度OD₆₀₀。

图2为30L发酵罐中试高密度发酵时菌体湿重变化示意图；图中，横坐标为发酵时间，纵坐标为菌体湿重。

图3为重组人胸腺法新的30L发酵罐中试高密度发酵表达SDS-PAGE电泳图；图中，M为蛋白分子量Marker，泳道1为诱导前，泳道2为诱导后。

图4为100L发酵罐中试高密度发酵时菌体生长曲线图；图中，横坐标为发酵时间，纵坐标为菌体浓度OD₆₀₀。

图5为100L发酵罐中试高密度发酵时菌体湿重变化示意图；图中，横坐标为发酵时间，纵坐标为菌体湿重。

图6为重组人胸腺法新的100L发酵罐中试高密度发酵表达SDS-PAGE电泳图；

图中，M为蛋白分子量Marker，泳道1为诱导后，泳道2为诱导前。

(五)具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例中所用的材料，如下所示：

工作菌种：采用本公司自行构建的BL21/pNL-06-Tα1工程菌(参见发明专利CN 101993885A)作为工作菌种。

主要设备：100L发酵罐(Hanil，LIFLUS SP 100L)，30L发酵罐(上海保兴，BIOTECH-30JS)，高压蒸汽灭菌器(江阴滨江，LS-B100L-1)，气浴恒温振荡器(江苏太仓，THZ-22)，电子天平(Sartorius，TE4101-L、TE212-L)，紫外分光光度计(Agilent Technologies，Cary60)，工作超净台(苏州安泰，SW-CJ-1F)，pH计(MettlerToledo，FE20)，生化分析仪(山东省科学院生物研究所，SBA-40C)，凝胶成像仪(Tanon，1600)，台式离心机(Sigma，1-13)，连续流高速冷冻离心机(HITACHI，CR21GIII)。

种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠1g/L。

发酵培养基：磷酸二氢钾13.3g/L、磷酸氢二铵4g/L、一水合柠檬酸1.7g/L、胰蛋白胨1g/L、酵母粉1g/L、七水硫酸镁1.145g/L、葡萄糖1g/L、微量元素溶液4mL/L、硫酸卡那霉素0.03g/L。

碳源补料培养基：50％葡萄糖溶液。

有机氮源补料培养基：200％有机氮源混合溶液(胰蛋白胨∶酵母粉＝1∶3)。

实施例1

1.30L发酵罐中试高密度发酵：

1)工作种子培养

从-80℃工作种子库中取一支菌种，待其完全融化后取100μL菌液接种于一级种子培养基(250mL三角瓶装50mL，含50μg/mL卡那霉素)中，置于摇床进行培养，控制温度37℃，转速230rpm，培养8h，得到一级种子液；将一级种子液以3％的接种量接种于二级种子培养基(2L三角瓶分别装800mL，含50μg/mL卡那霉素)中，置于摇床进行培养，控制温度37℃，转速230rpm，培养15-17h，即得到发酵工作种子液。

2)接种于30L发酵罐发酵

将制备好的发酵工作种子液以10％的接种量接种于含14L发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵；机械搅拌转速为150-500rpm，通气量为10-80L/min，罐压为0.2-0.4par，维持溶氧水平在20-50％，控制发酵温度37℃，加入25-28％(v/v)氨水控制发酵pH在6.9-7.1。

3)诱导前补料

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为1.0-1.3时，开始以2.5mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，发酵过程中每隔1h进行离线检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度进行反馈补料，控制葡萄糖浓度在0.8-1.2g/L；紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为32左右时，以6mL/L·h的流速开始补加有机氮源补料培养基。

4)诱导表达

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为80左右时，向发酵罐中加入含2g异丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，10min后开始以14mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，同时以14mL/L·h的流速补加有机氮源补料培养基，同时将发酵温度调为30℃，开始进行目的蛋白诱导表达4h。

