CN105849265A - 用于产生供生产重组蛋白的哺乳动物生产细胞的物品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能以产业规模生产蛋白的哺乳动物细胞的产生及获得和使用该细胞的物品和方法，尤其是用于生产蛋白的物品和方法。

Description

用于产生供生产重组蛋白的哺乳动物生产细胞的物品和方法
本发明涉及能以产业规模生产蛋白的哺乳动物细胞的产生及取得和使用该细胞的物品(means)和方法，尤其是用于生产蛋白的物品和方法。
产生及合成用于各种应用及过程的重组蛋白的方法为本领域技术人员所熟知。多种采用各种机制的不同物品和方法可用来安全且有效地大规模生产该蛋白。这些细胞机制可在蛋白生产过程的不同阶段(例如在转录、翻译或翻译后水平)发挥其作用。最近发现一种藉由此使翻译和基因表达受到控制的机制是通过miRNA(此为微RNA的简称，下文中亦称为miR)的表达来实现的。这些为长度约22个核苷酸(nt)的内源性单链非编码RNA，其通常藉由miR与目标mRNA的3'-UTR间的RNA：RNA交互作用来作为基因表达的负调节子。miR已被证明在mRNA翻译中具有重要的调节作用，并参与控制细胞的发育、分化、凋亡、抗病毒防御及最基本的细胞过程。的确，已经提出miR可能调节约30％的人基因组的表达。miR藉由与特定的靶细胞mRNA交互作用(主要是在3'-UTR)来影响并调节mRNA翻译速率。此外，一个miR可以瞄准并与多个目标mRNA交互作用，因此目前很难决定miR识别基序(motif)及目标。
迄今为止，大多数调查miR表达及随后控制这些miR表达来诱发基因表达的研究已经在肿瘤学领域中展开，虽然这方面的知识很多是与工业生物技术领域中涉及如何加强细胞表型的技术有关。例如，癌症领域中证明细胞生长与miR之间的关系的研究可能适用于生物技术领域中。miR可调节的潜在目标提供乐藉由miR遗传工程来操纵基因表达，以研发具有新表型的细胞株的潜力。这样做时可实现操纵单个miR即可调节多个一起参与决定细胞表型的基因。
用于生物发生miR的通路的一部分与用于生物发生涉及Dicer及RNA诱导的沉默复合体(RISC)的沉默或短干扰RNA(siRNA)的通路共有(Bartel等人，2004Cell 116:281-297)。据报导，70％的miR基因在基因的内含子或外显子中发现，剩余的30％位于基因间区段内。最初，由核糖核酸酶Ⅱ(RNaseⅡ)内切核酸酶Drosha和Pasha裂解初级miR(pri-miR)，形成称为前-miRNA(前-miR)的茎环结构。该前-miR长度约为60至70个核苷酸，且具有5'磷酸及在3'端上的2个核苷酸的悬端。随着转运辅助因子Ran-GTP，前-miR发夹从细胞核主动转运通过受体Exportin-5。在细胞质中，称为Dicer的核糖核酸酶Ⅲ内切核酸酶被认为通过识别双链部分来，并从茎-环的基部切割大约两个螺旋转，产生miR：miR*双链体(前-miR的对向臂以miR名称后面加星号表示)，从而与前-miR相互作用。该miR：miR*双链体进入RISC，miR：miR*双链体的miR*组分被剥离，并藉由解旋酶的协助降解。成熟miR的5'端位于具有最低热力学能量的miR-MIR*双链体的一条链的末端(Bartel等人，2004Cell 116:281-297)。
miR的5'端的前一至七个核苷酸经由碱基配对结合目标并称为“种子”区。在哺乳动物细胞中，miR通常经由与mRNA的不完全碱基配对来识别目标基因(其中仅miR的种子区显示出与目标完美配对)。亦有报导，miR结合位点存在于除了mRNA的3'端外的其他位置(诸如核糖体蛋白mRNA的5'-非翻译区(UTR)(等人，2008Molecular Cell 30:460-471))，或甚至是基因组调节序列，诸如启动子(例如Tan等人，2009BMC MolecularBiology10:12)。亦有报导，miR可与编码序列中的mRNA交互作用(Rigoutsos等人，CancerResearch 69:3245-3248)。然而，现有关于非3'-UTR交互作用的信息少且最有效的miR目标位于mRNA 3'-非翻译区(3'UTR)。一般而言，若miR与mRNA目标之间存有不完全碱基配对，则发生翻译抑制，然而当有完整的碱基配对时则认为目标mRNA会发生降解。
尽管可能使用miR来调节基因表达并因此调节影响高重组蛋白产率的通路和细胞过程，迄今为止，尚未充分实现操纵miR以改善从培养的哺乳动物细胞生产重组蛋白。分泌在培养基中的重组蛋白的浓度为细胞比产率(qP)及活细胞浓度(IVC)的时间积分的函数(Porter等人，2010Biotechnology Progress26:1446-1455)。因此，可将miR施用在通路以增加qP(例如透过操纵分泌途径)或IVC(例如透过操纵增殖和凋亡通路)。生物加工/生物技术领域中的大多数的miR表达和操纵的研究都集中在不同的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。然而，一项分析人胚胎肾293(HEK293)细胞(通常用于瞬时生产重组蛋白)中miR谱图的研究探寻了在分批培养的不同生长阶段中miR表达谱图如何改变(Koh等人，2009Journal ofBiotechnology 140:149-155)。这些作者报导了14种miR的表达在指数期和稳定生长期之间显著改变、13种miR的表达在稳定期被上调。其中，在指数期和稳定期之间被观察到有变化的miR为miR-15a和miR-16(Koh等人，2009Journal of Biotechnology 140:149-155)。
最近，CHO细胞的miR表达及CHO细胞中miR的操纵已吸引很大的兴趣，但这些研究仍处于起步阶段。最近一项研究使用深度测序方法来分析保守miR及其横跨重组细胞株的表达(Hammond等人，2012Biotechnology and Bioengineering 109:1371-1375)。本研究调查CHO-K1宿主、源自CHO-K1的表达分泌型碱性磷酸酶(SEAP)及组织纤溶酶原激活蛋白(tPA)的细胞株，并发现与宿主细胞相比较，173个保守miR中有136个在SEAP或tPA重组细胞株中有差别表达，有75个在二者中均有差别表达。其中，被鉴定为差别表达者包含miR-15a、miR-15b及miR-34c(Hammond等人，2012Biotechnology and Bioengineering 109:1371-1375)。另一项研究报告了mmu-miR-446h表达会影响CHO细胞中的细胞凋亡(Druz等人，2011Biotechnology and Bioengineering108:1651-1661)。Johnson等人(2011)所报告的在CHO中进行的一项研究藉由与来自miR-Base数据库的已知miR进行比对而鉴别出350种miR(Johnson等人，2011Biotechnology and Bioengineering 108:475-480)。此研究显示，(i)所调查的CHO细胞株中，几乎所有成熟的miR均与其人类或小鼠对应物高度同源；及(ii)许多miR的表达在响应小环境扰动时会改变。这项研究亦报告了仓鼠miR cgr-let-7f为CHO细胞中最丰富的miR且其量在各调查的情况中彼此相当。
Hackl等人报告了类似的测序方法(Hack等人，2011Journal of Biotechnology153:62-75)来鉴别并标注CHO细胞中的保守和新颖miR。在研究时，作者没有取得标注的CHO基因组。相反地，取得5'和3'成熟miR的阅读比对样式及阅读计数比，并用来独立分类成miR/miR*及5p/3p miR对及区分miR与其他非编码RNA，这产生了387个成熟CHO miR的标注。该研究包括比较血清与不含血清的条件及宿主与衍生型重组细胞株。在宿主与重组衍生型细胞株的比较中，他们报导了miR-16b的差别表达(Hackl等人，2011Journal of Biotechnology 153:62-75)。该组亦报告了在分批培养的CHO-K1悬浮细胞培养的不同阶段中miR的表达并报告了各分批培养间超过100种miR被差别调节(Hernandez Bort等人，2012Biotechnology Journal7:500-515)。于另一研究中，Lin等人(2011)调查了宿主CHODG44细胞及衍生型IgG生产细胞株中的miR水平，报导生产IgG的重组细胞株中miR-221和miR-22的表达被下调。然而，分泌入培养基中的IgG的浓度与这些miR的表达间没有任何关系。与生产重组蛋白的衍生型细胞株相比较，母DG44细胞株中miR-15b的表达亦明显较低(Lin等人，2011Biotechnology Progress27:1163-1171)。
