CN102495213A

CN102495213A - 一种检测植物病菌的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102495213A
Application number: CN2011103895397A
Authority: CN
Inventors: 高文娜; 刘颖昳; 蒋兴宇; 黄魁建
Original assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Current assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2012-06-13

Abstract

本发明公开了一种检测植物病菌的试剂盒及检测方法，该试剂盒包括微流控芯片、植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗、植物病菌阳性对照和显色底物；其中，所述微流控芯片包括芯片底板、设有管道的微流控芯片基片和径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜。该试剂盒可以快速完成多种植物病菌的检测，而且使用的试剂和样品的量均非常少，节约检测成本。

Description

一种检测植物病菌的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种检测植物病菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

出入境植物种子苗木检测十分重要，植物病害又以潜隐性、调运传播风险高成为口岸检测重点。但一直以来，口岸植物种子苗木病害的检测是个难题，原因有：1. 口岸检测的目标是流通商品，有检测时限的要求，但植物病害的潜隐性、不表现症状等特点决定检测需要时间长；2.植物病害带菌（毒）量低，所以要求检测技术水平高，检测方法的灵敏度高；3.病害检测一个项目需要较长的时间，一般一个样品还要求同时检测几个病害项目，劳动强度和工作量大；4. 植物病害不同的检测项目需不同的操作，对检测人员技术水平要求高（需较深厚的专业知识背景和较高技术操作水平）5. 植物病害检测项目繁多，不同检测项目需购买大量不同的检测试剂，试剂花费高。

近年来，植物种子苗木病害的检测难题有加剧的趋势。口岸植物种子苗木进出口贸易量的大量增长，检测样品批次已逐年大批量增加，而且从2009年初开始，国家对高经济附加值的种子、苗木进口商品的审批法检项目增强了检疫力度，一个样品由原本几个法定检测项目，增加到十几种甚至数十种。这样花费更多的时间、更多的试剂、更复杂的人工操作、提高了工作强度并大大加大了工作量。目前的检测方法中，对植物细菌的免疫检测中，包括ELISA试剂盒和试纸条等常规检测手段，都只能同时检测一个样品的一个项目，无法提高通量。

在口岸“快速通关”的要求下，面临这些问题，必须寻找一种高通量、花费少、节约人员劳动力和试剂，并且可以同时检测一个样品的多个法定检测项目，以加速口岸的通关速度，提高口岸的检测水平、更有效防控外来生物尤其是潜隐性病害的入侵。

微流控技术由于其体积小，样品用量小，并且可以简单实现高通量的特点，可以方便快速的应用于免疫检测中，使用微流控技术可以高通量快速的完成多个样品的多个参数同时检测。微流控芯片具有多个平行管道，各个管道中可通入不同的蛋白，那么在第二方向上通入的蛋白就可同时与多种不同的蛋白进行反应，从而达到高通量，高信息量检测的目的。

纳米技术在进二十年内飞速发展，我国的纳米技术在世界处于领先地位，但是纳米技术相关的研究多集中于基础科研，在实际生产生活中的应用仍很不足。原因是由于纳米科技领域相关的研究与实际应用直接的合作和交流不足。无法将先进技术转化为实际应用，得到更高的社会经济价值。

本发明将具有纳米结构的薄膜结合到微流控芯片中，利用薄膜的纳米结构表面具有较大的比表面积，在上面吸附蛋白和发生免疫反应，再利用微流控的高集成度，实现高通量的免疫检测分析，初步应用于口岸植物病菌检测的研究中。目前，国内外还没有关于使用以纳米结构的薄膜作为基底的微流控芯片检测植物病菌的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测植物病菌的试剂盒，该试剂盒可以快速完成对多种植物病菌的检测，而且使用的试剂和样品的量均非常少，节约检测成本。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种使用本发明所述试剂盒检测植物病菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种检测植物病菌的试剂盒，该试剂盒包括微流控芯片、植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗、植物病菌阳性对照和显色底物；其中，所述微流控芯片包括芯片底板、设有管道的微流控芯片基片和径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜。