5)下罐收集菌体

诱导表达4h后，停止流加碳源补料培养基和有机氮源补料培养基，关闭所有控制参数，结束发酵进程，之后利用罐压将发酵菌液排放至干净的100L收集桶中。采用连续流离心机离心(9500rpm、4℃、进样流速100mL/min)收集的发酵菌液，弃上清，收集沉淀物，称量沉淀物总重即得到总菌体湿重。

2.主要指标测定方法：

1)菌体浓度的测定

A.取样：每隔1h从发酵罐中进行取样，每次取样量100mL，取样时弃掉前50mL发酵菌液，收集后50mL发酵菌液。

B.样品处理：将采集的发酵菌液吹打混匀后，取适量菌液，用纯水进行稀释，使其稀释液的吸光值OD₆₀₀读数在0.2-0.8范围内。

C.测定：以纯水作为空白对照，采用紫外分光光度计在波长600nm处测定稀释液的吸光值。

D.数据处理：根据公式(菌体浓度＝稀释液吸光值×稀释倍数)计算得出菌体浓度OD₆₀₀，并以发酵时间为横坐标，以菌体浓度OD₆₀₀为纵坐标，绘制出发酵过程的菌体生长曲线图。

2)菌体湿重的测定

A.取样：每隔1h从发酵罐中取样，每次取样量100mL，取样时弃掉前50mL发酵菌液，收集后50mL发酵菌液。

B.测定：将采集的发酵菌液吹打混匀后，分别取1mL菌液装于4支已称重的1.5mL离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，最后采用电子天平称量4支离心管的重量，即得到总重。

C.数据处理：根据公式{菌体湿重＝(总重-总皮重)/4×10^-3}计算得出单位体积的菌体湿重，并以发酵时间为横坐标，以菌体湿重为纵坐标，绘制出发酵过程的菌体湿重变化示意图。

3)融合蛋白含量测定

采用非还原性SDS-PAGE电泳法测定融合蛋白表达量占菌体总蛋白的百分比，具体操作为：

A.取样：在诱导前(对照组)和发酵结束(样品组)时，分别取等菌体量的发酵菌液(100-200μL)，各1支，12000rpm离心2min，弃上清，收集菌体。

B.样品处理：首先，在对照组和样品组样品中分别加入90μL破菌液；其次，在对照组和样品组样品中分别加入2μLDNA酶，吹打混匀，12000rpm离心2min，分别取20μL上清；最后，与2×非还原型上样缓冲液以1∶1混合，煮沸2min，同样，蛋白分子量Marker煮沸2min。

C.SDS-PAGE凝胶配制：

15％分离胶(10mL)：纯水2.3mL、1.5M Tris-HCl PH8.82.5mL、30％Arc/Bis凝胶储液5mL、10％SDS 0.1mL、TEMED 5μL、10％AP 100μL。

5％浓缩胶(6mL)：纯水3.4mL、1M Tris-HCl pH6.80.625mL、30％Arc/Bis凝胶储液0.85mL、TEMED 5μL、10％AP 50μL。

按上述配方配制分离胶溶液，混匀后立即倒入准备好的凝胶模具中，用移液器在凝胶上方轻轻加入纯水，水封，静置20min聚合。聚合后倒掉模具中水封用蒸馏水，再按上述配方配制浓缩胶溶液，混匀后立即倒入浓缩胶，插上梳子，静置20min聚合。

D.上样跑电泳：对照组和样品组上样量均为20μL/孔，蛋白分子量Marker上样量10μL/孔；上样后开始以30mA恒流跑电泳1h。

E.染色和脱色：电泳结束，关闭电泳仪，将电泳胶转移至染色盒中，加入考马斯亮兰染色液，置于摇床上染色30min，之后更换为脱色液，于摇床上脱色至背景全无，取出电泳胶置于水中。

