CN105853455A - 一种乙酰化褐藻多糖的应用及制备方法 - Google Patents

一种乙酰化褐藻多糖的应用及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乙酰褐藻多糖的应用，所述乙酰褐藻多糖应用在广谱抗病毒制剂方面。本发明乙酰化褐藻多糖具有优异的广谱抗病毒效果，尤其对于禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒等具有很好的抗病毒效果。本发明还公开了两种乙酰褐藻多糖的制备方法，能够制备高浓度、高纯度的乙酰褐藻多糖。

Description

一种乙酰化褐藻多糖的应用及制备方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种乙酰化褐藻多糖的应用及制备方法。
背景技术
褐藻多糖主要来自于海带、裙带菜、巨藻、马尾藻、泡叶藻、墨角藻等褐藻。已有研究表明，褐藻多糖具有多种生物活性，如免疫调节、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒等。然而，未经酰化修饰的褐藻多糖分子脂溶性差，不利于分子在机体内透过半透膜屏障而被吸收，因此通过化学修饰改善褐藻多糖的脂溶性，提高其抗病毒活性，则有望开发出抗病毒活性更好的多糖类药物。研究表明，在众多酰化基团中，乙酰化修饰是比较好的衍生化方法，乙酰化多糖可表现出更好的生物活性。
然而，现有的乙酰化多糖存在浓度低、纯度不高、乙酰化程度低的缺点，影响其在生物、医学方面的应用。
另一方面，随着我国养殖业的飞速发展，特别是近年来集约化养殖业发展很快，目前，畜禽疾病防治也面临很多问题。病毒性疾病是目前尚无特效药物和治疗方法的“疑难杂症”。目前针对病毒性传染疾病主要采取的措施是注射疫苗、运用化学合成类抗病毒药物等治疗方法。这两种方法都存在一定的缺陷，疫苗注射只是针对于某一种病毒有效，不具有广谱性，而运用化学合成类抗病毒药物进行治疗也具有一定的局限性，它们可以抑制普通的病毒，但对有些特殊病毒的抗性却不够理想，而且长期使用会产生耐药性。近年来，以天然原料为来源的多糖类抗病毒药物研究取得了一定进展，然而，采用乙酰化褐藻多糖进行畜禽病毒方面的研究还未见报道。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种乙酰化褐藻多糖的应用及制备方法，以相转移催化酰化、离子交换-酰化方法对褐藻多糖进行乙酰化，制备成乙酰化褐藻多糖，可以应用在新型广谱抗病毒制剂方面。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种乙酰化褐藻多糖的应用，所述乙酰化褐藻多糖应用在广谱抗病毒制剂方面。
优选的，所述乙酰褐藻多糖应用在禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的抗病毒制剂方面。
所述乙酰褐藻多糖是从褐藻中提取的多糖；所述多糖的聚合度为4-1000。
所述乙酰褐藻多糖以相转移催化酰化、离子交换-酰化方法从褐藻中制备。
所述相转移催化酰化方法步骤如下：称取褐藻多糖溶于三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶中，制成褐藻多糖溶液；褐藻多糖溶液中加入相转移催化剂，并滴加乙酸酐，室温反应；反应结束后，调节溶液pH至中性或弱碱性，去除三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶；透析、浓缩、冻干，得到相转移催化乙酰化褐藻多糖。
所述相转移催化剂是18-冠醚-6或四丁基溴化铵。
所述离子交换-转型酰化方法步骤如下：用四丁基溴化铵溶液搅拌浸泡Na型732阳离子树脂，蒸馏水清洗树脂至中性后装入交换柱；将褐藻多糖水溶液通过离子交换柱与树脂进行交换，树脂处理褐藻多糖溶液；真空浓缩离子交换所得的褐藻多糖溶液，冻干得四丁基铵型褐藻多糖干粉；将冻干得到的四丁基铵型褐藻多糖干粉溶于三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶中，制成褐藻多糖溶液；在褐藻多糖溶液中滴加乙酸酐，室温反应；反应结束后，调节溶液pH至中性或弱碱性，真空浓缩除去三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶；用蒸馏水将酰化的褐藻多糖配制成水溶液，与H型离子树脂反交换；将反交换完的溶液真空浓缩后移入透析袋透析，透析液经真空浓缩、冻干得离子交换-乙酰化褐藻多糖。
