CN105859705B - 一种荧光标记探针及其制备方法及对蛋白的标记应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光探针及其制备方法及对蛋白质的标记应用。采用有机合成的方法，直接在罗丹明B骨架结构的底环上引入具有荧光性质的、多个杂原子的噁二唑杂环。引入的噁二唑杂环，既作为第二荧光团拓展罗丹明类荧光探针的光谱性质，又通过引入多个杂原子增加形成氢键的位点,利于与蛋白质中的氨基酸作用。在化合物RH‑MCl中，噁二唑环一侧由罗丹明B取代，另一侧由氯甲基取代。本发明还提供了应用该荧光探针进行蛋白质凝胶电泳荧光标记的方法。化合物RH‑MCl具有良好的水溶性，其对蛋白质的荧光标记方法简单，用时少,敏感性高，重现性好、标记背景好、兼容性好、使用安全、成本低等优点。

Description

一种荧光标记探针及其制备方法及对蛋白的标记应用
本发明是在天津市应用基础与前沿技术研究计划（合同编号：14JCYBJC23900）的资助下进行的。
技术领域
本发明涉及一种荧光标记探针的制备及蛋白质荧光标记方法，属于化学生物学领域。
背景技术
荧光探针在分子生物学、微生物学、生物化学、分析化学、化工和医药工业等领域也有着广泛地应用。同时它的发展与生物技术、环境科学、诊断医学等学科紧密相关。随着化学、物理学和生物技术等相关学科的发展与进步，诞生了越来越多的与荧光探针相关的技术，这些技术极大的拓展了荧光探针的应用范围和研究深度，使得荧光探针日益成为现代新技术领域强有力研究手段。这些新研究手段的日益多样化也对荧光分子探针的种类提出了更高的要求。
在生命科学研究领域中，离不开对生命的基本物质蛋白质的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术，尤其是近些年，随着蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的检测技术有了更高的要求。凝胶电泳是分析复杂蛋白质混合物、分析某一蛋白质相对含量、检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子量的生化分析方法。在电泳***中，条带染色是一个重要的步骤。目前电泳后蛋白质染色的方法主要有考马斯亮蓝、银染、负染法等。但是对蛋白质进行荧光标记的报道还不多见。开发操作方便、费用低廉、较高灵敏度的荧光探针用于蛋白质的标记具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有分子式I的荧光探针及其制备方法。
本发明的第二个目的是利用该荧光探针对蛋白质凝胶电泳进行荧光标记的方法，该方法具有操作方法简单，用时少，费用低，便于观察、检测等优点。
本发明的第三个目的是公开了氯甲基噁二唑罗丹明化合物在蛋白质荧光标记方面的应用。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
具有结构式I的氯甲基罗丹明噁二唑（简称RH-MCl），化学名称为 2-氯甲基-5-[罗丹明B-9'-(2''-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑；
本发明公开了氯甲基噁二唑罗丹明荧光探针的制备方法：
（1）罗丹明酰肼的制备：
取无水乙醇（100ml）置于250ml的烧瓶中，将罗丹明B（5g, 10.4mmol）溶解于乙醇。然后将80%水合肼（8ml, 133mmol）在室温条件下缓慢滴加于混合体系中。滴加完毕后将混合物加热回流。当溶液由暗紫色逐渐变为澄清，TLC监测，反应完毕冷却至室温，减压除去部分溶剂、倒入冰水中，有沉淀产生，抽滤，得到暗黄色固体。
（2）氯甲基噁二唑罗丹明的制备：
将氯乙酸0.76g(0.1g,1.1mmol)和三氯氧磷( 5 ml)混合，加热回流0.5-1小时，之后，分批加入罗丹明B酰肼(0.5g,1.1mmol)，TLC监测，待反应完成后将其冷却，加入少量二氯甲烷到室温并倒入冰水混合物中，调节pH为8，以二氯甲烷萃取粗产物至无机层溶液颜色比有机层溶液颜色深时为止，合并有机层，以5ml×2饱和食盐水洗涤，分离有机相。用无水硫酸镁干燥并静置过夜，滤出干燥剂，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗品用二氯甲烷/甲醇=20:1，柱色谱分离，得到目标化合物RH-MCl。
本发明进一步公开了氯甲基噁二唑罗丹明做为荧光探针对蛋白质进行荧光标记的应用。其中蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记方法:
（1）称取0.055gRH-MCl溶于100ml体积比为2%的醋酸溶液中，配制成浓度为1000uM的探针母液，将该母液用2%的醋酸溶液稀释成浓度分别为5uM、10uM、20uM、40uM的探针溶液。
（2）按照常用方法进行SDS-PAGE蛋白质样品凝胶电泳，蛋白质标准品PremixedProtein Marker (Low)购自Takara公司。