CHO细胞中miR表达的第一批报告中的一个来自Gammell等人。(Gammell等人，2007Journal of Biotechnology 130:213-218)。作者所采取的方法系使用非仓鼠微阵列并调查温度变动时miR的表达。所产生的数据显示出miR-21及miR-24在CHO-K1生长受抑制的细胞株(由温度变动诱导或在正常分批培养期间被诱导)中表达上调(美国2010/0190258A1)。随后，此组报导了将温度从37℃降至28-33℃后24小时测量时，发现温度降低会导致miR-219、miR-518d、miR-126、miR-30e、miR-489和miR-345的水平增加，而miR-7、miR-320、miR-101及miR-199被下调(Barron等人，2011Journal of Biotechnology 151:204-211)。成功的外源性miR-7的过度表达造成细胞增殖被阻断，并提高了在37℃下均一化(每一细胞)的重组蛋白产量，但该产率仍然低于在降低的温度下的细胞的产率。
操纵miR的影响通常利用报告子基因及“海绵载体”调查(Ebert等人，2007NatureMethods 4:721-726)。为了证明miR对工业相关表型的影响，有必要经由减少或增加所讨论的miR的表达来验证此点。Jadhav等人(Jadhav等人，2012Biotechnology andBioengineering 109:13761385)最近报导CHO细胞株中的miR的功能分析可利用生产重组EPO-FC的CHO细胞株及在四天的期间内的瞬时转染而得到成功证明。
商业生产重组蛋白通常需要大规模的生产过程。尽管最近在工业过程中有所进展，生产重组蛋白仍然是具有挑战性的任务。因此，仍需要提供被进一步改善的物品及方法，以更有效和优化的方式生产蛋白。
本发明特别基于提供经改善的或进一步的用于产业规模生产蛋白的物品和方法的技术问题。
本发明经由提供独立权利要求教导的内容来解决其技术问题。
尤其是，本发明经由提供用于在哺乳动物生产细胞中生产感兴趣蛋白的方法来解决其技术问题，所述方法包含下列步骤：
a)提供哺乳动物生产细胞，
b)增加步骤a)所提供的哺乳动物生产细胞中至少一种选自由miR-15、miR-16及miR-34组成的群组的miR的浓度，从而取得生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，
c)在适合生产感兴趣蛋白的条件下培养该生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，及
d)回收步骤c)所生产的感兴趣蛋白。
因此，本发明增加了在哺乳动物生产细胞中经鉴别的miR的浓度，意指提高其量，尤其是细胞内的量，以增加感兴趣蛋白的生产。
在本发明的背景中，术语浓度应被理解为亦指水平。
在本发明的背景中，miR的浓度增加系指与步骤a)所提供的哺乳动物生产细胞中该miR的浓度相比较时，该miR的浓度较高。miR的浓度可藉由常规测定细胞中的miR量的方法来测定，例如藉由qRT-PCR分析测定。本领域技术人员知晓适当的管理措施及适当标准的建立。
在本发明的背景中，感兴趣蛋白的生产增加意指细胞中的感兴趣蛋白(尤其是感兴趣的重组蛋白)比生产率比(qP)较高，和/或意指活细胞浓度(IVC)的时间积分较高。根据Porter等人(Porter等人，2010Biotechnology Progress26:1446-1455)计算，重组蛋白的生产或生产率(其被定义为培养基中的蛋白的浓度)为这两个参数(qP及IVC)的函数。
测量蛋白生产提高的方法为本领域技术人员所周知。例如，重组蛋白的生产提高可藉由ELISA测量组织培养基中的滴度小规模地测定(Smales等人，2004BiotechnologyBioengineering 88:474-488)。其亦可藉由ForteBio Octet，例如高通量测定培养基中的重组单克隆抗体(mAb)浓度来定量测定(Mason等人，2012Biotechnology Progress 28:846-855)，或藉由蛋白A HPLC来大规模地测定(Stansfield等人，2007BiotechnologyBioengineering 97:410-424)。用于计算细胞的方法包括，但不限于台盼蓝(trypan blue)排除法，随后使用血球计或Vi-CELL(Beckman-Coulter)计数。
在一个实施方式中，该感兴趣蛋白的生产提高可能是由于在本方法的步骤b)获得了至少一种miR的细胞内浓度提高而造成细胞的蛋白比生产率(qP)提高。此外，或另外，在一个实施方式中，该提高的蛋白生产可能系由于在本方法的步骤b)获得了至少一种miR的细胞内浓度提高而造成细胞生长，尤其是较高的IVC。因此，本发明对用于产生蛋白，尤其是重组蛋白的哺乳动物生产细胞，尤其是细胞株的生长和利用特别有用。
根据本发明，所述方法的步骤a)需要提供哺乳动物生产细胞，此意指能生产感兴趣蛋白(尤其是感兴趣的重组蛋白)，且能够进行所述方法的步骤b)和c)的细胞。
于本发明的优选的实施方式中，感兴趣蛋白为生产细胞株的内源性蛋白。
于更优选的实施方式中，感兴趣蛋白对生产细胞而言为外源性的。这意指感兴趣蛋白并非正常存在于生产细胞中。因此，必须藉由本领域技术人员已知的方法(优选是如下述者)将编码感兴趣蛋白的核苷酸序列引入生产细胞中。
在本发明的特别优选的实施方式中，在本方法的步骤a)或x)前转染编码感兴趣蛋白的核苷酸序列。此意指该外源性感兴趣蛋白已经存在于所提供的生产细胞中。优选的，该编码感兴趣蛋白的核苷酸序列系存在于载体中或被稳定地整合在该生产细胞的基因组。
根据本发明，本发明的方法中的步骤b)需要至少一种miR的浓度当与进行步骤b)前存在于哺乳动物生产细胞中的该miR相比较时是增加的，以取得***纵(经遗传工程处理)的哺乳动物生产细胞(下文中亦称为“生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞”)。接着，在步骤c)中将该生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞在适合生产感兴趣蛋白的条件下培养，其中在该培养期间可生产该感兴趣蛋白且可以回收，尤其是可从培养基和细胞分离出。
于另一尤其优选的实施方式中，在本方法的步骤b)或y)的期间将编码感兴趣蛋白的核苷酸序列与至少一种miR同时转染入生产细胞中。因此，于本实施方式中，不仅该至少一种miR的浓度增加，且该感兴趣蛋白的浓度亦增加。再有，编码该感兴趣蛋白的核苷酸序列可在单独的载体中或可被稳定地整合入所取得的生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞的基因组。
再于另一尤其优选的实施方式中，将编码感兴趣蛋白的核苷酸序列转染入生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，即，在本方法的步骤b)、y)或z)之后，但在步骤c)之前。
于一尤其优选的实施方式中，该细胞培养系以分批培养、喂料分批培养或连续培养的形式进行。更优选地，该细胞培养系以悬浮培养的形式进行。优选地，在步骤b)使用常规的细胞培养基。
于一优选的实施方式中，本发明的步骤b)系在常规的细胞培养基中进行，优选在诸如步骤c)所使用的细胞培养基中。于本发明的另一实施方式中，步骤b)系在转染培养基中进行，尤其是在适合用于将miR或包含编码miR及可能地感兴趣的蛋白的核苷酸序列的载体转染入哺乳动物生产细胞中的培养基。
合适的培养及回收方法已为本领域技术人员所知且可取决于感兴趣蛋白及所使用的哺乳动物生产细胞。