进一步地，所述植物病菌为玉米细菌性枯萎病菌、通用型瓜类细菌性果斑病、马铃薯环腐病菌、番茄细菌性溃疡病菌或洋葱腐烂病菌中的一种或几种。

进一步地，所述显色底物为四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。

进一步地，所述芯片底板和微流控芯片基片的材料均为聚二甲基硅氧烷。

本发明还一种使用权利要求1所述试剂盒检测植物病菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）芯片组装

将径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜平整放置在芯片底板上，所述滤膜与芯片底板之间没有气泡，然后将设有管道的微流控芯片基片放置在所述径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜上，所述微流控芯片基片与滤膜之间没有气泡；

（2）使用PBS溶液分别稀释植物病菌的阳性对照和植物病菌样品，然后将稀释后的溶液分别通入微流控芯片基片的管道，孵育5-60分钟，形成植物病菌阳性对照及样品条带，孵育结束后抽出溶液，将上层微流控芯片基片揭下；

（3）在所述径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜上滴上封闭溶液，封闭10-60分钟，然后将封闭溶液洗去，所述封闭溶液为5%BSA；

（4）在垂直于步骤（2）所述的植物病菌阳性对照及样品条带上放置另一个微流控芯片基片，然后向管道内通入相应植物病菌抗体，孵育5-60分钟，孵育结束后抽出抗体溶液，将上层微流控芯片基片揭下；

（5）在所述径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜上滴上特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记二抗，孵育5-60分钟，将二抗溶液洗去，最后使用显色底物显色；

（6）在显微镜下观察和拍摄图像。

本发明的有益效果：

1.检测时间：原有ELISA试剂盒检测方法中检测每一步孵育时间至少需要30分钟到1小时，芯片检测可以将这个过程缩短到每一步5分钟到10分钟。

2.检测试剂用量：使用微流控芯片所需要的样品和试剂量为1微升（常规ELISA实验为100微升），试剂（检测抗体）浓度为常规ELISA实验浓度的10倍，使用常规试剂量的1/10可以进行多个细菌样品的检测。成本降低为常规ELISA的1/50。试剂用量少对于样品的优点在于某些珍贵样品可以只用很少的量得到结果，对于抗体试剂的优点在于可以比较少的试剂用量可以减少昂贵试剂的使用量从而降低成本。

3. 检测集成度：管道可以设计成任意的数量（1到100或者更多），由于交叉点阵反应，第二次加上的芯片可以确定检测参数的量（1到100或者更多），所以可以根据检测需求做成同时检测多个样品的多个参数。

4. 本发明所述试剂盒，可以同时进行多种植物病菌的检测，也可以针对一种植物病菌，测定不同来源的样品。

附图说明

图1微流控芯片管道设计图；

图2五种植物病菌在微流控芯片上的检测结果。

具体实施例方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

试剂：

1. 玉米细菌性枯萎病菌（erwinia stewartii）抗体试剂盒,包括玉米细菌性枯萎病菌抗体，AP（碱性磷酸酶）标记二抗，玉米细菌性枯萎病菌阳性对照；

通用型瓜类细菌性果斑病(西瓜果斑，Acidovorax avenae subsp. Citrulli) 抗体试剂盒，包括通用型瓜类细菌性果斑病抗体，AP标记二抗，通用型瓜类细菌性果斑病阳性对照；

马铃薯环腐病菌（clavibacter michiganensis subsp. sepidonicus）　抗体试剂盒，包括马铃薯环腐病菌抗体，AP标记二抗，马铃薯环腐病菌阳性对照；

番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）抗体试剂盒，包括番茄细菌性溃疡病菌抗体，AP标记二抗，番茄细菌性溃疡病菌阳性对照；

洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv.alliicola）抗体试剂盒，包括洋葱腐烂病菌抗体，AP标记二抗，洋葱腐烂病菌阳性对照；

