CN105838720A - Ptprq基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PTPRQ基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码PTPRQ突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的方法，筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***，以及用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码PTPRQ突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.3125A>G突变，或者c.5981A>G突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。

Description

PTPRQ基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及PTPRQ基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码PTPRQ突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***、用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

耳聋(hearing loss；deafness)是一类听觉功能障碍性疾病的统称。在世界范围内，耳聋是一种常见病、多发病。该病可由听觉***的传音或感音功能障碍所致，也可能为听觉传导通路中的听神经或各级中枢发生病变所引起。其病因极其复杂多样，诸如遗传、感染、外伤、药物应用不当、免疫性疾病、生理机能退化、噪声、化学物质中毒及心理因素等等均可导致耳聋，其中遗传因素占主导作用。调查显示，在新生儿中先天性耳聋患者的发病率约为1‰，其中多半与遗传因素有关，这部分耳聋被称作遗传性耳聋(hereditary hearing loss，HHL)，是由染色体或基因功能异常而导致的耳聋。

依据是否伴随其他组织或器官的症状，可将遗传性耳聋分为非综合征型遗传性耳聋(nonsyndromic hereditary hearing loss，NSHHL)和综合征型耳聋(syndromic hereditaryhearing loss，SHHL)。

非综合征型耳聋是指耳聋为发病个体唯一的症状，无其它遗传损害性器官功能障碍，在遗传性耳聋中占70％左右。依据遗传方式的不同，通常将其分为常染色体显性(autosomaldominant，DFNA)、常染色体隐性(autosomal recessive，DFNB)、性染色体连锁(sex-linked)及线粒体遗传性(mitochondrial；maternally inherited)耳聋。

非综合征型耳聋的分类中，常染色体隐性遗传性耳聋约占75～85％，其中全球约50％的患者都是由于GJB2基因突变致病的，属于DFNB1亚型；剩余50％患者的耳聋是由其他基因变异引发，这些基因中大部分只能解释1～2个耳聋家系的发病。常染色体隐性遗传性耳聋的父母，每次生育，都有25％的概率生出一个患有耳聋的孩子，50％的概率生出携带有耳聋致病位点的孩子，25％的概率生出一个正常孩子。因此，一个耳聋家系中正常个体是携带者的概率为2/3。

目前，仍有但是仍有许多常染色体隐性非综合型耳聋患者病因未明，因而，对常染色体隐性非综合型耳聋尤其是其致病基因的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的手段。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：

发明人发现，目前的致病基因和致病突变挖掘的研究中，多使用全外显子组测序法。全外显子组测序是是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，在致病新基因的发现研究中同样发挥着重要作用。利用外显子组测序找出孟德尔遗传病致病基因的案例很多，比如Sarah等人在2009年利用外显子组测序成功定位出mile综合症的基因DHODH，找到米勒综合症的一个致病突变，这也是外显子组测序的首次成功应用；我国Wang等人利用外显子组测序发现了小脑共济失调的新的突变基因TGM6。外显子测序技术是当前的热点技术，极大地推动了疾病研究的进展。本发明针对感音神经性耳聋的基因研究不明确、耳聋相关基因多、家系规模小等特点，外显子组测序技术是最有效的寻找致病基因的方法。

因而，发明人针对自行收集的一个常染色体隐性非综合型耳聋(ARNSHL，也称“常染色体隐性非综合型听力缺失”)患者家系，通过外显子组测序、连锁分析联合Sanger测序验证的方法进行致病突变挖掘和验证，最终确定了常染色体隐性非综合型耳聋的2个新的致病突变位点——PTPRQ基因的c.3125A>G突变和c.5981A>G突变，且c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变导致常染色体隐性非综合型耳聋的发生。

进而，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码PTPRQ突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.3125A>G突变，或者c.5981A>G突变。根据本发明的实施例，发明人确定了PTPRQ基因的突变体，这些新突变体与常染色体隐性非综合型耳聋的发病密切相关，从而通过检测这些突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.D1042G突变，或者p.E1994G突变。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***。根据本发明的实施例，该***包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变，判断所述生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。利用该***，能够有效地筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体的试剂。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码PTPRQ突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码PTPRQ突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT突变的PTPRQ基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1相比具有c.5840C>G突变的PTPRQ基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种PTPRQ基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞同时表达与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的核酸。由此，利用本发明的药物筛选模型，能够有效地筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物。