于一优选的实施方式中，步骤c)所生产的感兴趣蛋白系经由在步骤d)将感兴趣蛋白从其他在培养步骤c)期间存有的组分中分离出，优选从生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞中分离出(优选为纯化)来回收。根据步骤d)回收后所取得的感兴趣蛋白基本上不含，优选不含生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞。
回收感兴趣蛋白系使用物理或化学或物理-化学方法来进行。优选地，该物理或化学或物理-化学方法为过滤法、离心法、超速离心法、萃取法、冷冻干燥法、沉淀法、色层分析法或其两种或多种方法的组合。优选地，该色层分析法系选自尺寸排阻色层分析法、疏水交互作用色层分析法、离子交换色层分析法、亲和力色层分析法及金属结合色层分析法。
本发明亦经由提供制备能表达感兴趣蛋白的生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞的方法来解决其技术问题，此方法包含下列步骤：
x)提供哺乳动物生产细胞，
y)增加步骤x)所提供的哺乳动物生产细胞中至少一种选自由miR-15、miR-16及miR-34所组成的群组的miR的浓度，从而取得生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，及
z)回收步骤y)所生产的生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞。
因此，用于制备生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞的本发明方法提供了经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞的生产，优选地，所述细胞能够增加蛋白比生产率及/或能够改善，尤其是增加细胞生长，即，较高的活细胞浓度(IVC)的时间积分。
miR-15b及miR-16均为诱导细胞凋亡的miR，其靶向编码抗细胞凋亡的蛋白(诸如BcI2)的mRNA。数种其他基因亦显示为这些miR的靶标。例如，据报导，miR-16亦调节细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E1及CDK6，使细胞在细胞周期的G0/G1期中进入停滞。miR-21为另一种诱导细胞凋亡的miR，其阻止细胞增殖并诱导细胞死亡。miR-21，如同miR-15和miR-16，靶向BcI2mRNA。miR-34c参与细胞增殖(主要在p53介导的细胞凋亡中)，这使其成为癌症诊断和疗法的重要目标。miR-34为肿瘤抑制子，其藉由靶向Notch、HMGA2、沉默信息调节子1(SIRT1)及Bcl-2和其他与肿瘤形成和/或发展相关的基因来达成抑制肿瘤。
因此，本发明提供了增强蛋白生产的有利的物品和方法，尤其是允许在哺乳动物生产细胞中大规模生产感兴趣蛋白。本发明亦提供改进的哺乳动物生产细胞，此意指经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，该哺乳动物生产细胞系经遗传工程处理以允许在优选的实施方式中改善，尤其是增加生产蛋白和/或改善，尤其是增加细胞生长。
在本发明的上下文中，术语“感兴趣蛋白”意指糖基化、部分糖基化或非糖基化形式的寡肽或多肽。
在一个实施方式中，如本文所使用的单数形式的术语“感兴趣蛋白”亦指至少一种感兴趣蛋白，尤其是感兴趣的多肽，其尤其指两种、三种或更多种不同的感兴趣蛋白。于本发明的一实施方式中，术语“感兴趣蛋白”系指生产增加的，优选为特异地增加的一种特定蛋白，尤其是仅增加此特定蛋白的生产。于一特定且优选的实施方式中，该感兴趣蛋白，尤其是编码该感兴趣蛋白的核苷酸序列，相对于该哺乳动物生产细胞(即，该哺乳动物宿主细胞)而言可为内源性或外源性蛋白。在该生产细胞株包含外源性感兴趣蛋白的情况中，其被称为转基因的。
在本发明的上下文中，术语“内源性”蛋白系指已经存在于或正被编码在哺乳动物生产细胞株的基因组中的蛋白，因此并非源自该细胞株外面。
在本发明的上下文中，术语“外源性”蛋白系指由于重组基因技术的方法(例如常规的遗传工程方法，优选为藉由转化、电穿孔或转染编码该外源性蛋白的核苷酸序列的物品)而存在于该哺乳动物生产细胞中的蛋白，其中该外源性核苷酸序列在遗传工程步骤之前并不存在于该哺乳动物生产细胞中。
感兴趣蛋白可为经遗传工程处理的，尤其是，重组蛋白。尤其是，该蛋白可为生药的。
尤其是，该蛋白可为哺乳动物、细菌、病毒或植物蛋白。优选地，该蛋白为人蛋白或人化蛋白。
于一尤其优选的实施方式中，该感兴趣蛋白可为抗体，尤其是单克隆抗体、抗原、激素、酶、细胞因子、生长因子、报告蛋白、可选择标记，例如GS-选择标记、潮霉素可选择标记、嘌呤霉素选择标记或胸苷激酶可选择标记或彼等的任一结构和/或功能性部分或杂合体。
于一尤其优选的实施方式中，该感兴趣蛋白可为抗体，尤其是单克隆抗体、抗原、酶、细胞因子、生长因子、报告蛋白、可选择标记，例如GS-选择标记、潮霉素可选择标记、嘌呤霉素选择标记或胸苷激酶可选择标记或彼等的任一结构和/或功能部分或杂合体。
于一优选的实施方式中，该感兴趣蛋白可为单克隆抗体、重组或嵌合抗体、或其片段，例如抗体的重或轻链或可变区或恒定区。于进一步优选的实施方式中，该感兴趣蛋白可为生长激素、胰岛素、FSH(***)、第VⅢ因子、TPO、EPO(红血球生成素(erythropoietin))、G-CSF、GM-CSF、TPA(组织纤溶酶原活化剂)、干扰素α、β或γ、***或生长激素(somatrotropin)。
于一优选的实施方式中，该感兴趣蛋白可为单克隆抗体、重组或嵌合抗体、或其片段，例如抗体的重或轻链、或可变区或恒定区。于进一步优选的实施方式中，该感兴趣蛋白可为生长激素、FSH(***)、第VⅢ因子、TPO、EPO(红血球生成素)、G-CSF、GM-CSF、TPA(组织纤溶酶原活化剂)、干扰素α、β或γ、***或生长激素。
于本发明的优选实施方式中，该生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞包含(优选地表达)编码Sox6或Bhlhe22或两者的基因。于一优选的实施方式中，该生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞不含编码Sox6或Bhlhe22或两者的基因。优选地，该生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞中编码Sox6或Bhlhe22的基因的表达被部分或完全抑制。
优选地，本文所使用的术语“核苷酸序列”或“多核苷酸”系指核酸，尤其是核酸分子，优选为DNA或RNA。
在本发明的上下文中，术语“哺乳动物生产细胞”系指能够生产感兴趣蛋白的哺乳动物细胞(尤其是哺乳动物宿主细胞)，尤其是能够生产感兴趣蛋白且能够经受本发明方法的步骤b)和c)或y)的哺乳动物宿主细胞。
在本发明的上下文中，术语“生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞”意指增加所提供的哺乳动物生产细胞中至少一种选自由miR-15、miR-16及miR-34所组成的群组的miR的浓度而产生的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，因此，其特点为与步骤a)或x)所提供的哺乳动物生产细胞相比较，该至少一种miR，尤其是两种该miR，优选为三种该miR的浓度增加。于一优选的实施方式中，本发明的“生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞”的特征为蛋白的生产增加，在一个实施方式中，其特征为qP或IVC增加，且在一个实施方式中，其特征为该二种特性。
于本发明的一优选实施方式中，该“生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞”为显现出qP增加或IVC增加或该两者均增加的细胞。
于一优选的实施方式中，miR-15为miR-15a或miR-15b。
于一优选的实施方式中，miR-16为miR-16-1或miR-16-2。
于一优选的实施方式中，miR-34为miR-34a、miR-34b或miR-34c。
