CN105861465A - 高效异源表达白圆弧青霉脂肪酶的毕赤酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效异源表达白圆弧青霉脂肪酶的毕赤酵母。本发明将包含自身前导肽(7个氨基酸)的白圆弧青霉脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌中异源表达，增加了外源蛋白脂肪酶的活性，改善了外源蛋白脂肪酶的部分酶学性质。本发明提供的产酶培养基通过优化BMMY培养基中YNB组分，降低培养基成本达70％。本发明为该酶的工业化应用，特别是在以雨生红球藻虾青素酯为底物，催化该底物水解产生虾青素单体中提供了可靠的实验依据。

Description

高效异源表达白圆弧青霉脂肪酶的毕赤酵母
本发明专利申请是分案申请，母案的名称为“高效异源表达白圆弧青霉脂肪酶的毕赤酵母及产酶培养基”，申请号为：201310296638X，申请日为：2013年7月16日。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一株高效异源表达一种脂肪酶的菌株，本发明还涉及一种高效异源表达该脂肪酶的方法，编码该脂肪酶的基因以及该酶的应用，以及一种脂肪酶异源表达培养基。
背景技术
脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。作为一种重要的工业用酶，脂肪酶可以催化水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应，因此其在食品、皮革、饲料、洗涤、医药、油脂化工等传统工业领域应用广泛。
脂肪酶的一个最显著的特点是它不同于多数水解酶的催化特性，它是一类非水相酶，其催化反应是在油水界面上进行，对于水溶性底物不起催化作用，具有反应条件温和、副产物少以及具有环境友好性等特点。不同来源的脂肪酶作用于底物甘油三酯的酯键位置不同。
虾青素又名虾黄素、虾黄质，是一种具有极强的生物抗氧化性的酮式类胡萝卜素，其广泛存在于虾、蟹、鱼、鸟、某些藻类及真菌等生物中。其抗氧化性能是天然维生素E的1000倍,番茄红素的10倍，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病作用，在水产养殖、医药、食品和化妆品等领域有着极其广阔的应用前景。我国、美国、欧盟、加拿大食品监察局等则已批准天然虾青素可作为水产动物的饲料添加剂。
虾青素除具有强抗氧化性，还能明显增强机体的免疫能力。动物实验表明，虾青素能防治动物疾病，对其正常生长、健康养殖、提高存活率及繁殖率具有重要的作用。虾青素作为饲料添加剂饲喂猪，可增加公猪的***体积，提高猪仔的体重和存活率。雨生红球藻粉中的酯化虾青素可预防和治疗马的肌肉机能障碍、奶牛的乳腺炎和幽门螺杆菌引起的胃肠管道炎症。在家禽饲料中添加虾青素，能提高母鸡的产蛋率、促进蛋鸡的健康、降低雏鸡死亡率的50％，并减少弧菌对鸡蛋的感染等。此外，虾青素是类胡萝卜素合成的终点，进入动物体内后可以不经修饰或生化转化而直接贮存在组织中，具有极强的色素沉积能力，能使一些水生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，使禽蛋及禽的羽毛、皮肤、脚、项均呈现健康的金黄色或红色。虾青素常作为着色剂应用于马哈鱼、鲑鱼、虹鳟鱼和虾的养殖中，在改善水产动物色泽的同时，增加其营养价值和风味，提高水产品的价值。
虾青素分为人工合成品及天然虾青素两种。化学合成生产虾青素工艺成熟，并已实现了产业化。但化学合成虾青素工艺复杂、反应条件难控制、生产成本高且安全性受到质疑，美国FDA已禁止化学合成虾青素进入保健食品市场。生物合成的天然虾青素具有安全、无毒、生物活性高等优点。生物法可分为从水产品副产物(虾、蟹的壳等)提取和微生物天然合成两种。水产品提取法存在原料不稳定、来源受限、虾青素含量低等局限，不能满足产业化的需求。微生物天然合成法常采用雨生红球藻或法夫酵母进行合成。目前国内外多采用雨生红球藻大规模生产天然虾青素，雨生红球藻藻粉也已被美国和加拿大等批准作为水产动物和家禽的着色剂和营养源。虽已实现了产业化生产，但雨生红球藻中虾青素大多数以虾青素酯的形式存在，组分复杂，纯化和检测困难。
虽然美国和日本的国标已经选择了脂肪酶催化水解的方法。但在工业规模上，实现应用脂肪酶催化水解虾青素酯，成功制备游离态虾青素产品未见报道。对应用脂肪水解酶催化水解虾青素酯技术的研发具有客观的需求和迫切性。本实验室前期筛选到一种来源于白圆弧青霉的碱性脂肪酶，其催化水解虾青素酯特异性强，可以用于制备虾青素单体。
虽然在前期研究证明该酶具有特异性并已尝试应用到制备虾青素单体的工艺中，但由于产酶菌株培养基昂贵，酶活水平较低，导致该酶成本过高，限制了其工业化应用。因此建立高效分泌表达体系，提高酶活水平，优化培养基配方，降低成本是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高效异源表达白圆弧青霉脂肪酶的巴斯德毕赤酵母；
