CN105838773A - 一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法 - Google Patents

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谷洁
张凯煜
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Abstract

一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，将甲酚红、氯化钾和碳酸氢钠溶于无二氧化碳水配置成溶液，然后加入琼脂得到混合显色剂；把葡萄糖溶于无二氧化碳水中制成有机碳源母液；将土壤污染物质标准品溶于无二氧化碳水中制备母液按稀释梯度进行稀释；将混合显色剂在无菌工作台内加入孔微平板每个孔内，制成检测板，通风干燥后于4℃保存；将制备的有机碳源和污染物质母液分别加入另一个微平板孔内，制成反应板；在反应板中每孔加入0.35g土壤，将检测板紧扣反应板上，25℃条件下培养6h，将检测板取下在酶标仪上读取吸光值；采用本发明方法制备的土壤生态毒性测试板具有使用方便、快速、测试结果准确等特性。

Description

一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法
技术领域
本发明属于毒性检测技术领域，特别涉及一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法。
背景技术
长期以来，土壤面临着各种污染物的威胁。土壤微生物作为土壤中物质转化的重要驱动者，在维持土壤养分循环、污染物分解等方面具有不可替代的作用。可以说，土壤微生物在一定程度上指示了土壤乃至整个生态***的健康状况。长期以来人们多采用反映群落功能、活性和数量的指标，例如群落多样性、酶活性、生物量，以及针对不同功能菌群采用的功能指标如硝化势等，并以这些指标在数量上的大小变化来评价污染的生态学效应和污染程度。事实上这些指标不能全面反映污染物对土壤微生物的生态影响。
微平板法是一种在微平板上通过污染物质对土壤呼吸所产生CO2的变化来评价污染物质对土壤的生态毒性的方法。目前对于微平板法最常用方法有两类，一是基于土壤菌液的检验法，主要方法为Biolog ECO微平板法。虽然该方法操作比较简单，但是由于该方法基于土壤菌液，所以该方法仅适用于检验土壤中污染物对细菌的影响，存在一定的局限性，且该方法至少需要培养7天对整体结果会产生一定的影响。二是基于原始土壤的检验法，该方法主要是通过检测土壤呼吸作用产生的CO2的量的变化来反映污染物对土壤微生物的生态毒性。需采用气相色谱进行测定，对于实际应用来说不够经济。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，能够降低污染土壤样品在生态毒性检测过程中的误差、减少测试时间和经济成本、扩大测试范围、更加准确的评价污染物质对土壤的真实毒性，具有很大的科学和应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
1)配制混合显色剂：
将甲酚红、氯化钾和碳酸氢钠溶于无二氧化碳水配置成溶液，然后加入琼脂得到混合显色剂；每升无二氧化碳水中使用：甲酚红18.75mg、氯化钾16.77g、碳酸氢钠0.315g和琼脂30g。
2)把葡萄糖(D-glucose)溶于无二氧化碳水中，从而制成有机碳源母液，其浓度为30mg·C·mL-1；
3)将土壤污染物质标准品溶于无二氧化碳水中制备母液，按0.5×的稀释梯度进行稀释；
4)将1)中所制备的混合显色剂在无菌工作台内利用多孔移液器添加到经过高温灭菌的孔微平板内，制成检测板，通风干燥后于4℃保存。
5)将2)3)所制备的有机碳源和污染物质母液分别用自动移液器转移至另一个经过高温灭菌的孔微平板内，制成反应板。
6)在5)所制备的反应板中每孔加入0.35g土壤(干重)。
7)将4)中制备的检测板紧密的扣在6)中制备的反应板上，在25℃条件下培养6h，将检测板取下在酶标仪上读取吸光值。
所述步骤3)中，根据被测土壤的主要污染物，选择污染物种类。
所述步骤4)中，混合显色剂每次加入量为150μL。
所述步骤5)中，有机碳源母液先加入且加入量为25μL，污染物质母液加入量为25μL。
所述微平板为96孔微平板。
酶标仪读取吸光值时波长为590nm。
根据所述剂量-反应关系，计算出污染物对微生物的EC50。具体地，将得到的浓度效应数据用origin软件进行模拟，方程的表达式如下:
y＝A1+(A2-A1)/(1+10((logEC50-log x)×slpoe))。
式中，A1和A2分别为检测板培养6h后最小吸光值和最大吸光值，x为反应板中进入污染物的浓度，slpose为拟合曲线的斜率。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明利用原位土壤检测法实现对污染土壤中污染物质对细菌、真菌、放线菌生态毒性的同时进行检测，较之于传统使用土壤悬浊液只能检测污染物对细菌的生态毒性能更加全面客观地反映污染物对土壤中微生物的生态毒性。
2、本发明检测土壤样品中污染物的生态毒性快速、灵敏，相比较传统使用Biolog微平板法需要培养144h-168h，本发明只需25℃培养6h。并且对于土壤微生物而言培养时间亦可影响其检测结果，本发明缩短了土壤微生物的培养时间，从而降低了检测结果的误差，更加客观地反映污染物对土壤微生物的真实生态毒性。
3、本发明检测土壤样品中污染物的生态毒性更加经济，减少成本开支。从测试成本考虑避免了采用传统方法中昂贵的Biolog微平板，节约了成本开支；从测定方法考虑本发明所采用的测定方法仅需要可以测定96孔的酶标仪，避免了传统方法中使用GC-MS测定CO2环节,节省了高额的测试费用。
附图说明
图1是本发明所用的孔微平板结构示意图，为96孔，体积为2ml，分为A、B两板，其中A板为加入显色剂的显色板。B板1-12列为12个稀释梯度，A-H行为12个稀释梯度的8个平行。
图2是本发明检测板与反应板紧扣在一起的结构示意图。
图3为Biolog微平板测试结果。
图4为本发明测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
实施例1
一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，选取常年施用含Cu污泥土壤(A)及撂荒土壤(B)进行对比来确定本发明的可行性。再依次进行以下步骤：
1)配制混合显色剂：
将甲酚红18.75mg、氯化钾16.77g、碳酸氢钠0.315g溶于1L无二氧化碳水配置成溶液，然后加入30g琼脂得到混合显色剂；
2)将上述所制备的混合显色剂在无菌工作台内利用多孔移液器添加到经过高温灭菌的96孔微平板内，制成检测板，通风干燥后于4℃保存。96孔微平板的结构如图1所示。
3)把葡萄糖(D-glucose)溶于无二氧化碳水中，从而制成有机碳源母液，其浓度为30mg·C·mL-1；
4)将土壤污染物质重金属Cu(CuSO4)溶于无二氧化碳水中制备最大浓度为6000mg/L母液，按0.5×的稀释设置12个梯度进行稀释，且每个浓度设置八个平行；
5)将3)4)所制备的有机碳源和污染物质母液分别用自动移液器转移25uL至另一个经过高温灭菌的孔微平板内，制成反应板。
6)在5)所制备的反应板中每孔加入0.35g土壤(干重)。
7)将4)中制备的检测板1紧扣在6)中制备的反应板2上，如图2所示，图中，混合显色剂3位于检测板1的孔中，反应板2的孔中为土壤、污染物和有机碳源的混合物4。然后在25℃条件下培养6h，将检测板取下在酶标仪上读取吸光值。
为了证明本发明的优点，分别采用制作的检测板与Biolog ECO微平板对上述土壤进行对比试验：
速检验污染土壤生态毒性测试板培养6h后进行检测，Biolog ECO微平板培养144h后进行检测。培养后选取9个梯度结果拟合污染物剂量—效应关系曲线，如图3和图4所示。
结果表明，应用Biolog ECO微平板(图3)检测两种土壤的半数效应浓度无明显差异，而应用本发明的生态毒性测试板(图4)结果产生明显差异。可以看出本发明的生态毒性测试板与Biolog ECO板相比，检测快速且结果更加可靠。
实施例2
一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，依次进行以下步骤：
1)配制混合显色剂：
将甲酚红18.75mg、氯化钾16.77g、碳酸氢钠0.315g溶于1L无二氧化碳水配置成溶液，然后加入30g琼脂得到混合显色剂；
2)将上述所制备的混合显色剂在无菌工作台内利用多孔移液器添加到经过高温灭菌的96孔微平板内，制成检测板，通风干燥后于4℃保存。
3)把葡萄糖(D-glucose)溶于无二氧化碳水中，从而制成有机碳源母液，其浓度为30mg·C/mL；
4)将土壤污染物质重金属Cu(CuSO4)溶于无二氧化碳水中制备最大浓度为6000mg/L母液，按0.5×的稀释设置12个梯度进行稀释；
5)将3)4)所制备的有机碳源和污染物质母液分别用自动移液器转移25uL至另一个经过高温灭菌的孔微平板内，制成反应板。
6)在5)所制备的反应板中每孔加入0.35g土壤(干重)。
7)将4)中制备的检测板紧密的扣在6)中制备的反应板上，在25℃条件下培养6h，将检测板取下在酶标仪上读取吸光值。
为了证明本发明的优点分别采用已制作的生态毒性测试板与传统采用GC-MS测定土壤呼吸CO2的方法进行对比，结果表明两种方法所得土壤样本半数效应浓度差异较小，可以看出本发明可以节省测试成本、简化复杂的测试方法并且所得结果可靠。