于一优选的实施方式中，该至少一种miR的浓度的增加系藉由以至少一种选自由miR-15、miR-16及miR-34所组成的群组的miR转染步骤b)或y)的哺乳动物生产细胞：。
因此，于一优选的实施方式中，以至少一种如本文所鉴别的miR或前miR(优选至少两种，最优选3种miR或前miR)转染该哺乳动物生产细胞，从而使其浓度增加。于一优选的实施方式中，以至少一种编码前miR的载体瞬时转染该生产细胞，而于另一优选的实施方式中，构建稳定地表达至少一种前miR的细胞株，此意指该生产蛋白的经遗传工程处理的生产细胞含有至少一种被稳定地整合入其基因组的前-miR的核苷酸序列。
于一优选的实施方式中，该至少一种miR的浓度的增加系藉由以至少一种含有编码至少一种miR的核苷酸序列的载体转染步骤b)或y)中的哺乳动物生产细胞，且该核苷酸序列系受至少一种允许该至少一种miR过度表达的调控原件控制，其中该至少一种miR系选自由下列所组成的群组：miR-15、miR-16及miR-34。
于优选的实施方式中，该含有编码至少一种miR的核苷酸序列的载体为表达载体。
因此，于一优选的实施方式中，以至少一种允许该至少一种(优选为至少两种，最优选为3种)如本文所鉴别的miR在经转染的细胞中过度表达的本发明载体来转染该哺乳动物生产细胞，从而使该miR的浓度增加。于本发明的一优选的实施方式中，该浓度被瞬时增加。于本发明的另一优选的实施方式中，该浓度被稳定地增加。
允许至少一种miR过度表达的调控原件可为启动子或任何其他促进表达或增强表达的原件，诸如增强子。于一优选的实施方式中，该允许至少一种miR过度表达的调控原件为启动子，优选为哺乳动物或病毒启动子。
于一尤其优选的实施方式中，该启动子可为组成型或诱导型启动子，例如温度诱导型启动子。
于一优选的实施方式中，该步骤b)或y)所使用的至少一种载体被瞬时或稳定转染入该哺乳动物生产细胞中。
于一优选的实施方式中，至少有两种，优选地，i)miR-15及miR-16、或ii)miR-15及miR-34、或iii)miR-16及miR-34，优选为全部三种miR或编码至少两种，优选为3种miR的核苷酸序列被转染。
于一优选的实施方式中，可将至少两种编码miR的核苷酸序列在相同的载体上转染。于另一实施方式中，将至少两种编码miR的核苷酸序列共同转染，且每个单独的miR系编码在独立的载体上。此外，若感兴趣蛋白系与至少一种miR一起转染，其可以被编码在相同载体上，或在单独的载体上。
编码至少一种miR的核苷酸序列或该至少一种miR可使用本领域技术人员所周知的常规方法来进行转染。优选地，该方法可为转染剂lipofectamine转染、电穿孔、脂质体介导的转染、磷酸钙介导的转染、病毒介导的转染或直接基因转移，例如粒子轰击(particlebombardment)。
于本发明的一优选实施方式中，该编码至少一种miR(优选为至少一种前-miR)的核苷酸序列系在至少一种允许该至少一种miR过度表达的调控原件的控制下被瞬时或稳定地包含在该哺乳动物生产细胞中。
于一优选的实施方式中，miR为成熟的miR、前体miR(前-miR)或初级miR(pri-miR)。优选地，成熟miR系由细胞合成或为外源添加的化学合成的寡核苷酸。
于一优选的实施方式中，哺乳动物生产细胞优选为啮齿动物细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞或人类细胞、Y0细胞、COS细胞、sp2/0细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞或CHO-K1SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHO GS基因剔除细胞、CHO FUT8GS基因剔除细胞、NS0细胞、PERC6细胞、HEK293细胞、HT1080细胞或BHK细胞。该哺乳动物生产细胞亦可为幼仓鼠肾细胞(BHK)。该生产细胞亦可为非哺乳动物细胞，即，昆虫细胞，等，优选地，该生产细胞为非人类细胞。
于一优选的实施方式中，该哺乳动物生产细胞为CHO细胞、NS0细胞、PERC6细胞、HT1080细胞或幼仓鼠肾细胞(BHK)。于一优选的实施方式中，该CHO细胞系选自由下列所组成的群组：CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHO GS基因剔除细胞及CHO FUT8GS基因剔除细胞。
优选地，该CHO GS基因剔除细胞为CHO-K1SV GS基因剔除细胞，优选为Lonza的GSXceedTM。优选地，该CHO FUT8基因剔除细胞为Lonza的
于本发明的背景中，术语“细胞”意指单个细胞。术语“细胞”亦指细胞株，优选为永生化的细胞株，其可包含细胞汇集体。
本发明亦经由提供根据本发明的任一方法生产的“生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞”来解决其技术问题。
尤其是，本发明提供了包含至少一个编码至少一种miR的转基因核酸序列的“生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞”，该转基因核酸序列系被瞬时或稳定地并入细胞的基因组中，受至少一种调控原件控制，以允许该至少一种miR在其中过度表达，其中该至少一种miR系选自由下列所组成的群组：miR-15、miR-16及miR-34。
尤其是，本发明提供了用于在哺乳动物生产细胞中生产感兴趣蛋白的试剂盒，其包含至少一种哺乳动物生产细胞、至少一种含有编码至少一种miR的核苷酸序列的载体以及用于以该至少一种载体转染至少一种细胞的物品，其中该编码至少一种miR的核苷酸序列系受至少一种允许至少一种miR过度表达的调控原件控制，其中该至少一种miR系选自由下列所组成的群组：miR-15、miR-16及miR-34miR。
于一优选的实施方式中，该试剂盒进一步包含含有编码感兴趣蛋白的核苷酸序列的第二载体。
进一步的，优选的实施方式为从属申请专利范围的技术方案。
本发明现在将藉由非限制性实施例和附图更详细地说明。
附图显示：
图1.生长在CD-CHO培养基中的表达单克隆抗体cB72.3的两个重组GS-CHOK1SV细胞株的分批生长曲线(■＝“高”生产CHO 42细胞株，在完成摇瓶分批培养时单克隆抗体滴度为550±4毫克/升，△＝“低”生产CHO 114细胞株，完成摇瓶分批培养时单克隆抗体滴度为313±64毫克/升)。在整个分批培养期间，在箭头所指定的时间采取样本，以从细胞提取miR物质用于qRT-PCR分析。
图2.在“高”生产CHO 42(■)及“低”生产CHO 114(□)cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株的整个分批培养期间，前-miR-15b(A)及成熟miR-15b(B)的谱图。误差棒＝±标准偏差(n＝3)。
图3.在CHO 42(■)及CHO 114(□)cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株的整个分批培养期间，(A)前-miR-16-1、(B)前miR16-2及成熟(C)miR-16的谱图。误差棒＝±标准偏差(n＝3)。
图4.在“高”生产CHO 42(■)及“低”生产CHO 114(□)cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株的整个分批培养期间，(A)前-miR-21及(B)成熟miR-21的谱图。误差棒＝±标准偏差(n＝3)。
图5.在“高”生产CHO 42(■)及“低”生产CHO 114(□)cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株的整个分批培养期间，(A)前-miR-34c及(B)成熟miR-34c的谱图。误差棒＝±标准偏差(n＝3)。
图6.在“高”生产CHO 42(■)及“低”生产CHO 114(□)cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株转染后的24-96小时的期间内所测定的miR的瞬时过度表达对IVC和qP的影响。