（3）取4块固定后的蛋白质样品凝胶分别置于荧光探针浓度为5uM、10 uM、20 uM、40uM的溶液中标记20min，在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤2hr，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm。拍照（图5）。经软件Gel-pro Analyzer 分析得出最佳探针标记浓度（图6）。
（4）另取4块固定后的蛋白质样品凝胶置于荧光探针浓度为20uM的溶液中，分别标记5min、10 min、20 min、40min，在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤2hr，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm。拍照（图7）。经软件Gel-pro Analyzer 分析得出探针最佳标记时间（图8）。
（5）再另取4块固定后的蛋白质样品凝胶置于探针为20uM的溶液中，标记20min后，分别在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤1hr、2hr、3hr、4hr后，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm。拍照（图9）。经软件Gel-pro Analyzer 分析得出探针最佳洗涤时间（图10）。
上述步骤（2）所述常用SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳的方法如下：
① 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用双蒸水冲洗数次，乙醇擦拭，晾干；在两块玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；
② 向玻璃板间灌制分离胶溶液，立即覆一层双蒸水，静置30 min使分离胶溶液聚合，然后将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶溶液，***样品梳，静置30 min使浓缩胶溶液聚合；
③ 安装电泳***，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，在聚合后的凝胶泳道中加入蛋白质样品，将电泳仪电压调至100V，开始电泳，当溴酚蓝指示剂迁移至分离胶底部时，关闭电源停止电泳；
④ 卸下胶板，取出蛋白质样品凝胶，用双蒸水浸泡洗涤3min，置于固定液中固定5min，再用双蒸水冲洗3min；备用。
所用试剂配制方法如下：
① 5x样品缓冲液的配制：分别取1mol/L的Tris-HCl(pH6.8) 0.6ml、50%甘油5ml、10%的SDS 2ml、巯基乙醇0.5ml、1%溴酚蓝1ml、双蒸水0.9ml、制成5x样品缓冲液10ml，4℃或-20℃冰箱中保存。
② 分离胶溶液的配制：分别取双蒸水1.6ml、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（29：1）30%原液2.0ml、1.5M Tris-HCl（pH8.8）缓冲液1.3ml、10% SDS 50ul、10% 过硫酸铵50ul、TEMED 2ul，配制成12%的分离胶溶液5ml。
③ 浓缩胶溶液的配制：分别取双蒸水1.4ml、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（29：1）30%原液0.33ml、1M Tris-HCl（pH6.8）0.26ml、10% SDS 20ul、10%过硫酸铵20ul、四乙基乙二胺（TEMED） 2ul，配制成5%的浓缩胶溶液2ml。
④ Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH8.3）的配制：分别秤取Tris 6.0g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。4℃保存，临用前稀释10倍。
⑤ 固定液是含有40%乙醇和10%乙酸的水溶液。
以上方法中所涉及的紫外凝胶成像仪为北京六一生物科技有限公司生产，型号WD-9413B。
检测的结果说明：
（1）用RH-MCl对蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记的最佳探针浓度为20uM；由图5、图6说明。
（2）用RH-MCl对蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记的条带OD值随标记时间的延长而增大,最佳标记时间范围为20-40min；图7、图8说明。
（3）用RH-MCl对蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记后，采用双蒸水对蛋白质样品凝胶浸泡洗涤2小时即可取得实验结果。图9、图10说明。