具体的，所述的乙酰化褐藻多糖的相转移催化酰化方法，步骤是：称取褐藻多糖溶于三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶中，搅拌均匀制成质量浓度为0.1-2％的褐藻多糖溶液；溶液中加入0.1-2.0％最终体积的18-冠醚-6或四丁基溴化铵作为相转移催化剂，在溶液中滴加最终体积浓度为0.1-10％乙酸酐，室温反应4-30h。反应结束后，用1-6％NaHCO3调节溶液的pH至中性或弱碱性，真空浓缩除去三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶。将浓缩液用自来水透析1-3天，透析液经真空浓缩、冻干，得相转移催化酰化褐藻多糖样品。
具体的，所述的乙酰化褐藻多糖的离子交换-转型酰化方法，步骤是：用浓度为0.5-3mol/L的四丁基溴化铵溶液搅拌浸泡Na型732阳离子树脂，持续2-6h，蒸馏水清洗树脂至中性后装入交换柱，保持柱内液面高度始终在树脂之上；将褐藻多糖配成0.5-3g/L的水溶液，然后通过离子交换柱与树脂进行交换，流出液速度控制在1-4ml/min，树脂的处理体积控制在每100ml树脂处理褐藻多糖溶液1L；真空浓缩离子交换所得的褐藻多糖溶液，冻干得四丁基铵型褐藻多糖干粉；将冻干得到的四丁基铵型褐藻多糖干粉溶于三乙基胺、吡啶或二甲氨基吡啶中，搅拌均匀制成质量浓度为0.1-2％的褐藻多糖溶液；在溶液中滴加最终体积浓度为0.1-10％乙酸酐，室温反应4-30h。反应结束后，用1-6％NaHCO3调节溶液的pH至中性或弱碱性，真空浓缩除去三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶；用蒸馏水将酰化的褐藻多糖配制成0.5-3g/L的水溶液，与H型离子树脂反交换，流速控制在0.5-3ml/min；将反交换完的溶液真空浓缩后移入透析袋，透析1-3天，透析液经真空浓缩、冻干得离子交换-乙酰化褐藻多糖样品。
乙酰基的引入对褐藻多糖的活性影响较大，因为它能改变多糖分子的定向性和横向次序，提高其脂溶性，其烷基部分与表面活性剂类似，可与病毒囊膜脂作用，破坏其囊膜，从而增强其抗病毒活性。因此本发明的乙酰化褐藻多糖具有优异的广谱抗病毒效果，尤其对于禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒等具有很好的抗病毒效果。
本发明通过相转移催化酰化法和离子交换-酰化法来制备乙酰褐藻多糖，对于相转移催化酰化法，以18-冠醚-6或四丁基溴化铵作为相转移催化剂，能够提高多糖的水溶性，便于乙酰化程度的增加。对于离子交换-酰化法，在乙酰化之前先对褐藻多糖溶液进行了离子交换处理，这样同样可以提高多糖的水溶性，提高乙酰化程度。本发明的制备方法能够得到高浓度、高纯度、乙酰化程度较高的乙酰褐藻多糖，对于乙酰褐藻多糖在抗病毒制剂方面的应用有较大的促进。
本发明中的乙酰褐藻多糖原料均来源于大型经济海藻，原料来源丰富，生产工艺简单，属于绿色环保产品，长期使用不存在对养殖动物的伤害作用。
附图说明
图1是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的红外图谱。
图2是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的血凝效价比较。
图3是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的H9N2相对表达量比较。
图4是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的传染性法氏囊病毒感染细胞活性比较。
图5是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的新城疫病毒感染细胞生长比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1，