图7.转染后96小时，在“高”生产CHO 42cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株中前miR的瞬时过度表达对培养基中的单克隆抗体浓度的影响。各时间点的单克隆抗体浓度已对培养中的活细胞浓度均一化。*＝与转染剂空白对照组相比较，单克隆抗体的表达为统计上显著增加(P<0.05)。误差棒＝±SD(n＝3)。
图8.转染后96小时，在“中”生产CHO56cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株中，前miR的瞬时过度表达对培养基中的单克隆抗体浓度的影响。*＝与转染剂空白对照组相比较，单克隆抗体的表达为统计上显著增加(P<0.05)。误差棒＝±SD(n＝3)。
图9.转染后(A)48小时及(B)96小时，在“低”生产CHO114cB72.3单克隆抗体生产GS-CHOK1SV细胞株中，miR的瞬时过度表达对培养基中的单克隆抗体浓度的影响。*＝与转染剂空白对照组相比较，单克隆抗体的表达为统计上显著增加(P<0.05)。误差棒＝±SD(n＝3)。
图10.以编码单独的前miR的载体转染所创建的CHOK1SV汇集体的生长曲线。A＝miR-21汇集体(编码前miR-21的载体JR03)，B＝miR-34c汇集体(编码前miR-34c的载体JR04)，C＝miR-15b汇集体(编码前miR-15b的载体JR05)，D＝miR-16汇集体(编码前miR-16的载体JR06)。CHOK1SV宿主旁边显示各汇集体的三种培养。
图11.以编码单独的前miR的载体转染所创建的源自CHOK1SV的汇集体的分批培养在第5天(■)和7天(□)的成熟miR的表达。A＝miR-21(编码前miR的载体JR03)，B＝miR-34c(编码前miR-34c的载体JR04)，C＝miR-15b(编码前miR-15b的载体JR05)，D＝miR-16(编码前miR-16的载体JR06)CHOK1SV宿主细胞株，RY05＝以未编码miR的miR表达载体转染所创建的汇集体。误差棒＝±SD(n＝3)。
图12.转染后48小时各种miR受操纵的细胞株中的荧光素酶的表达。(■)以在荧光素酶转录单位的3'-UTR具有或不具有miR-34c目标序列(不具有＝“荧光素酶载体”，具有＝“荧光素酶海绵载体”，含有miR-34c的目标序列)的荧光素酶报告基因载体转染的汇集体。(□)以额外的编码miR-34c的载体加上在荧光素酶转录单位的3'-UTR中具有或不具有miR-34c目标序列的荧光素酶报告基因载体超共转染的汇集体。所有数据的显示系相对于不存在miR-34c的目标序列时，稳定汇集体中的荧光素酶的表达。
下列表1鉴别了本发明中所使用的前miR引物(SEQ ID No:1至12)的核苷酸序列。
实施例
材料及方法：
用于过度表达miR的载体和海绵载体
产生用于过度表达miR的载体以表达人miR的发夹-产生前miR。将嘌呤霉素选择标记包含在用于产生稳定细胞株的载体中。使用由3'-UTR中具有互补或几乎互补的miR-34c目标序列的海肾荧光素酶所组成的海绵载体来证明miR-34c的过度表达会造成基因沉默。
细胞培养
将CHO-K1黏附细胞(European Collection of Cell Culture)培养在辅以500μML-谷氨酸及500μM天门冬酰胺、200mM L-谷氨酰胺、核苷(30μM腺苷、胞苷、尿苷及鸟苷加上10μM胸苷(均来自Sigma公司))、10％(体积/体积)经热灭活的胎牛血清(PAA实验室)及1％(体积/体积)非必需氨基酸(Life Technologies公司，英国)的DMEM(Life Technologies公司，英国)中。将CHO-K1保持在37℃，潮湿的5％CO2空气下的培养箱中的T培养瓶(75平方厘米，Sartorius)中。当培养瓶中的细胞达到约80％汇合时，将细胞分开。将目前的培养基吸出并以10毫升磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)(每100毫升无菌水(Oxide Limited)使用1片)清洗。吸出PBS并将细胞在37℃，5％CO2(体积/体积)空气下，培育在3毫升胰蛋白酶(Life Technologies，英国)中2-3分钟。然后，加入10毫升培养基以抑制胰蛋白酶并将细胞悬浮液倒入50毫升的Falcon管中，再在1000rpm下离心5分钟。然后，将上清液移除，将细胞沉淀小丸重新悬浮于10毫升的新鲜培养基中以确认该细胞存活率>95％(使用ViCell仪器测定)。然后，将0.25毫升的细胞悬浮液加入含有10毫升新鲜培养基的T75培养瓶中，以将细胞接种在T75瓶中。
将GS-CHO42、56和114悬浮细胞(Lonza Biologics plc)培养在CD CHO培养基(Life Technologies公司，英国)中。将这些培养例行保持在Erlenmeyer烧瓶中，培养在37℃，100rpm回转式震荡培养箱中的潮湿的5％CO2(体积/体积)空气下，初始接种密度为2×105细胞/毫升。
GS-CHO42和GS-CHO114分批培养
将两种细胞株最初以3×105细胞/毫升的密度接种在500毫升Erlenmeyer烧瓶中的100毫升CD CHO培养基中，并培养在37℃，100rpm回转式震荡培养箱中的潮湿的5％CO2(体积/体积)空气下。每日采取样本以计算细胞数(1毫升)。在培养时间的第3、5、7和11天的时间点移出1×107细胞的等分试样以供miR分析。经由离心来收获细胞，以PBS清洗沉淀小丸一次并储存于-70℃。保留上清液以测定分泌出的单克隆抗体的浓度。
RNA提取
使用MirVANA RNA提取试剂盒(Life Technologies公司，英国)按照生产商的说明提取RNA。使用NanoDrop仪器，测定在A260nm波长处的吸收来测量RNA的量。制备RNA提取物的20纳克/毫升稀释液以用于接下去的qRT-PCR。在miR分析方面，依循生产商的用于富集小RNA的方案。
qRT-PCR分析-TaqMan
除非另有说明，所有qRT-PCR材料系源自Applied Biosystems。在所有实验方面，使用两步骤分析试剂盒与48和96孔不透明盘及黏合片(均取自Bio-Rad公司)。第一步骤涉及miR逆转录试剂盒及收集样本。根据生产商的指示准备各个孔以含有7微升的主混合物、3微升的合适的引物(其提供在试剂盒中，每一miR一种)及5微升的浓度为10纳克/毫升的RNA样本。使用下列程序，在Eppendorf授权的热循环仪上运行RT-PCR：
.在16℃下30分钟
.在42℃下30分钟
.在85℃下5分钟
然后，进行第二个qRT-PCR步骤。每个孔包含1微升的TaqMan microRNA Assay(20×)、1.33微升来自第一步骤的产物、10微升TaqMan Universal PCR混合物及7.67微升不含核酸酶的水。使用下列PCR循环细节，在Realplex4仪器上运行qRT-PCR实验；
1.在95℃下10分钟
2.在95℃下15秒
3.在60℃下60秒
重复步骤2和3，共进行40个循环
在2％琼脂糖凝胶上分析qRT-PCR的产物，旁边为10bp DNA梯状条带(Invitrogen)。
为了测定各miR的拷贝数，使用具已知浓度的各miR的市售的合成物质来产生标准曲线。使用TaqMan microRNA Assay中具有已知拷贝数的合成物质来产生标准曲线，接着使用该标准曲线从样本测定未知的miR浓度。
使用SYBR Green进行qRT-PCR分析以测定各时间点和细胞株之间的不成熟前miR的相对浓度
在所有实验中，使用SYBR Green一步qRT-PCR试剂盒与48和96孔不透明盘和黏合片。准备各个孔以含有12.5微升SYBR Green混合物、1.5微升合适的引物、0.5微升RT酶、2微升的浓度为2.5纳克/毫升的RNA及8.5微升的二次蒸馏水。本研究期间所使用的引物描述于下列表1中。
使用下列PCR循环细节，在Realplex4仪器上运行qRT-PCR实验；
1.在50℃下10分钟
2.在95℃下5分钟
3.在95℃下10秒
4.在58℃下30秒
重复步骤3和4，共进行40个循环
.熔解曲线(在温度改变0.5℃时测量)
在1％琼脂糖凝胶上分析qRT-PCR的产物，旁边为100bp RNA梯状条带(Invitrogen，Life Technologies公司，英国)。