本发明公开的荧光标记探针及其制备方法及对蛋白质的荧光标记方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）优化了罗丹明B类荧光染料性能，新型荧光探针引入噁唑杂环，使罗丹明探针骨架具有双荧光团的同时引入N、O杂原子，提供氢键位点，改进探针荧光量子产率及水溶解性；引入苄位氯原子，使探针利于与蛋白质中的氨基酸作用。
（2）新型RH-MCl荧光探针敏感性强，效率高，较短时间内可使SDS-PAGE蛋白质电泳条带清晰易于检测。与罗丹明B、FITC及其他方法比较，所需探针浓度低，耗时少，标记效果好。
附图说明：
图1、RH-MCl的核磁氢谱；
图2、RH-MCl的核磁碳谱；
图3、RH-MCl的飞行时间质谱；
图4、RH-MCl（浓度为20uM）的荧光光谱；
图5、不同RH-MCl浓度标记后蛋白质凝胶成像（a：5uM，b：10uM，c：20uM，d：40uM）；
图6、不同RH-MCl浓度对OD值的影响；
图7、不同标记时间蛋白质凝胶成像（a：5min，b：10min，c：20min，d：40min）；
图8、不同标记时间对OD值的影响；
图9、不同洗涤时间蛋白质凝胶成像（a：1hr，b：2hr，c：3hr，d：4hr）；
图10、不同洗涤时间对OD值的影响；
图11、不同探针（染料）标记后蛋白质凝胶成像（a：RH-MCl，b：罗丹明B，c：FITC，d：考马斯亮蓝）；
图12、自提纯WspR蛋白质的凝胶成像。
图13、氯甲基罗丹明噁二唑的结构式。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围，其中的氯乙酸、三氯氧磷、罗丹明B、以及SDS-PAGE蛋白质凝胶中所用试剂均为市售。
实施例1
荧光探针氯甲基噁二唑罗丹明化合物RH-MCl荧光探针的合成：
（1）罗丹明酰肼的制备：
取无水乙醇（100ml）置于250ml的烧瓶中，将罗丹明B（5g, 10.4mmol）溶解于乙醇。然后将80%水合肼（8ml, 133mmol）在室温条件下缓慢滴加于混合体系中。滴加完毕后将混合物加热回流。当溶液由暗紫色逐渐变为澄清，TLC监测，反应完毕冷却至室温，减压除去部分溶剂、倒入冰水中，有沉淀产生，抽滤，得到暗黄色固体。
（2）氯甲基噁二唑罗丹明的制备：
将氯乙酸0.76g(0.1g,1.1mmol)和三氯氧磷( 5 ml)混合，加热回流0.5-1小时，之后，分批加入罗丹明B酰肼(0.5g,1.1mmol)，TLC监测，待反应完成后将其冷却，加入少量二氯甲烷到室温并倒入冰水混合物中，调节pH为8，以二氯甲烷萃取粗产物至无机层溶液颜色比有机层溶液颜色深时为止，合并有机层，以5ml×2饱和食盐水洗涤，分离有机相。用无水硫酸镁干燥并静置过夜，滤出干燥剂，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗品用二氯甲烷/甲醇=20:1，柱色谱分离，得到目标化合物RH-MCl。熔点：228-230℃；结构确定见图1、RH-MCl的核磁氢谱；图2、RH-MCl的核磁碳谱。
实施例2
选用几种常用的蛋白质荧光探针及染料，如：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明B、考马斯亮蓝，配制成与RH-MCl相同浓度（20uM）的溶液，按照上述的蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记方法，将固定后的Premixed Protein Marker (Low)蛋白质凝胶分别置于20uM的RH-MCl、FITC、罗丹明B、考马斯亮蓝溶液中标记（或染色）20min，在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤2hr（考马斯亮蓝采用脱色夜洗涤），取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm，考马斯亮蓝的检测波长为可见光。拍照（图11）。
所用溶液配置如下：
①考马斯亮蓝G250染色液：称取考马斯亮蓝G250 100mg，溶于200ml双蒸水中，慢慢加入70%的过氯酸7.5ml，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
②脱色液：量取冰乙酸75mL，双蒸水875mL与甲醇50mL混匀。
③FITC探针溶液：秤取FITC 50mg,加4ml双蒸水，配制成32mM的母液，用双蒸水稀释至20uM。
④罗丹明B探针溶液：称取2.395g罗丹明B，加5ml双蒸水使其溶解，配制成1mM母液，用双蒸水稀释至20uM。
检测结果说明：