F.拍照保存：将脱色后的电泳胶转移至白色板上，采用Tanon凝胶成像仪拍摄电泳胶，保存照片。

G.数据处理：利用Tanon Gel Image System1D分析软件分析电泳图片，得出融合蛋白的表达量。

3.实验结果：

实施例1，经菌体浓度测定，显示最终菌体浓度OD₆₀₀可高达100以上(见图1)；经菌体湿重测定，显示最终单位菌体湿重约为210g/L(见图2)；经融合蛋白含量测定，显示融合蛋白表达量占菌体总蛋白的45％以上(见图3)。

实施例2

1.100L发酵罐中试高密度发酵：

1)工作种子培养

从-80℃工作种子库中取一支菌种，待其完全融化后取200μL菌液接种于一级种子培养基(500mL三角瓶装100mL，含50μg/mL卡那霉素)中，置于摇床进行培养，控制温度37℃，转速230rpm，培养8h，得到一级种子液；将一级种子液以3％的接种量接种于二级种子培养基(4个2L三角瓶分别装800mL，含50μg/mL卡那霉素)中，置于摇床进行培养，控制温度37℃，转速230rpm，培养15-17h，即得到发酵工作种子液。

2)接种于100L发酵罐发酵

将制备好的发酵工作种子液以5.5％的接种量接种于含55L发酵培养基的100L发酵罐中进行发酵，机械搅拌转速为150-500rpm，通气量为10-80L/min，罐压为0.2-0.4par，维持溶氧水平在20-50％，发酵温度37℃，加入25-28％(v/v)氨水控制发酵pH在6.9-7.1。

3)诱导前补料

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为1.0-1.3时，开始以2.5mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，发酵过程中每隔1h进行离线检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度进行反馈补料，控制葡萄糖浓度在0.8-1.2g/L；紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为32左右时，以6mL/L·h的流速开始补加有氮源补料培养基。

4)诱导表达

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为80左右时，向发酵罐中加入含8g异丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，10min后开始以14mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，同时以14mL/L·h的流速补加有机氮源补料培养基，同时将发酵温度调为30℃，开始进行目的蛋白诱导表达4h。

5)下罐收集菌体

诱导表达4h后，停止流加碳源补料培养基和有机氮源补料培养基，关闭所有控制参数，结束发酵进程，之后利用罐压将发酵菌液排放至干净的100L收集桶中。采用连续流离心机离心(9500rpm、4℃、进样流速100mL/min)收集的发酵菌液，弃上清，收集沉淀物，称量沉淀物总重即得到总菌体湿重。

2.主要指标测定方法：

1)菌体浓度的测定

A.取样：每隔1h从发酵罐中进行取样，每次取样量100mL，取样时弃掉前50mL发酵菌液，收集后50mL发酵菌液。

B.样品处理：将收集的发酵菌液吹打混匀，取适量菌液，用纯水进行稀释，使其稀释液的吸光值OD₆₀₀读数在0.2-0.8范围内。

C.测定：以纯水作为空白对照，采用紫外分光光度计在波长600nm处测定稀释液的吸光值。

D.数据处理：根据公式(菌体浓度＝稀释液吸光值×稀释倍数)计算得出菌体浓度OD₆₀₀，并以发酵时间为横坐标，以菌体浓度OD₆₀₀为纵坐标，绘制出发酵过程的菌体生长曲线图。

2)菌体湿重的测定

A.取样：每隔1h从发酵罐中取样1次，每次取样量100mL，取样时弃掉前50mL发酵菌液，收集后50mL发酵菌液。

B.测定：将收集的发酵菌液吹打混匀后，分别取1mL菌液装于4支已称重的1.5mL离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，最后采用电子天平称量4支离心管的重量，即得到总重。

C.数据处理：根据公式{菌体湿重＝(总重-总皮重)/4×10^-3}计算得出单位体积的菌体湿重，并以发酵时间为横坐标，以菌体湿重为纵坐标，绘制出发酵过程的菌体湿重变化示意图。