表1：设计用于前-miR qRT-PCR试验的引物
Lipofectamine转染
为了在6孔板中进行瞬时转染实验，将指数生长期的细胞株以3×105细胞/毫升的密度接种在含有适当培养基的6孔盘(Greiner公司，英国)中，并培养在37℃，潮湿的5％(体积/体积)CO2空气下的培养箱中。在2个不同的管中制备下列者；(a)4微克的DNA及250微升的培养基(Life Technologies公司，英国)，(b)12微升的Lipofectamine(Invitrogen，Life Technologies公司，英国)加250微升的培养基(Life Technologies公司，英国)。然后，将这些在室温下培育5分钟，将两支试管混合并在室温下培育20分钟。此期间结束时，将500微升的DNA复合物加入适当的孔中。将细胞培养不同的期间，再计算细胞数目并收集一部分培养基，以藉由ELISA测定单克隆抗体的滴度。
当使用各种CHO-K1SV细胞株在96孔深孔盘板中进行瞬时转染实验时，调整用于6孔盘瞬时转染实验的方案以考虑数目较多的细胞。将数量为每孔0.4×106个的指数生长期的细胞接种在96孔深孔盘板(Nunc)中，并将板培养在37℃，速率为375rpm的回转式振荡培养箱中的潮湿的5％(体积/体积)CO2空气中。每孔使用0.4微克的DNA、50微升的培养基(Life Technologies公司，英国)及1.2微升的Lipofectamine(Invitrogen，Life Technologies公司，英国)，并依上述制备。将经转染的细胞留置不同的时间，再计算细胞的数目并收集培养基，以藉由ELISA测定单克隆抗体的滴度。
ELISA
为了测定单克隆抗体的浓度，使用以标准ELISA为基础的方法分析100微升来自瞬时转染的培养上清液(Smales等人，2004Biotechnology Bioengineering 88:474-488)。
统计分析
为了测定培养上清液中的IVC、qP或单克隆抗体浓度在各实验条件与对照组的间是否具有统计上的显著差异，进行学生t检验。当所取得的p值为P<0.05(在95％的信赖水平下)时，变化被认为是显著的。
实施例1：
使用miRCURY LNA微阵列初步鉴定miR靶标
鉴定其表达可能与qP或IVC相关联的miR的初步工作是通过使用市售的miRCURYLNA微阵列方法(Exiqon，丹麦)进行。采取两种方法：
A)第一种方法是比较以分批和喂料-分批模式生长在10升的气升式生物反应器中GS-CHOK1SV细胞株(表达典型的重组嵌合型单克隆抗体，cB72.3)中的miR反应。喂料-分批模式系使用Lonza通用喂养方法(通用方法-第6版)。将GS-CHOK1SV 42细胞株(生产嵌合型单克隆抗体cB72.3)的3个分批模式生物反应器(n＝3)与3个分批喂料模式反应器(n＝3)相比较。在各生长曲线上选择五个采样点(表2)。在1至3个采样点方面，从所有六个生物反应器制备RNA样本(1＝第1次喂料紧前(第1次喂料前)，2＝第1次喂料后48小时且3＝活细胞浓度峰值)。峰值后，未喂料(分批模式)的生物反应器开始降低且未进一步从此组生物反应器采样。另外两个时间点系在第2次喂料后48小时(4＝第2次喂料后48小时)及收获时(5＝收获)从接受喂料的3个生物反应器(分批喂料模式反应器，F17、F18及F19)采样。因此，共采取24个样本并使用miRNeasy试剂盒(Qiagen)，根据生产商的说明从这些样本制备RNA。制备第25个参考样本，其由5微克各来自该24个样本的RNA的混合物所组成。
表2：细胞株“42”在10升气升式生物反应器培养中的生长情况。生物反应器以分批或分批喂料模式进行。注意：在分批培养方面，第9天后未再采样，而在分批喂料培养方面，f1和f2分别表示第一次和第二次喂料。
以Hy3标记样本并以Hy5标记该参考物质，在24miRCURY LNA(锁核酸)微阵列上将各样本对参考物质杂交。此处所呈现的数据为通过ANOVA比较各反应器组所得的miR的均一化中位数比(In(Hy3/Hy5))对数。只有那些p<0.05者(表3)进入双向分层聚类算法(2-wayhierarchical clustering algorithm)。从此分析鉴定出一些显示出在生长阶段之间或喂料过程之间的表达有差异的令人感兴趣的miR集群(含mmu-miR-21、mmu-miR-34b、mmu-miR-34c、mmu-miR-29a、mmu-miR-130a及mmu-miR-193)。在阵列研究中鉴定的miR可能参与控制细胞周期和细胞凋亡。在mmu-miR-34b及mmu-miR-34c的量中可观察到大改变。miR中的mmu-miR-34a、-34b及-34c均密切相关且已知miR-34a为p53导致细胞凋亡及遏制G1的靶标。
表3：通过分批喂料组第12天和参考物质之间的平均倍数变化排列的miR级别。通过ANOVA进行显著性试验并显示出相关的p值。以粗体列出的miR是特别重要的。使用下列微软Excel公式“＝POWER(2，A1)”将各miR的对数中值表达比例转化成变化的倍数，其中A1是包含对数中值均一化表达比例(ln(Hy3/Hy5))的细胞。
B)第二种方法是在具有不同cB72.3单克隆抗体生产率的10种GS-CHOK1SV细胞株小组之间作出的miR谱图。此是通过分析自10种GS-CHO细胞株的一式三份的分批摇瓶培养中所采集的细胞样本来进行，该10种GS-CHO细胞株的分批悬浮培养中具有一定生产率范围的cB72.3单克隆抗体(表4)。
表4：表达cB72.3抗体的10种重组GS-CHOK1SV细胞株的分批悬浮培养中所收获的单克隆抗体的浓度。除了细胞株56之外(其为两个培养的平均值)，数值是三个培养的平均值(±SD)。
从在指数生长期收集的细胞沉淀小丸中提取RNA，并在miRCURY LNA微阵列(Exiqon，丹麦)上进行分析。根据来自分批悬浮培养的cB72.3浓度，将细胞株分级并分成两组相等大小的群组(表4：“低”生产细胞株：153、1、142、54、114；“高”生产细胞株：40、137、149、42、47)。然后，分析各miR的均一化对数中值表达比(In(Hy3/Hy5))以鉴定与生产率的关系。在通过miRCURYTM微阵列分析的在高和低生产组中差别表达的全数miR中，对miR作谱图鉴定出了老鼠基因批注的一组miR子集(15)和人类基因批注的18个miR。制备用于人和老鼠基因批注的热图图表。表5和6中报导从人和老鼠基因批注结果的ANOVA所取得的p值。
表5：在“高”和“低”生产组之间差异调节的miR之间由ANOVA计算的p值。使用miRCURY LNA微阵列在“高”和“低”生产组之间进行老鼠基因批注的分析。特别重要的miR以粗体强调。
探针组 p-值
mmu-let-7b 3.51E-03
mmu-let-7d 7.68E-03
mmu-let-7f 5.80E-03
mmu-miR-137 1.71E-05
mmu-miR-146a 2.05E-03
mmu-miR-15b 3.09E-04
mmu-miR-16 3.24E-04
mmu-miR-186 8.43E-03
mmu-miR-18a 8.06E-03
mmu-miR-19a 1.89E-04
mmu-miR-19b 1.47E-03
mmu-miR-382 1.38E-04
mmu-miR-483 3.23E-03
mmu-miR-711 3.54E-03
mmu-miR-882 9.89E-08
表6：在“高”和“低”生产组之间差异调节的miR之间由ANOVA计算的p值。使用miRCURY LNA微阵列在“高”和“低”生产组之间进行人基因批注的分析。特别重要的miR以粗体强调。
从这些初步微阵列研究鉴定出5种显示增加的表达与生长(miR-21、miR-34c)或生产率(MIR-15b、miR-16及miR-186)有关的miR。
实施例2
在整个分批培养期间及生产单克隆抗体的“高”和“低”生产重组GS-CHOK1SV细胞株中验证内源性miR的表达水平。
依实施例1使用miRCURY LNA微阵列***鉴定出其表达可能与IVC或qP相关的一些miR后，进一步分析四种目标miR，即，miR-15b、miR-16、miR-21及miR-34c对GS-CHOK1SV细胞株中的重组蛋白表达的影响。