上述试剂盒均购于安德珍生物技术有限公司（www.adgen.com）；

2. 洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv.alliicola）阳性对照，玉米细菌性枯萎病菌（erwinia stewartii）阳性对照，通用型瓜类细菌性果斑病(西瓜果斑，Acidovorax avenae subsp. Citrulli) 阳性对照，马铃薯环腐病菌（clavibacter michiganensis subsp. sepidonicus）阳性对照，番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）阳性对照，北京市出入境检验检疫局；可购于安德珍生物技术有限公司（www.adgen.com）

3. 磷酸缓冲液（PBS, pH=7.2-7.4）作为蛋白溶液稀释液，加入了0.1%Tween的磷酸缓冲液（PBST, pH=7.2-7.4， 0.1%Tween 20）作为蛋白溶液稀释液，5% BSA溶液（溶解在PBS里面）。

4. 显色底物：NBT/BCIP（四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐）购买来源：Sigma公司

实施例1芯片制备和组装部分

1. 微流控芯片基片结构的设计及掩膜打印

所述微流控芯片基片的材料为PDMS（polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷）。

用软件L-edit绘出芯片基片中所需管道结构。本实验使用的微流控芯片基片规格如下表，芯片管道结构图见图1：

表1 微流控芯片管道规格表

规格编号	管道宽度（μm）	管道中心间距（μm）	管道最大长度（cm）
				1	150	1100	2.0

把设计好的图形送去专业胶片打印公司打印成胶片，作为下一步实验用的掩膜。由于光刻过程需使用SU8负光刻胶，管道结构部分需要透光。因此所打印的胶片掩膜上，管道是透明的，非管道区域是黑色不透光的。

2. 微流控芯片模板的制备

制备的主要过程为光刻，即利用光刻胶在紫外线照射下可改变性质的特点制作与掩膜上的图形完全一致的光刻胶模板。光刻需要在特定的超净间中进行。

2.1 仪器及试剂用品

仪器：紫外曝光机，甩胶机，加热板，烘箱（DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱）

试剂及用品：SU-8 2025光刻胶及其配套显影液（USA Clariant Corporation），5寸或3.5寸硅片（Luoyang Monocrystal Silicon Company）

2.2 实验步骤

（1）取出一片新的5寸硅片，用甩胶机在硅片上甩出厚度约为40μm的光刻胶（SU-8 2025, 2000rpm, 30s）。此时，硅片表面光刻胶厚度均匀，表面平滑。

（2）前烘，放入烘箱后由65℃升至95℃，保持10min。

（3）将表面上有一层光刻胶的硅片放在紫外曝光机内，放上之前准备好的胶片，图形打印面朝下。用石英玻璃将其紧压于光刻胶层上，调整位置使图形位于硅片中间，固定好。

（4）打开仪器进行曝光，曝光时间为120s。

（5）取下胶片掩膜，取下硅片，后烘，步骤同（2）。

（6）显影：将硅片放入显影液中，洗去没有反应的光刻胶，反复冲洗干净后，用氮气吹干。未洗去的光刻胶即呈所设计的结构，突起于硅片上，形成模板。经过硅烷化处理后，模版可在较长的一段时间内反复使用。

3. 微流控检测管道和芯片底板的制备

3.1 软刻蚀得到微流控管道和芯片底板

PDMS（polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷）是一种透明的硅橡胶，在普通的状态下是透明而粘稠的液体，经与固化剂反应（184 silicone elastomer curing agent）并加热后可固化。利用PDMS可以将硅片模板上的突起图形转换为对应的管道图形，从而得到微流控管道。

3.2 仪器及试剂用品

仪器：电子天平（YP-6001型），真空泵（2XZ-4型旋片真空泵），烘箱（DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱）

试剂及用品：PDMS单体（184 silicone elastomer, SYLGARD company），固化剂（184 silicone elastomer curing agent, SYLGARD company），玻棒，一次性杯，Scotch白胶带，注射器（带针头，已磨平）