蛋白质marker经SDS-PAGE 凝胶电泳，由FITC荧光探针标记后，条带隐约可见；由考马斯亮蓝G-250染色后，背景着色较深，条带不清晰；由罗丹明B标记后，荧光强度低于RH-MCl。由此可知，在探针（或染料）浓度相同、染色时间相同、洗涤时间相同的条件下，本发明所涉及的RH-MCl荧光探针对Premixed Protein Marker (Low)蛋白质凝胶的标记效果优于其它三种荧光探针（或染料）。图11说明。
实施例3
将RH-MCl探针用于自提纯的WspR蛋白质定性检测。
（1）100ml含重组表达质粒的铜绿假单胞菌诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
（2）重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，用0.45微米滤膜抽滤后作为样品液。
（3）将样品液进行镍柱纯化，得到自提纯的WspR蛋白质。
（4）将纯化好的WspR蛋白质按照上述的蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记方法进行操作，置于20uM的RH-MCl中标记20min，在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤2hr，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm。拍照（图12）。
检测结果说明：
WspR 蛋白（铜绿假单胞菌诱导表达）上样量10ul,经SDS-PAGE 凝胶电泳，与蛋白marker比对，该蛋白分子量在40KD左右，与实际分子量相符；同时蛋白条带荧光强度很强,说明该蛋白诱导表达量很高。图12说明。

Claims (4)

1.荧光探针氯甲基噁二唑罗丹明化合物RH-MCl
。
2.权利要求1所述荧光探针氯甲基噁二唑罗丹明化合物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
荧光探针的合成：
（1）罗丹明酰肼的制备：取无水乙醇置于烧瓶中，将罗丹明B 10.4mmol溶解于乙醇，然后将80%水合肼133mmol在室温条件下缓慢滴加于混合体系中，滴加完毕后将混合物加热回流，TLC监测，反应完毕冷却至室温，减压除去部分溶剂、倒入冰水中，有沉淀产生，抽滤，得暗黄色固体；
（2）氯甲基噁二唑罗丹明的制备：将氯乙酸1.1mmol和三氯氧磷5 ml混合，加热回流0.5-1小时，之后，分批加入罗丹明B酰肼1.1mmol，TLC监测，待反应完成后将其冷却，加入少量二氯甲烷到室温并倒入冰水混合物中，调节pH为8，以二氯甲烷萃取粗产物至无机层溶液颜色比有机层溶液颜色深时为止，合并有机层，以5ml×2饱和食盐水洗涤，分离有机相，用无水硫酸镁干燥并静置过夜，滤出干燥剂，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗品用二氯甲烷/甲醇的体积比20:1,柱色谱分离，得到目标化合物RH-MCl。
3.权利要求1所述氯甲基噁二唑罗丹明化合物在制备蛋白质荧光探针方面的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中荧光探针对蛋白质荧光标记的方法如下：
蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳标记方法:
①称取0.055gRH-MCl溶于100ml体积比为2%的醋酸溶液中，配制成浓度为1000uM的探针母液，将该母液用2%的醋酸溶液稀释成浓度分别为5uM、10uM、20uM、40uM的探针溶液；
②按照常规方法进行SDS-PAGE蛋白质样品凝胶电泳，蛋白质样品采用市售PremixedProtein Marker(Low)标准品；
③取4块固定后的蛋白质样品凝胶分别置于荧光探针浓度为5uM、10 uM、20 uM、40uM的溶液中标记20min，在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤2hr，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm；
经软件Gel-pro Analyzer分析得出最佳探针标记浓度；
④另取4块固定后的蛋白质样品凝胶置于荧光探针浓度为20uM的溶液中，分别标记5min、10 min、20 min、40min，在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤2hr，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm；
经软件Gel-pro Analyzer分析得出探针最佳标记时间；
⑤再另取4块固定后的蛋白质样品凝胶置于探针为20uM的溶液中，标记20min后，分别在80 rpm脱色摇床上用去离子水洗涤1hr、2hr、3hr、4hr后，取出凝胶在紫外凝胶成像仪下检测，检测波长为302nm，经软件Gel-pro Analyzer分析得出探针最佳洗涤时间。
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