通过瞬时转染操纵miR的水平(实施例3至5，使用类似于Jadhav等人(2012Biotechnology and Bioengineering 109:1376-1385)概述的方法)前，首先必须证明微阵列结果与通过qRT-PCR测量的重组GS-CHOK1SV细胞株中的目标miR是一致的。为了达成此目的，选择三种细胞株(实施例1b)以用于进一步分析生产率(表4)和IVC(见第1图)中的不同。在整个培养期间，在箭头所指示的时点采样(每一个时点采取一定数量的细胞)以供分析miR的量等。
使用MirVANA RNA提取试剂盒完成miR提取后，使用市售的两步骤分析试剂盒(Applied Biosystems公司)测定miR的量。为了测定各样本中的成熟miR的浓度，制备各miR的标准曲线。
使用此qRT-PCR，在下列Lonza的生产cB72.3的GS-CHOK1SV细胞株的各批培养中测定GS-CHOK1SV细胞株中的四种目标miR的浓度：GS-CHO42(“高”生产细胞株)及GS-CHO114(“低”生产细胞株)。所取得的数据与微阵列数据相合。第2图至第5图中的数据显示出(A)对β-肌动蛋白归一化及相对于第一天收集的样本的不成熟前miR的量及(B)在不同时点从标准曲线测定的成熟miR的浓度。
在整个分批培养期间，两种测试细胞株中的miR-15b的浓度报告于第2图中。虽然在整个培养期间，两种细胞株中的前miR的量显示出类似的谱图(第2A图)，对于“高”生产细胞株，在120小时和168小时样本中的前miR-15b的量较多。从数据中可知，成熟miR的量在两种细胞株之间的趋势不同，在整个培养期间，“低”生产细胞株中的成熟miR量逐渐降低，而“高”生产细胞株只在培养结束时降低(第2B图)。因此，前miR-15b和成熟miR-15b的量之间没有关系。此数据与微阵列数据一致，其中有些“高”生产细胞株在分批培养的第4天miR-15的量提高。
第3图报告在整个分批培养期间，“高”和“低”生产细胞株中的前miR-16的相对量及miR-16的浓度。在整个培养期间，“高”生产细胞株中存有较“低”生产细胞株多出40-50％的前miR-16-1(第3A图)。两种细胞株的前miR-16的相对量在168小时(对于前miR-16-1)和120小时(对于前miR-16-2)达到峰值(分别为第3A图和第3B图)且其谱图类似于所观察到的对于前miR-15b的结果(第2A图)。然而，再次地，成熟miR-16的谱图与其不同。在两种细胞株中的成熟miR的浓度在培养期间均降低，尽管在“高”生产细胞株中的浓度总是较高(第3C图)。此与微阵列数据相一致，其显示出有些“高”生产细胞株在培养第4天miR-16的量提升。
第4图报告在整个分批培养期间，“高”和“低”生产细胞株中的前miR-21的相对量及miR-21的浓度。在培养时间72至120小时之间，“低”生产细胞株中的前miR-21显示出大量增加，而“高”生产细胞株中的前miR-21的相对量较低，仅在培养的120小时至168小时之间增加(第4A图)。在“低”生产细胞株中，miR-21的浓度增加直到培养时间为168小时，然后在168小时至264小时之间下降，而在“高”生产细胞株中，miR-21的浓度在整个培养期间持续增加(第4B图)。
第5图报告在整个分批培养期间，“高”和“低”生产细胞株中的前miR-34c的相对量及miR-34c的浓度。在前miR-34c及成熟miR-34c方面，“高”和“低”生产细胞株之间可观察到不同的趋势(第5图)。虽然在整个培养期间，两种细胞株中的前miR-34c的相对量显示出类似的谱图(第5A图)，但在“高”生产细胞株中，120小时和168小时的样本中的前miR-34c的相对量较高。在两种细胞株中可观察到，前miR-34c的相对量的谱图反映出成熟miR-34c浓度的谱图。在整个培养期间，“高”生产细胞株中的前miR-34c的量似乎增加，但“低”生产细胞株中所增加者则少得多(第5A图)。“高”生产细胞株中的miR-34c的浓度在培养时间72小时至168小时之间增加，但在264小时的时候再次下降(第5B图)。然而，在“低”生产细胞株中，miR-34c的浓度在培养168小时之前即下降(第5B图)。
因此，成熟miR的qRT-PCR数据大致上与上述的微阵列数据一致。
实施例3至5显示出成熟miR的瞬时过度表达，并证明过度表达可修改所调查的GS-CHOK1SV细胞株的表型，例如比生产率、qP或活细胞浓度的积分IVC。在这些实施例中，依下列段落中的描述，使用以质粒为基础的方法分析miR单独和miR组合的瞬时过度表达。
实施例3
调查表达典型mAb(cB72.3)的重组GS-CHOK1SV细胞株中过度表达的外源性miR的表达水平对生产率的影响
为了确认所调查的miR的功能影响，进行瞬时研究。产生表达人前miR的茎环(侧边邻接适当的前miR基因组序列)的载体，并用于瞬时表达。藉由限制酶切和测序确认预期的序列。据报导，当使用源自CHO的茎环时，miR在CHO细胞中的瞬时表达较高，但亦可使用其他物种来过度表达前miR。然而，过度表达的量较少可能是有益的，因为外源性miR的浓度提升过高可能是有害的。
为了确认这些质粒的功能性，以编码前miR21的表达载体瞬时转染CHOK1SV细胞。通过Northern印迹分析来自对照细胞(以空白质粒转染)及经前miR-21转染的细胞的RNA提取物。以前miR-21构建体瞬时转染的CHOK1SV细胞中的成熟miR-21的量升高(数据未显示)。与成熟miR的水平相比较，所有样本中均观察到相对大量的前miR。此数据显示出载体为功能性且可用于过度表达或“唤醒(knock-out)”研究中。
实施例4：
在6孔盘中瞬时转染及过度表达目标miR
构建四个表达人前miR miR-15b、-16、-21及-34c的茎环的载体。使用这些载体来调查外源性miR对验证微阵列数据(实施例4)时所使用的“低”和“高”生产细胞株的qP及IVC的影响。在第一组实验中，在静态模式培育箱中，以6孔盘格式生长细胞并以过度表达载体转染。各载体对转染后所测定的qP和IVC的影响呈现于第6图中。
在此细胞培养格式中，miR-15是唯一一种增加50％IVC(与空白转染相比较)的外源表达的miR，且仅在“高”生产细胞株中发生(第6A图)。在qP方面，仅外源表达的miR-34c使其显著增加(与空白转染相比较)，此发生在“低”和“高”生产细胞株中(第6B图)。这表明miR-34c可能对准该涉及决定“高”和“低”生产细胞株中共有的qP的过程。
通过在相同的两个生产单克隆抗体的GS-CHOK1SV细胞株(本次生长在96孔深孔摇动盘中的悬浮培养中)中瞬时表达过度表达载体来进一步分析这些miR的作用。由于本专利中所描述的所有GS-CHOK1SV细胞株均生长在悬浮培养中，此种培养模式更适合这些细胞株且更接近生产过程。
实施例5：
在96孔深孔摇动盘中瞬时转染及过度表达目标miR
为了评估miR的过度表达及miR组合的过度表达在更近似生物反应器的环境中的影响，在96孔深孔摇动盘中进行实验。以编码一种miR的单个载体分别在悬浮液中瞬时转染生产cB72.3单克隆抗体的GS-CHOK1SV细胞株，或以组合二或三种编码miR的载体共同转染。在单次转染方面，在转染后48小时采取细胞和培养基的样本，在转染后48小时采取或96小时采取共同转染的样本。在每次转染时，测定生长(IVC)及产品滴度(藉由LISA测定)。使用三种不同的生产cB72.3的GS-CHOK1SV细胞株来测定是否有任何所观察的影响为细胞株特异性：“高”和“低”生产细胞株，分别为CHO 42和CHO 114，加上被视为“中等”生产细胞株的CHO-56。
(i)CHO42(“高”单克隆抗体生产株)
以编码前miR-34c及前miR-15b、前miR-15b及前miR-16、或前miR-16和前miR-34c的分开载体瞬时共同转染CHO 42细胞，全部均显示在转染后96小时，培养基中的单克隆抗体的浓度为统计上显著增加(分别为20.77％、33.24％和38.7％)(第7图)。
(ii)CHO56(“中等”单克隆抗体生产株)
以编码前miR-15b及前miR-16、前miR-16及前miR-34c或前miR-15b的分开载体瞬时共同转染CHO 56细胞，前miR-16及前miR-34c显示出在转染后96小时，培养基中的单克隆抗体浓度为统计上显著增加(分别为58.7％、57.8％及71.1％)(第8图)。
