CN105861735A - Rap1b在冠心病诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RAP1B基因及其表达产物在制备冠心病的诊断工具中的应用。本发明利用基因芯片和RT‑PCR实验证明RAP1B基因在正常个体中和冠心病患者中的表达存在差异，因此RAP1B基因可以作为诊断冠心病的分子标志物。进一步，进行了扩大样本检测发现RAP1B与冠心病具有很好的相关性，可用于制备冠心病辅助诊疗制剂。

Description

RAP1B在冠心病诊断中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及RAP1B基因在冠心病诊断中的用途。

背景技术

冠心病(coronaryarterydisease，CAD)是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称，是冠状动脉粥样硬化，使血管狭窄或阻塞，和(或)因冠状动脉功能性改变(痉挛)导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病。世界卫生组织将冠心病分为5大类：无症状心肌缺血(隐匿性冠心病)、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心脏病)和猝死5种临床类型。临床中常常分为稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征。目前CAD是发达国家人口死亡的主要原因之一，在我国正呈急剧上升的趋势，已经成为我国人口死亡的主要原因，且出现发病年龄偏低的特点，严重危害人们身体健康和生活质量，且已引起人们的广泛关注。

研究已证实，CAD是遗传因素与环境因素相互作用所导致的多基因疾病，目前其病因研究主要集中在两个方面：一，继续从宏观水平寻找危险因素；二，从微观水平探讨CAD发病的遗传易感机理。研究表明，包括a-淋巴毒素基因(lymphotoxin-alpha，LT-a)，蛋白酶体α亚单位6(proteasomesubunitalphatype6，PSMA6)[8]，β2肾上腺素能受体(beta2-adrenergicreceptor，β2AR)，Toll样受体8基因(Toll-likereceptor8，TLR8)和内皮源型一氧化氮合酶基因(EndothelialNOSynthase，eNOS)等多个基因都与CAD的易感性相关。因此，从分子遗传水平探讨冠心病发病的遗传易感机制，发掘CAD新的易感基因，对CAD的防治具有重要的意义。

另外，通过对比正常个体与冠心病患者的基因或蛋白的表达差异的比对，可以找到冠心病与相关基因或蛋白因子异常表达的关系，进而通过检查相关基因或蛋白的表达情况，可以诊断患者是否患有冠心病或者患冠心病的可能。

高通量测序技术的发展为确定相关基因或蛋白与冠心病的关系提供了新的手段。利用高通量测序技术比较正常个体与冠心病患者基因或蛋白表达谱的差异，筛选冠心病发生发展相关的基因，可发现冠心病的标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于冠心病诊断的分子标志物。使用基因标志物来诊断冠心病的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在患病早期就能知晓患病风险，并针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测RAP1B基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

进一步，所述检测RAP1B基因表达的产品包括检测RAP1B基因mRNA水平的产品、和/或检测RAP1B蛋白水平的产品。

进一步，所述检测RAP1B基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测RAP1B基因表达以诊断冠心病的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增RAP1B基因的引物；所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增RAP1B基因的引物；所述用免疫检测诊断冠心病的产品包括：与RAP1B蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断冠心病的产品包括：与RAP1B基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断冠心病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与RAP1B蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与RAP1B基因的核酸序列杂交的探针。

所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括的一对特异扩增RAP1B基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述检测RAP1B基因表达的产品可以是检测RAP1B基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

所述诊断冠心病的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断冠心病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知RAP1B基因的异常与冠心病相关也属于RAP1B基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断冠心病的工具，所述工具包括检测RAP1B基因表达的试剂；所述试剂包括检测RAP1B基因mRNA的引物和/或探针、检测RAP1B蛋白的抗体。

所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测RAP1B基因转录水平的针对RAP1B基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的RAP1B蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括RAP1B基因在内的多个基因(例如，与冠心病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括RAP1B蛋白在内的多个蛋白质(例如与冠心病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与冠心病的标志物同时检测，可大大提高冠心病诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测RAP1B基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括RAP1B蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测RAP1B基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对RAP1B基因的引物和/或探针。根据RAP1B基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测RAP1B基因表达水平的引物和探针。

所述试纸包括检测RAP1B基因表达的试剂。

所述高通量测序平台包括检测RAP1B基因表达的试剂。

与RAP1B基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述RAP1B蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述RAP1B蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与RAP1B蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述检测RAP1B基因mRNA的引物包括SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