需要说明的是，本发明发现的常染色体隐性非综合型耳聋致病基因PTPRQ的两个新的致病位点，该突变位点可以用于早期筛查常染色体隐性非综合型耳聋致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗；也可用于常染色体隐性非综合型耳聋患者的分子诊断及与相关疾病的的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为常染色体隐性非综合型耳聋的早期诊断、鉴别诊断及开发常染色体隐性非综合型耳聋治疗药物提供科学依据。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***及其组成部分的示意图，其中，

图1I为根据本发明实施例的筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***的示意图，

图1II为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1III为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明的一个实施例的ARNSHL患者家系的家系图；

图3显示了根据本发明的一个实施例，图2所示ARNSHL患者家系中两个患者的纯音测听结果；以及

图4显示了根据本发明的一个实施例，图2所示ARNSHL患者家系中所有家系成员的PTPRQ基因c.3125A>G、c.5981A>G突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

PTPRQ基因突变体

需要说明的是，本发明利用全外显子测序技术对一个常染色体隐性非综合型听力缺失(ARNSHL)家系中的4个样本(两个患病两个正常)进行测序，同时利用328随机选取的家系外正常人作为对照对变异进行扩展分析。分析发现，在328个正常对照样本中，仅有2个样本具有c.3125A>G突变，而c.5981A>G突变在这些样本中均不存在。由此可证实PTPRQ基因突变可以导致常染色体隐性耳聋：PTPRQ c.3125A>G p.D1042G(母亲的等位基因)和c.5981A>G p.E1994G(父亲的等位基因)复合杂合突变是引起常染色体隐性非综合型耳聋(ARNSHL)的突变。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码PTPRQ突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有c.3125A>G突变，或者c.5981A>G突变。在本文中所使用的表达方式“编码PTPRQ突变体的核酸”，是指与编码PTPRQ突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与PTPRQ突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码PTPRQ突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了PTPRQ基因的新突变体，这些突变体与常染色体隐性非综合型耳聋的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否同时存在，有效地预测生物体是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

这些编码PTPRQ突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序、连锁分析联合Sanger测序验证的方法确定的常染色体隐性非综合型耳聋的致病基因PTPRQ的新的致病突变。这些致病突变位点在现有技术中并未被提到。

其中，野生型PTPRQ基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列(使用的是RefSeq的转录本，编号为NM_001145026.1)：