(iii)CHO114(“低”单克隆抗体生产株)
在CHO 114细胞株的情况中，只有那些以编码前miR-34的载体转染者显示出在转染后48小时，培养基中的单克隆抗体的浓度为统计上显著增加(第9A图)。然而，至转染后96小时，所有共同转染组合均显示出分泌到培养基中的单克隆抗体浓度为不同程度的统计学上显著增加(第9B图)。
在不同细胞株中的瞬时研究的组合数据显示出任一前miR-15b、前miR-16或前miR-34c的任何单独过度表达、或这些前miR的组合的过度表达可影响一或多种具有不同生产率的生产该相同单克隆抗体的细胞株中的重组单克隆抗体的表达。
为了进一步调查，从经遗传工程处理以稳定地过度表达单独的前miR的CHOK1SV宿主细胞中产生此转染子汇集体。
实施例6：
产生经遗传工程处理，以稳定地过度表达单独miR的CHOK1SV宿主汇集体
在CHOK1SV宿主细胞中(Lonza Biologics)创建过度表达单独前miR的转染子汇集体。为了达成此点，使用额外含有嘌呤霉素选择标记的编码各种前miR的上述载体。藉由电穿孔法将这些载体转染入Lonza CHOK1SV宿主细胞株中，再在含有嘌呤霉素的培养基中选择。分析抗嘌呤霉素的汇集体的生长(第10图)及miR含量(第11图)以确认在汇集体中特定成熟miR(即，该由转染的载体以前miR形式编码者，其再由细胞加工处理成成熟miR形式)的量升高。在分批培养期间，与对照汇集体(即，以含有嘌呤霉素标记，但不编码前miR的同一载体分开转染的CHOK1SV)相比较，汇集体的生长特性没有显著差别。然而，与对照汇集体及原始CHOK1SV宿主相比较，在所有汇集体中，各汇集体中的特定miR(与用于创建该汇集体的编码前miR的载体有关)的浓度增加2至3倍(第11图)。
为了测试该表达外源性miR-34c的汇集体的性能，以3'-UTR中具有或不具有海绵序列(即，互补或几乎互补的miR目标序列；Ebert M.S.等人，2007Nature methods 4：721-726)的荧光素酶报告基因将其瞬时超转染(第12图)。由于该汇集体中的miR-34c的水平显示出有所提刊，这将导致报告基因活性较对照组低。亦以编码miR-34c的相同的载体(用于创建该汇集体)将该稳定的汇集体瞬时超转染，以测定其对报告基因活性是否有任何进一步的影响。如第12图所示，当将荧光素酶报告基因转染入该miR-34c表达汇集体时，该miR-34c序列的表达导致荧光素酶的表达降低大约65％，此与过度表达的前miR-34c被加工成成熟miR-34c的过程相一致。当将额外的编码前miR-34c的载体转染入汇集体时，仅当该荧光素酶报告基因转录盒中存有目标序列时能观察到荧光素酶报告基因的表达进一步减少(第12图)。与对照细胞株相比较，仅前miR-34c稳定汇集体中的报告基因活性升高。此观察与miR-34c在生产单克隆抗体的细胞株中瞬时过度表达时所观察到的结果相一致，其中观察到培养基中的单克隆抗体的浓度增加。这些结果显示出前miR-34c过度表达会导致转基因表达增加(经由细胞来成功地将外源性前miR-34c加工为成熟miR-34c)，且CHOK1SV细胞有能力将前miR-34c加工成功能性成熟miR-34c(藉由特异于成熟miR的qRT-PCR分析测定)。

Claims (17)

1.一种于哺乳动物生产细胞中生产感兴趣蛋白的方法，其包含下列步骤：
a)提供哺乳动物生产细胞，
b)增加步骤a)所提供的哺乳动物生产细胞中至少一种选自由miR-15、miR-16及miR-34所组成的群组的miR的浓度，从而取得生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，
c)在适合生产感兴趣蛋白的条件下培养所述生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，及
d)回收步骤c)所生产的感兴趣蛋白。
2.一种用于制备生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞的方法，所述哺乳动物生产细胞能表达感兴趣蛋白，所述方法包含下列步骤：
x)提供哺乳动物生产细胞，
y)增加步骤x)所提供的哺乳动物生产细胞中至少一种选自由miR-15、miR-16及miR-34所组成的群组的miR的浓度，从而取得生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，及
z)回收步骤y)所生产的生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述miR-15为miR-15a或miR-15b。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述miR-34为miR-34a、miR-34b或miR-34c。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述至少一种miR的浓度的增加系藉由以至少一种选自由下列所组成的群组的miR转染步骤b)或y)的哺乳动物生产细胞：miR-15、miR-16及miR-34。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中通过以至少一种含有编码至少一种miR的核苷酸序列的载体转染步骤b)或y)的哺乳动物生产细胞，增加了所述至少一种miR的浓度，所述编码至少一种miR的核苷酸序列受至少一种允许所述至少一种miR过度表达的调控原件控制，其中所述至少一种miR系选自由下列所组成的群组：miR-15、miR-16及miR-34。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中转染至少两种所述miR或至少两种编码至少两种所述miR的核苷酸序列。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述miR为成熟miR、前体miR或初级miR。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述至少一种编码步骤b)或y)的所述至少一种miR的载体系经瞬时或稳定转染。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中在步骤a)或x)之前或在步骤b)或y)期间以编码感兴趣蛋白的核苷酸序列转染所述哺乳动物生产细胞。
11.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中以编码感兴趣蛋白的核苷酸序列转染在步骤b)或y)之后取得的生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物生产细胞为CHO细胞、CHO-K1细胞或CHO-K1SV细胞。
13.如前述任一项权利要求所述的方法，其中允许所述至少一种miR过度表达的调控原件为启动子。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞为显现比生产率增加或活细胞浓度的时间积分增加或所述两者均增加的细胞。
15.一种根据权利要求2-14任一项的方法所生产的生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞。
16.一种生产蛋白的经遗传工程处理的哺乳动物生产细胞，其包含至少一种编码至少一种miR的转基因核酸序列，所述转基因核酸序列在至少一种允许所述至少一种miR过度表达的调控原件的控制下瞬时或稳定地并入所述细胞的基因组，其中所述至少一种miR选自由下列所组成的群组：miR-15、miR-16及miR-34。
17.一种用于在哺乳动物生产细胞中生产感兴趣蛋白的试剂盒，其包含至少一种哺乳动物生产细胞、至少一种含有编码至少一种miR的核苷酸序列的载体及用于以所述至少一种载体转染至少所述一种细胞的物品，其中所述编码至少一种miR的核苷酸序列受至少一种允许所述至少一种miR过度表达的调控原件控制，其中所述miR选自由下列所组成的群组：miR-15、miR-16及miR-34。
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