乙酰化褐藻多糖的相转移催化酰化方法：
称取聚合度为10的褐藻多糖2g溶于吡啶中，搅拌均匀制成质量浓度为2％的褐藻多糖溶液；溶液中加入2.0％最终体积的18-冠醚-6或四丁基溴化铵作为相转移催化剂，在溶液中滴加最终体积浓度为10％乙酸酐，室温反应20h。反应结束后，用6％NaHCO3调节溶液的pH至中性或弱碱性，真空浓缩除去吡啶。将浓缩液用自来水透析3天，透析液经真空浓缩、冻干，得到乙酰化取代度为1.8的相转移催化乙酰化褐藻多糖样品。
图1是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的红外图谱。与褐藻多糖相比，乙酰化褐藻多糖在1600-1700cm-1处明显增强，这主要是乙酰化中的C＝O引起的。
体外抗H9N2禽流感病毒实验
MDCK细胞于24孔细胞培养板上，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中长成单层后，弃掉培养液，用PBS冲洗两遍后接种H9N2病毒，吸附一小时后弃掉病毒，PBS冲洗两遍后加含有1mg/ml或0.2mg/ml的上述实施例获得乙酰化褐藻多糖及1％胎牛血清的DMEM培养基，阴性对照组不加乙酰多糖。37℃，5％CO2环境中培养24h。取培养液测定血凝效价(Hemagglutination test，HA)，冲洗两遍后提取细胞RNA，反转录之后通过荧光定量PCR检测H9N2表达量。
实验结果见图2和图3。图2是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的血凝效价比较。图3是褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的H9N2相对表达量比较。
实验表明，加入上述实施例获得乙酰化褐藻多糖后，H9N2的血凝效价有了一定的降低，而H9N2的表达量有显著降低，并且对于低剂量0.2mg/ml和高剂量1mg/ml时的褐藻多糖和乙酰化褐藻多糖都表现出相似的结果，乙酰化褐藻多糖的效果优于褐藻多糖的效果，而且存在剂量的依赖性，剂量越高，效果越明显。因此，本发明乙酰化褐藻多糖对于H9N2禽流感病毒有显著的抑制作用。
实施例2
体外抗传染性法氏囊炎B87病毒实验：按常规的方法将Vero细胞进行消化传代，细胞数调整到1×106个/ml，加至96孔细胞培养板中，100ul/孔(每孔1×105个)，5％CO2培养箱37℃培养24h，待细胞生长成单层后，测定上述实施例获得乙酰化褐藻多糖对于病毒抑制作用。在安全浓度的基础上将上述实施例获得乙酰化褐藻多糖分别稀释成2个稀释度(1mg/ml，0.2mg/ml)，加到长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板上，100ul/孔，每个稀释度重复4孔。37℃作用4h，弃掉药液，每孔加入100TCID50病毒液100ul，37℃吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，加入含1％胎牛血清的DMEM培养基，另设细胞对照和病毒对照组。37℃、5％CO2培养箱中培养48h后用MTT法测细胞活性。实验结果见图4，褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的传染性法氏囊病毒感染细胞活性比较。从图4可见，乙酰化褐藻多糖对于传染性法氏囊病毒具有比褐藻多糖更优异的抑制作用。
实施例3
乙酰化褐藻多糖的离子交换-酰化方法：用浓度为0.5mol/L的四丁基溴化铵溶液搅拌浸泡Na型732阳离子树脂，持续6h，蒸馏水清洗树脂至中性后装入交换柱，保持柱内液面高度始终在树脂之上；将褐藻多糖配成0.5g/L的水溶液，然后通过离子交换柱与树脂进行交换，流出液速度控制在4ml/min，树脂的处理体积控制在每100ml树脂处理褐藻多糖溶液1L；真空浓缩离子交换所得的褐藻多糖溶液，冻干得四丁基铵型褐藻多糖干粉；将冻干得到的四丁基铵型褐藻多糖干粉溶于二甲氨基吡啶中，搅拌均匀制成质量浓度为1.0％的褐藻多糖溶液；在溶液中滴加最终体积浓度为6％乙酸酐，室温反应30h。反应结束后，用2％NaHCO3调节溶液的pH至中性或弱碱性，真空浓缩除去二甲氨基吡啶；用蒸馏水将酰化的褐藻多糖配制成0.5g/L的水溶液，与H型离子树脂反交换，流速控制在3ml/min；将反交换完的溶液真空浓缩后移入透析袋，透析1天，透析液经真空浓缩、冻干得乙酰化取代度为3.0的离子交换-酰化制备的乙酰化褐藻多糖样品。