本发明的第二个目的在于提供利用上述重组菌生产白圆弧青霉脂肪酶的方法；
本发明的第三个目的在于提供一种表达该脂肪酶的优化培养基。
本发明的第四个目的在于提供了上述脂肪酶的用途。
本发明从白圆弧青霉(Penicillium cyclopium var.albus)菌株中克隆得到包含前导肽的碱性脂肪酶基因pro-alip，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为795bp，分析表明，GC含量为47.9％，编码264个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的白圆弧青霉脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小28kDa,等电点预测为6.16(http://web.expasy.org/compute_pi/)，活性中心是132位Ser，188位Asp，241位His。实验表明由该基因编码的脂肪酶具有较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH值为7.5，在pH 7～8.5条件下稳定。为便于表述，将该脂肪酶命名为Pro-ALIP。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的含自身前导肽的白圆弧青霉脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第(25)位的(Ser)替换为(Ala)。因此，本发明含前导肽的白圆弧青霉脂肪酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Pro-ALIP同等活性的由Pro-ALIP衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。
此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明含前导肽的白圆弧青霉脂肪酶基因还包括由SEQ IDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Pro-ALIP的核苷酸序列。
将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明Pro-ALIP的基因工程菌。
在本发明实例中，通过将含前导肽的脂肪酶基因pro-alip***到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA上构建得到重组表达载体pPICZαA-pro-alip，其质粒构建图谱如附图2所示。进一步，将重组表达载体电转进入巴斯德毕赤酵母X-33中并筛选获得能够高效表达Pro-ALIP的基因工程菌，将该菌株命名为X33-YZ1。
本发明还提供一种制备上述Pro-ALIP的方法，其是通过培养上述重组毕赤酵母基因工程菌，经诱导表达获得脂肪酶Pro-ALIP。采用摇瓶培养条件为24℃，初始pH为8.0，每12小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为0.5％，200rpm培养120～190h。采用该方法，摇瓶培养164h，以橄榄油为底物，酶活力为1550U/mL。
本发明还提供用于上述基因工程菌培养的产酶培养基，其包括以下成分：酵母提取物8～12g/L、蛋白胨15～25g/L、NaH2PO4·2H2O5.7～7.7g/L、Na2HPO4·12H2O 19.66～21.66g/L、甲醇8～12mL/L、KH2PO4 0.75～0.95g/L、K2HPO4 0.12～0.18g/L、NaCl0.08～0.12g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L。优选包括以下成分：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、NaH2PO4·2H2O 6.7g/L、Na2HPO4·12H2O 20.66g/L、甲醇10mL/L、KH2PO4 0.85g/L、K2HPO4 0.15g/L、NaCl 0.1g/L、CaCl2 0.1g/L、MgSO4 0.5g/L。