3)融合蛋白含量测定

采用非还原性SDS-PAGE电泳法测定融合蛋白表达量占菌体总蛋白的百分比，具体操作为：

A.取样：在诱导前(对照组)和发酵结束(样品组)时，分别取等菌体量的发酵菌液(100-200μL)，各1支，12000rpm离心2min，弃上清，收集菌体。

B.样品处理：首先，在对照组和样品组样品中分别加入90μL破菌液；其次，在对照组和样品组样品中分别加入2μLDNA酶，吹打混匀，12000rpm离心2min，分别取20μL上清；最后，分别与2×非还原型上样缓冲液以1∶1混合，煮沸2min，同样，蛋白分子量Marker煮沸2min。

C.SDS-PAGE凝胶配制：

15％分离胶(10mL)：纯水2.3mL、1.5M Tris-HCl PH8.82.5mL、30％Arc/Bis凝胶储液5mL、10％SDS 0.1mL、TEMED 5μL、10％AP 100μL。

5％浓缩胶(6mL)：纯水3.4mL、1M Tris-HCl pH6.80.625mL、30％Arc/Bis凝胶储液0.85mL、TEMED 5μL、10％AP 50μL。

按上述配方配制分离胶溶液，混匀后立即倒入准备好的凝胶模具中，用移液器在凝胶上方轻轻加入纯水，水封，静置20min聚合。聚合后倒掉模具中水封用蒸馏水，再按上述配方配制浓缩胶溶液，混匀后立即倒入浓缩胶，插上梳子，静置20min聚合。

D.上样跑电泳：对照组和样品组上样量均为20μL/孔，蛋白分子量Marker上样量10μL/孔；上样后开始以30mA恒流跑电泳1h。

E.染色和脱色：电泳结束，关闭电泳仪，将电泳胶转移至染色盒中，加入考马斯亮兰染色液，置于摇床上染色30min，之后更换为脱色液，于摇床上脱色至背景全无，取出电泳胶置于水中。

F.拍照保存：将脱色后的电泳胶转移至白色板上，采用凝胶成像仪拍摄电泳胶，保存照片。

G.数据处理：利用Tanon Gel Image System1D分析软件分析电泳图，得出融合蛋白的表达量。

3.实验结果：

实施例2，经菌体浓度测定，显示最终的菌体浓度OD₆₀₀可高达90以上(见图4)；经菌体湿重测定，显示最终单位菌体湿重约为191g/L(见图5)；经融合蛋白含量测定，显示融合蛋白表达量占菌体总蛋白的45％以上(见图6)。

Claims (3)

1.一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)工作种子培养：

将工作种子库的菌种接种于一级种子培养基中，置于摇床进行培养，控制温度35-37℃，转速200-230rpm，培养7-9h，得到一级种子液；将一级种子液以2-5％的接种量接种于二级种子培养基中，置于摇床进行培养，控制温度35-37℃，转速200-230rpm，培养15-17h，即得到发酵工作种子液；

2)接种于发酵罐发酵：

将制备好的发酵工作种子液以5-15％的接种量接种于含发酵培养基的发酵罐中进行发酵，机械搅拌转速为150-500rpm，通气量为10-80L/min，罐压为0.2-0.4par，维持溶氧水平在20-60％，发酵温度为35-37℃，加入25-28％(v/v)氨水控制发酵pH在6.8-7.2；

3)诱导前补料：

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为1.0-1.5时，开始以2.5mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，发酵过程中每隔1h进行离线检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度反馈补料，控制葡萄糖浓度在0.8-1.2g/L；紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为30-35时，以5-7mL/L·h的流速开始补加有机氮源补料培养基；其中所述的碳源补料培养基为50％葡糖糖溶液，所述的有机氮源补料培养基为200％胰蛋白胨与酵母粉(1∶3)混合溶液；

4)诱导表达：

紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为70-90时，向发酵罐中加入含异丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，至IPTG终浓度为0.5-0.7mM，10min后开始以12-14mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，同时以12-14mL/L·h的流速补加有机氮源补料培养基，同时将发酵温度调为30℃，开始进行目的蛋白诱导表达4-5h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于高密度发酵规模可达55L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵过程中诱导表达阶段，碳源补料培养基与有机氮源补料培养基的流加速度相等。