3.3 实验步骤

（1）根据所需的量称取PDMS单体，以质量比10：1称取固化剂并混合，搅拌约10min至均匀。在真空泵中减压抽净气泡。

（2）在具有微流管道的硅片模板上倒入PDMS和固化剂的混合物，抽净气泡。

（3）放入烘箱中70℃，两小时，至固化；或者80℃一小时至固化。硅片上的突出的光刻胶会将PDMS印上凹槽形管道。

（4）将此固化的PDMS从模板上切下，并在设计好的进样口处用带针头的注射器打孔。用Scotch白胶带清洁PDMS管道面。

（5）在平整的培养皿中倒入混合好的PDMS和固化剂混合物，抽净气泡，热固化后得到平整的PDMS平板，作为芯片的底板使用。

4. 具有纳米结构薄膜

表面具有200纳米孔的径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜购买于Whatman公司，型号为：110606. 25 mm直径，100片/盒，所购得的径迹刻蚀聚碳酸酯为表面光滑的白色聚碳酸酯滤膜，表面具有200纳米使用径迹刻蚀的方法得到的柱形孔洞。

5. 芯片组装方法

将购买的径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜平整放置在一片PDMS平板上，滤膜与PDMS平板之间没有气泡，将制备的五管道PDMS芯片基片放置在聚碳酸酯滤膜上，PDMS芯片基片与滤膜之间没有气泡。另一个五管道PDMS芯片基片下一步使用。

实施例2 试剂盒的组成

采用实施1所述方法制备并组装好微流控芯片。

检测洋葱腐烂病菌的试剂盒组成，包括：微流控芯片、植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗、植物病菌阳性对照和显色底物；其中，所述微流控芯片包括芯片底板、设有管道的微流控芯片基片和径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜。

本实施例中所述试剂盒是针对以下5种植物病菌：玉米细菌性枯萎病菌、通用型瓜类细菌性果斑病、马铃薯环腐病菌、番茄细菌性溃疡病菌和洋葱腐烂病菌。

所述显色底物为四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。

上述所述植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗和植物病菌阳性对照可以通过购买获得，也可以利用现有技术中已知的方法制备获得。

实施例3五种植物病菌检测方法建立

1. 要进行检测的植物病菌的种类

洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv.alliicola），玉米细菌性枯萎病菌（erwinia stewartii），通用型瓜类细菌性果斑病(西瓜果斑，Acidovorax avenae subsp. Citrulli)，马铃薯环腐病菌（clavibacter michiganensis subsp. sepidonicus），番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）。

2. 植物病菌培养

使用的培养基配方均为（1L）：牛肉胨：1.0 g，酵母提取物：2.0 g，蛋白胨：5.0 g，NaCl：5.0 g，琼脂（配固体培养基用）：15 g，KH₂PO₄：0.45 g，Na₂HPO₄·12H₂O：2.39 g，调节pH到6.8，最佳生长温度：28 ℃。

3. 菌液样品的制备

将1ml摇培过夜的菌液（OD值为0.7-0.8）进行离心，5000r/min, 20分钟，将上层清液弃去（主要为培养基），将菌液使用PBS洗涤两次，每次1ml, 5000r/min, 20分钟. 将菌液均匀分散在100微升PBS中。此时，菌的浓度大致为10⁸个/ml， 4℃保存。

灭活的菌液制备：将洗过的菌液在100℃煮沸20分钟。最后所有的菌液一律121℃（0.1MPa），30 min灭活。相关容器等泡健之素灭菌。

4.二维检测模型点阵检测实验

点阵检测是微流控技术中一种独特的高通量、高信息量的检测方法。本实验所谓的点阵检测，即指利用微流控芯片基片在聚碳酸酯滤膜的一个方向上通入一种蛋白质，吸附于膜上形成条带；再换垂直方向同样通入另一种蛋白质，从而在两个方向蛋白条带的交叉处发生反应，并形成点阵。微流控芯片具有多个平行管道，各个管道中可通入不同的蛋白，那么在第二方向上通入的蛋白就可同时与多种不同的蛋白进行反应，从而达到高通量，高信息量检测的目的。