本发明运用了分子生物学技术，引入白圆弧青霉脂肪酶自身前导肽(7个氨基酸)，并在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌中异源表达，增加了外源蛋白脂肪酶的活性，改善了外源蛋白脂肪酶的部分酶学性质。实验表明，自身前导肽的引入大幅增加了白圆弧青霉脂肪酶的分泌量，拓宽了白圆弧青霉脂肪酶Pro-ALIP的催化反应温度范围，且提高了其催化水解虾青素酯的活性。本发明提供在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中构建表达该酶的重组菌株和高效分泌表达的方法。采用该方法，表达含自身前导肽的白圆弧青霉脂肪酶能有效地分泌到胞外，不仅降低了分离纯化成本，而且表达效率提高。实验表明：在摇瓶发酵条件下，以甲醇为诱导物进行诱导，以橄榄油为底物检测酶活力，酶活力达到1550U/mL。本发明还提供了其在发酵中使用的优化BMMY培养基。通过优化BMMY培养基中YNB组分，降低培养基成本达70％。本发明为该酶的工业化应用，特别是在以雨生红球藻虾青素酯为底物，催化该底物水解产生虾青素单体中提供了可靠的实验依据。
附图说明
图1目的基因DNA酶切回收电泳图，泳道1为DNA标准分子量(kb)：4.5,3.0,2.0,1.2,0.8,0.5 0.2；泳道2：目的基因DNA酶切回收795bp片段(箭头所指)；
图2重组表达载体构建流程图；
图3重组表达载体酶切电泳图，泳道1为重组表达载体电泳，泳道2为重组表达载体双酶切验证，泳道3、4为重组表达载体单酶切验证，泳道M为DNA Marker III(kb)：4.5,3.0,2.0,1.2,0.8,0.5,0.2；
图4重组巴斯德毕赤酵母X33-YZ1菌株，摇瓶培养胞外酶活及细胞密度OD600检测；
图5为HPLC检测雨生红球藻来源的虾青素酯的水解，其中，A：水解前；B：水解0.5h；C：水解1h；箭头：虾青素单体峰；
图6虾青素单体的HPLC-MS/MS鉴定。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100mL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。
实施例1白圆弧青霉cDNA的制备
1.1白圆弧青霉总RNA的提取
(1)取适量的白圆弧青霉菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入1mLTrizol试剂(Invitrogen)，振荡器振荡1min，室温静置5min；
(2)加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置3～5min；
(3)4℃，12000rpm，15min；
(4)吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min；
(5)4℃，12000rpm，15min；
(6)倒掉上清，用1mL 75％DEPC-乙醇洗涤沉淀，12000rpm，4℃，5min；
(7)重复(6)步骤一次；
(8)倒掉上清，12000rpm、4℃离心2min。用枪头将残液吸取干净，冰中敞盖干燥10min；干燥10min；
(9)加入适量的DEPC水溶解，得到总RNA。
1.2白圆弧青霉cDNA的制备
反转录采用由Promega公司生产的反转录酶(MMLV)具体操作如下：
(1)RNA用前70℃解链，5min，立即放冰上2min；
(2)25μL反转录体系：
(3)95℃加热5min终止反应，冷冻保存。
实施例2含前导肽的白圆弧青霉脂肪酶基因pro-alip的引物设计
2.1引物设计
根据GenBank中alip基因的序列(GenBank登录号为AF274320.1)，设计合成了以下一对引物：
pro-alip-F(P1)：5’-CCCGGAATTCGCACCTATTTTGGAGTCGA-3’
pro-alip-R(P2)：5’-ATAATGCGGCCGCGCTCAGATAGCCAC-3’
P1、P2两端分别设计有EcoR I和Not I酶切位点(见上述序列中斜体并有下划线的部分)
2.2含前导肽的白圆弧青霉脂肪酶pro-alip的PCR扩增
采用P1、P2引物，以白圆弧青霉(Zhang H M,Wu M C,Guo J,et al.Cloning and Sequence Analysis of Complete Gene Encodingan Alkaline Lipase from Penicillium cyclopium.AppliedBiochemistry and Microbiology.2011,47(6):586-593.)cDNA为模板，PCR反应体系为：
反应条件为：95℃5min；95℃40s，54℃40s，72℃1min 30s，循环35次；72℃10min；4℃10min。
2.3从PCR反应产物中回收目的片段
从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA，目的基因长度为795bp(图1)，按照DNA回收试剂盒说明书(购自天根公司，产品编号为DP209-02)的方法进行回收。