Claims (9)

1.一种快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配制混合显色剂：
将甲酚红、氯化钾和碳酸氢钠溶于无二氧化碳水配置成溶液，然后加入琼脂得到混合显色剂；
2)把葡萄糖(D-glucose)溶于无二氧化碳水中制成有机碳源母液；
3)将土壤污染物质标准品溶于无二氧化碳水中制备污染物质母液并进行稀释；
4)将步骤1)所制备的混合显色剂在无菌工作台内利用多孔移液器添加到经过高温灭菌的孔微平板内，制成检测板，通风干燥后于4℃保存；
5)将步骤2)制备的有机碳源母液和步骤3)制备的污染物质母液分别用移液器转移至另一个经过高温灭菌的孔微平板内，制成反应板；
6)以干重计，在步骤5)制备的反应板中每孔加入0.35g土壤；
7)将步骤4)制备的检测板紧扣在步骤6)得到的反应板上，在25℃条件下培养6h，将检测板取下在酶标仪上读取吸光值；
8)采用线性模型拟合法，建立污染物不同浓度与吸光值的剂量-反应关系。
2.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，每升无二氧化碳水中使用：甲酚红18.75mg、氯化钾16.77g、碳酸氢钠0.315g和琼脂30g。
3.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，有机碳源母液中葡萄糖浓度为30mg·C/mL。
4.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，按0.5×的稀释梯度进行稀释。
5.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，根据被测土壤的主要污染物，选择污染物种类。
6.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，混合显色剂每次加入量为150μL。
7.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，有机碳源母液先加入且加入量为25μL，污染物质母液加入量为25μL。
8.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，所述微平板为96孔微平板。
9.根据权利要求1所述快速检验污染土壤生态毒性测试板的制备方法，其特征在于，酶标仪读取吸光值时波长为590nm。
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