5. 使用实施例2所述的试剂盒建立5种植物病菌的检测方法，如下：

a．将五种病菌的阳性对照事先使用PBS溶液进行稀释，到工作浓度分别将五种菌通入五个管道，每个管道使用的样品为2微升/管道，方法是使用移液器将2微升样品放入管道的一个进样口，在另一个口使用注射器抽真空，液体样品会被吸入管道并且充满管道；两个芯片同时检测作为平行，消耗每个浓度的菌液阳性样品共4微升。孵育10分钟作为固定方式。孵育结束后抽出溶液，将上层PDMS芯片揭下。

b. 在聚碳酸酯滤膜基底上滴上200微升5%BSA溶液用于封闭。30分钟后洗去（PBST冲洗一遍，PBS冲洗一遍）。

c.在垂直方向上放入5管道芯片基片，依次在每个管道通入相应植物病菌的抗体，每个管道一种菌，然后溶液体积为1微升；两个芯片同时检测，消耗每个浓度的抗体共2微升。孵育10分钟进行免疫反应。孵育结束后抽出抗体溶液，将上层PDMS芯片揭下。

d. 在聚碳酸酯滤膜基底上滴上100微升AP标记的羊抗兔IgG二抗，浓度为1:400，PBS稀释，孵育10分钟。将二抗溶液洗去（PBST冲洗一遍，PBS冲洗一遍）。（试剂消耗：0.5微升AP标记二抗稀释到1:400，两个平行共使用200微升二抗）,最后使用AP显色底物NBI/BCIP显色。

e. 在显微镜下观察和拍摄图像。

5. 实验结果

对五种菌的检测条件进行优化以后，选择各个菌的优化条件：对于通用型瓜类细菌性果斑病(西瓜果斑，Acidovorax avenae subsp. Citrulli)，检测抗体浓度为抗体原液使用PBS稀释为1：160；马铃薯环腐病菌（clavibacter michiganensis subsp. sepidonicus），检测抗体浓度为抗体原液使用PBS稀释为1：40；对于洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv.alliicola），检测抗体浓度为抗体原液使用PBS稀释为1：320；对于玉米细菌性枯萎病菌（erwinia stewartii），检测抗体浓度为抗体原液使用PBS稀释为1:20；番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis），检测抗体浓度为抗体原液使用PBS稀释为1:20）再在同一个芯片上进行五种菌的同时检测。检测结果见图2。

将五种菌按照优化过的条件在同一个芯片中进行免疫检测，在菌条带与抗体交叉的区域会产生结合方块，并且由二抗显色后会产生可以观察到的紫黑色方块。由图2中可以看出，五种菌检测结果与单种菌的效果相符合，抗体反应良好的Bga菌和Aac菌得到清晰的方块，抗体反应在单种菌种芯片中信号就比较弱的种类在五种菌的集成芯片中也比较弱。我们可以得出，微流控芯片可以成功的进行多种菌的同时检测，但是检测效果对抗体反应性有要求，良好的抗体可以得到较好的效果。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种检测植物病菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括微流控芯片、植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗、植物病菌阳性对照和显色底物；其中，所述微流控芯片包括芯片底板、设有管道的微流控芯片基片和径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜。

2.根据权利要求1所述的检测植物病菌的试剂盒，其特征在于，所述植物病菌为玉米细菌性枯萎病菌、通用型瓜类细菌性果斑病、马铃薯环腐病菌、番茄细菌性溃疡病菌或洋葱腐烂病菌中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的检测植物病菌的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。

4.根据权利要求1所述的检测植物病菌的试剂盒，其特征在于，所述芯片底板和微流控芯片基片的材料均为聚二甲基硅氧烷。

5.一种使用权利要求1所述试剂盒检测植物病菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）芯片组装

（6）在显微镜下观察和拍摄图像。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述植物病菌为玉米细菌性枯萎病菌、通用型瓜类细菌性果斑病、马铃薯环腐病菌、番茄细菌性溃疡病菌或洋葱腐烂病菌中的一种或几种。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述显色底物为四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。