2.4TA克隆
将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。
2.5目的基因连接到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA(Invitrogen公司购买)
用限制性内切酶EcoR I和Not I分别对pMD18-T-pro-alip和pPICZα A进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pPICZα A-pro-alip，构建流程图见附图2。
表达载体pPICZα A-pro-alip的检测结果见附图3，结果表明外源片段(795bp)和载体(3.5kb)大小均正确。将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)。
实施例3含前导肽的白圆弧青霉脂肪酶基因pro-alip在巴斯德毕赤酵母X-33中的分泌表达
3.1巴斯德毕赤酵母X-33(Invitrogen公司购买)电转化感受态细胞的制备及其电击转化
(1)挑取新鲜的单菌落于5mL YPD液体培养基中，于28℃，200rpm培养12～14h；
(2)以0.1％的接种量接种到含500mL YPD培养基的2L三角瓶中，于28℃，200rpm培养12～14h，使其OD600＝1.3～1.5；
(3)在4℃下12000rpm离心5min，收集细胞；
(4)用500～250mL冰预冷的无菌水洗涤细胞两次；
(5)用20mL冰预冷的1M山梨醇溶液洗涤细胞一次；
(6)用1mL冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，至终体积为1.5mL左右，以80μL分装于小离心管。
3.2巴斯德毕赤酵母细胞的电击转化
(1)将10μg线性化的重组质粒与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，冰上放置5min；
(2)把混合了DNA的感受态细胞转入冰预冷的0.2cm的电转杯；在1.5千伏的电压下转化；
(3)然后马上加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液于经转化的细胞中，把细胞混匀，转入1.5mL小离心管,30℃静置1～2h；
(4)取50～200μL涂布于含有100μg/mL YPDS平板(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，山梨糖醇1M，琼脂2％)，于30℃培养2至3天观察结果。
3.3含pro-alip基因的重组菌株(X33-YZ1)的筛选
3.3.1酵母菌落PCR法鉴定正确整合的转化子
在平板上选到阳性菌落，以5’AOX1、3’AOX1为引物，利用酵母菌落PCR的方法进一步验证得到正确整合的转化子。
引物序列为：5’AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’
3’AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
模板的处理方法：
(1)用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μL的D2-Buffer(1L：异硫氰酸胍472.64g，1mol/L pH 8.0Tris·HCl缓冲液50mL，β-巯基乙醇7mL)中混匀；
(2)将混合液于100℃沸水浴5min；
(3)12000rpm，离心30s，弃上清；
(4)用无菌水洗涤沉淀2次；
(5)将沉淀溶于20μL的ddH2O，95℃作用5min；
(6)离心后得到上清液即为模板。
PCR反应体系：
反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃2min 10s，30个循环；72℃10min。
3.4巴斯德毕赤酵母(X33-YZ1)中目的脂肪酶的表达
3.4.1NaOH滴定法测定脂肪酶酶活
(1)0.05M NaOH的配置：先用无CO2水配置5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80mL无CO2水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M的NaOH溶液以无CO2水用储液现用现配；
(2)PVA-橄榄油乳化液底物的配置：将橄榄油100mL，300mL 2％PVA-1750(聚乙烯醇)混合，加热溶化，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇5s，99次，循环2次；