体外抗新城疫病毒的实验：将上述乙酰化褐藻多糖分别配制成0.2mg/ml和1mg/ml浓度，加到长成单层CEF细胞的96孔细胞培养板上，100μL/孔，每个稀释度重复4孔。37℃作用4h，弃去药液，每孔加入100TCID病毒液100μL，37℃吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，加入维持液，另设细胞对照和病毒对照。37℃、5％CO2培养箱中培养，每日观察CPE，当病毒对照孔的CPE达到70-80％，记录CPE情况(+：25％以下的细胞有病变；++：25％-50％的细胞有病变；+++：50-75％的细胞有病变；++++：75％-100％的细胞有病变)；并用MTT法测定细胞活性。测定前4h每孔加入20μLMTT，测定时倒掉孔内液体，每孔加入100μL裂解液，置微量振荡器上震荡5min，在酶联免疫检测仪上测定570nm的吸光度(A570)值，作为乙酰褐藻多糖抵抗NDV感染的指标。A570值越大，抗感染效果越好。结果表明，乙酰褐藻多糖组发生病变的细胞少于75％，见图5，褐藻多糖与乙酰化褐藻多糖的新城疫病毒感染细胞生长比较。图5表明，对于0.2mg/ml和1mg/ml的用量，乙酰化褐藻多糖都表现出比单纯使用褐藻多糖优越的抗病毒活性，因此，乙酰化褐藻多糖对于新城疫病毒有优秀的抑制作用。
本发明乙酰化褐藻多糖具有优异的广谱抗病毒效果，尤其对于禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒等具有很好的抗病毒效果。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种乙酰褐藻多糖的应用，其特征在于，所述乙酰褐藻多糖应用在广谱抗病毒制剂方面。
2.如权利要求1所述的乙酰褐藻多糖的应用，其特征在于，所述乙酰褐藻多糖应用在禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的抗病毒制剂方面。
3.如权利要求1所述的乙酰褐藻多糖的应用，其特征在于，所述乙酰褐藻多糖是从褐藻中提取的多糖；所述多糖的聚合度为4-1000。
4.如权利要求1所述的乙酰褐藻多糖的应用，其特征在于，所述乙酰褐藻多糖以相转移催化酰化、离子交换-酰化方法从褐藻中制备。
5.如权利要求4所述的乙酰化褐藻多糖的应用，其特征在于，所述相转移催化酰化方法步骤如下：称取褐藻多糖溶于三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶中，制成褐藻多糖溶液；褐藻多糖溶液中加入相转移催化剂，并滴加乙酸酐，室温反应；反应结束后，调节溶液pH至中性或弱碱性，去除三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶；透析、浓缩、冻干，得到相转移催化乙酰化褐藻多糖。
6.如权利要求5所述的乙酰化褐藻多糖的应用，其特征在于，所述相转移催化剂是18-冠醚-6或四丁基溴化铵。
7.如权利要求4所述的乙酰化褐藻多糖的应用，其特征在于，所述离子交换-转型酰化方法步骤如下：用四丁基溴化铵溶液搅拌浸泡Na型732阳离子树脂，蒸馏水清洗树脂至中性后装入交换柱；将褐藻多糖水溶液通过离子交换柱与树脂进行交换，树脂处理褐藻多糖溶液；真空浓缩离子交换所得的褐藻多糖溶液，冻干得四丁基铵型褐藻多糖干粉；将冻干得到的四丁基铵型褐藻多糖干粉溶于三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶中，制成褐藻多糖溶液；在褐藻多糖溶液中滴加乙酸酐，室温反应；反应结束后，调节溶液pH至中性或弱碱性，真空浓缩除去三乙胺、吡啶或二甲氨基吡啶；用蒸馏水将酰化的褐藻多糖配制成水溶液，与H型离子树脂反交换；将反交换完的溶液真空浓缩后移入透析袋透析，透析液经真空浓缩、冻干得离子交换-乙酰化褐藻多糖。
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