在本发明的上下文中，“RAP1B基因”包括RAP1B基因以及RAP1B基因的任何功能等同物的多核苷酸。RAP1B基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中RAP1B基因(NC_000023.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，RAP1B基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述RAP1B基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，RAP1B基因表达产物包括RAP1B蛋白以及RAP1B蛋白的部分肽。所述RAP1B蛋白的部分肽含有与冠心病相关的功能域。

“RAP1B蛋白”包括RAP1B蛋白以及RAP1B蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括RAP1B蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与RAP1B的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，RAP1B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述RAP1B蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、***、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是RAP1B蛋白的融合蛋白。对于与RAP1B蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留RAP1B蛋白的生物学活性即可。

本发明的RAP1B蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留RAP1B蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断冠心病”既包括判断受试者是否已经患有冠心病、也包括判断受试者是否存在患有冠心病的风险。

在本发明的上下文中，“治疗冠心病”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了RAP1B基因表达与冠心病相关，通过检测受试者组织中RAP1B的表达，可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-RAP1B基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现冠心病的早期诊断，从而降低冠心病的死亡率。

附图说明

图1显示利用基因芯片检测RAP1B基因在冠心病中的表达情况；

图2显示利用Western blot检测RAP1B蛋白在冠心病中的表达情况。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1病例的收集

选择正常人群及患有冠心病的人群进行基因比对，选取6例冠心病患者病例样本及5例正常对照组样本，分别抽取5-10ml空腹血液。

实施例2高通量测序及分析

对血液进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因RAP1B。

实施例3RAP1B基因的正常人及冠心病患者中的差异表达

1、样本获取：40例(包括20正常人和20例冠心病患者)，分别取空腹血液5-10ml。样本个体的临床资料包括：身高、体重、血压、血脂、心电图等。

2、样本血液中RNA的获取

利用QINGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。

3、逆转录

利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。

4、QPCR

(1)引物设计

根据Genbank中RAP1B基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

RAP1B基因：

正向引物为5’-CACAGCACAGTCCACATT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-CACACTTATTACCAACAAGAATCA-3’(SEQ ID NO.4)，

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	1μl
反向引物	1μl
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
模板	2μl
		去离子水	补足25μl

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃40s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，RAP1B基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

如图1所示，通过对比正常人血液及冠心病患者血液中RAP1B基因表达情况发现RAP1B基因表达明显升高(P<0.05)。

实施例4RAP1B蛋白的差异表达

1、研究对象同实施例1。

2、提取血液总蛋白

按照EpiQuik血液/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

3、Western blot检测

将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。

4、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将RAP1B蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，与正常个体血液相相比，冠心病血液中RAP1B蛋白的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5一种冠心病基因检测试剂盒

根据RAP1B基因表达与冠心病的相关性，可以通过检测RAP1B基因的表达情况来诊断冠心病是否发生，因此提供了一种基于检测RAP1B基因表达来诊断冠心病的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：包含SYBR Green PCR反应体系、扩增RAP1B基因和GAPDH基因的引物对。扩增RAP1B基因引物对：正向引物序列为SEQ ID NO：3所示，反向引物序列为SEQ ID NO：4所示；扩增GAPDH的引物对：正向引物序列为SEQ ID NO：5所示，反向引物序列为SEQ ID NO：6所示；SYBR Green PCR反应体系，包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：20mM KCl，2.5mMMgCl₂、200mM(NH4)₂SO₄。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.检测RAP1B基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RAP1B基因表达以诊断冠心病的产品；所述用RT-PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增RAP1B基因的引物；所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增RAP1B基因的引物；所述用免疫检测诊断冠心病的产品包括：与RAP1B蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断冠心病的产品包括：与RAP1B基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断冠心病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与RAP1B蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与RAP1B基因的核酸序列杂交的探针。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括的一对特异扩增RAP1B基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

4.一种诊断冠心病的工具，其特征在于，所述工具包括检测RAP1B基因表达的试剂；所述试剂包括检测RAP1B基因mRNA的引物和/或探针、检测RAP1B蛋白的抗体。

5.根据权利要求4所述的工具，其特征在于，所述检测RAP1B基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。