(3)取5mL乳化液底物，4mL 0.1M pH 7.5的HEPES缓冲液加入到150mL三角瓶中，置于恒温水浴摇床35℃，150rpm温育10min；(4)取1mL适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，35℃150rpm反应10min后加入15mL无水乙醇终止反应；
(5)滴加5滴酚酞作指示剂，用0.05M NaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止。
空白操作与上述一致，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到底物和缓冲液中。
酶活定义为在该测定条件下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活力单位。
3.4.2摇瓶发酵产酶
挑取毕赤酵母重组子(X33-YZ1)单菌落，接种于25mL BMGY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油，pH 6.5)，于28℃，200rpm摇床培养16～20h至OD600为6.0左右，按10％接种量转接到装有50mL优化BMMY培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、NaH2PO4·2H2O6.7g/L、Na2HPO4·12H2O 20.66g/L、甲醇10mL/L、KH2PO4 0.85g/L、K2HPO4 0.15g/L、NaCl 0.1g/L、CaCl2 0.1g/L、MgSO4 0.5g/L，pH 8.0)的500mL三角瓶中，24℃继续培养，每12小时补加100％甲醇于培养基至其终浓度为0.5％，诱导表达120～190h。每隔一定的时间取样，测定脂肪酶酶活及细胞密度OD600。当酶活不再升高或者开始降低时停止发酵。
检测结果如附图4所示，在优化BMMY培养基中(初始pH为8.0，培养温度为24℃)摇瓶培养164h，毕赤酵母重组子酶活最高达到1550U/mL。
使用上述脂肪酶进行虾青素酯的催化水解，以下提供一个催化水解虾青素酯的实例：
虾青素酯底物浓度为200μg/mL，按照每微克虾青素酯底物加入80U酶，在0.05M磷酸盐缓冲液中，30℃振荡反应1h，HPLC检测虾青素单体得率为80％，虾青素酯转化率可达96％以上。
利用HPLC分析虾青素酯水解反应前后物质变化。Pro-ALIP脂肪酶催化水解虾青素酯效果极佳，反应0.5h后，虾青素酯仅剩10％左右，而反应1h后，虾青素酯几乎完全水解，含量低于3％。
对反应后样品进行HPLC和HPLC-MS检测。反应后，主要的产物的最大吸收峰(图5B和C箭头所示)为477nm，反应样品有分子量为597.5的主峰(图6箭头所示)，是游离的虾青素单体。

Claims (10)

1.含自身前导肽的白圆弧青霉脂肪酶Pro-ALIP，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述白圆弧青霉脂肪酶Pro-ALIP的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.如权利要求4所述的重组载体，其为pPICZαA-pro-alip。
6.权利要求4或5所述重组载体转化的宿主细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其为巴斯德毕赤酵母X-33。
8.权利要求1所述含自身前导肽的白圆弧青霉脂肪酶Pro-ALIP在催化水解虾青素酯制备虾青素单体中的应用。
9.用于权利要求6或7所述宿主细胞培养的产酶培养基，其包括以下成分：酵母提取物8～12g/L、蛋白胨15～25g/L、NaH2PO4·2H2O5.7～7.7g/L、Na2HPO4·12H2O 19.66～21.66g/L、甲醇8～12mL/L、KH2PO4 0.75～0.95g/L、K2HPO4 0.12～0.18g/L、NaCl0.08～0.12g/L、CaCl2 0.08～0.12g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L。
10.根据权利要求9所述的产酶培养基，其包括以下成分：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、NaH2PO4·2H2O 6.7g/L、Na2HPO4·12H2O20.66g/L、甲醇10mL/L、KH2PO4 0.85g/L、K2HPO4 0.15g/L、NaCl0.1g/L、CaCl2 0.1g/L、MgSO4 0.5g/L。
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