ATGGATTTTCTTATCATTTTTCTTTTACTTTTTATTGGGACTTCAGAGACACAGGTTGATGTTTCCAATGTCGTTCCTGGTACTAGGTACGATATAACCATCTCTTCAATTTCTACAACATACACCTCACCTGTTACTAGAATAGTGACAACAAATGTAACAAAACCAGGGCCTCCAGTCTTCCTAGCCGGGGAAAGAGTCGGATCTGCTGGGATTCTTCTGTCTTGGAATACACCACCTAATCCAAATGGAAGGATTATATCTTACATTGTCAAATATAAGGAAGTTTGTCCGTGGATGCAAACAGTATATACACAAGTCAGATCAAAGCCAGACAGTCTGGAAGTTCTTCTTACTAATCTTAATCCTGGAACAACATATGAAATTAAGGTTGCTGCTGAAAACAGTGCTGGCATTGGAGTGTTTAGTGATCCATTTCTCTTCCAAACTGCAGAAAGTGCTCCAGGAAAAGTGGTGAATCTCACAGTTGAGGCCTACAACGCTTCAGCAGTTAAGCTGATTTGGTATTTACCTCGGCAACCAAATGGCAAAATTACCAGCTTCAAGATTAGTGTCAAGCATGCCAGAAGTGGGATAGTAGTGAAAGATGTCTCAATCAGAGTAGAGGACATTTTGACTGGGAAATTGCCAGAATGCAATGAGAATAGTGAATCTTTTTTATGGAGTACAGCCAGCCCTTCTCCAACCCTTGGTAGAGTTACACCTCCATCGCGTACCACACATTCATCAAGCACGTTGACACAGAATGAGATCAGCTCTGTGTGGAAAGAGCCTATCAGTTTTGTAGTGACACACTTGAGACCTTATACAACATATCTTTTTGAAGTTTCAGCTGCTACAACTGAAGCAGGTTATATTGATAGTACGATTGTCAGAACACCAGAATCAGTGCCTGAAGGACCACCACAAAACTGCGTAACAGGCAACATCACAGGAAAGTCCTTTTCAATTTTATGGGACCCACCAACTATAGTAACAGGGAAATTTAGTTATAGAGTTGAATTATATGGACCATCAGGTCGCATTTTGGATAACAGCACAAAAGACCTCAAGTTTGCATTCACTAACCTAACACCATTTACAATGTATGATGTCTATATTGCGGCTGAAACCAGTGCAGGGACTGGGCCCAAGTCAAATATTTCAGTATTCACTCCACCAGATGTTCCAGGGGCAGTGTTTGATTTACAACTTGCAGAGGTAGAATCCACGCAAGTAAGAATTACTTGGAAGAAACCACGACAACCAAATGGAATTATTAACCAATACCGAGTGAAAGTGCTAGTTCCAGAGACAGGAATAATTTTGGAAAATACTTTGCTCACTGGAAATAATGAGTATATAAATGACCCCATGGCTCCAGAAATTGTGAACATAGTAGAGCCAATGGTAGGATTATATGAGGGTTCAGCAGAGATGTCGTCTGACCTTCACTCACTTGCTACATTTATATATAACAGCCATCCAGATAAAAACTTTCCTGCAAGGAATAGAGCTGAAGACCAGACTTCACCAGTTGTAACTACAAGGAATCAGTATATTACTGACATTGCAGCTGAACAGCTGTCTTATGTTATCAGGAGACTTGTACCTTTCACTGAGCACATGATTAGTGTATCTGCTTTCACCATCATGGGAGAAGGACCACCAACAGTTCTCAGTGTTAGGACACGTCAGCAAGTGCCAAGCTCCATTAAAATTATAAACTATAAAAATATTAGTTCTTCATCTATTTTGTTATATTGGGATCCTCCAGAATATCCCAATGGAAAAATAACTCACTATACGATTTATGCAATGGAATTGGATACAAACAGAGCATTCCAGATAACTACCATAGATAACAGCTTTCTCATAACAGGGTTAAAGAAATACACAAAATACAAAATGAGAGTGGCAGCCTCAACCCACGTTGGAGAAAGTTCTTTGTCTGAAGAAAATGACATCTTTGTGAGAACTTCAGAAGATGAACCGGAATCATCACCTCAAGATGTCGAAGTAATTGATGTTACCGCAGATGAAATAAGGTTGAAGTGGTCACCACCCGAAAAGCCCAATGGGATCATTATTGCTTATGAAGTGCTATATAAAAATATAGATACTTTATATATGAAGAACACATCAACAACAGACATAATATTAAGGAACTTAAGACCTCACACCCTCTATAACATTTCTGTAAGGTCTTACACCAGATTTGGTCATGGCAATCAGGTATCTTCTTTACTCTCTGTAAGGACTTCGGAGACTGTGCCTGATAGTGCACCAGAAAATATCACTTACAAAAATATTTCTTCTGGAGAGATTGAGCTATCATTCCTTCCCCCAAGTAGTCCCAATGGAATCATACAAAAATATACAATTTATCTCAAGAGAAGTAATGGAAATGAGGAAAGAACTATAAATACAACCTCTTTAACCCAAAACATTAAAGTACTGAAGAAATATACCCAATATATCATTGAGGTGTCTGCTAGTACACTCAAAGGTGAAGGAGTTCGGAGTGCTCCCATAAGTATACTGACGGAGGAAGATGCTCCTGATTCTCCCCCTCAAGACTTCTCTGTAAAACAGTTGTCTGGTGTCACGGTGAAGTTGTCATGGCAACCACCCCTGGAGCCAAATGGAATTATCCTTTATTACACAGTTTATGTCTGGAATAGATCATCATTAAAAACTATTAATGTCACTGAAACATCATTGGAGTTATCAGATTTGGATTATAATGTTGAATACAGTGCTTATGTAACAGCTAGCACCAGATTTGGTGATGGGAAAACAAGAAGCAATATCATTAGCTTTCAAACACCAGAGGGAGCACCAAGCGATCCTCCCAAAGATGTTTATTATGCAAACCTCAGTTCTTCATCAATAATTCTTTTCTGGACACCTCCTTCAAAACCTAATGGGATTATACAATATTACTCTGTTTATTACAGAAATACTTCAGGTACTTTTATGCAGAATTTTACACTCCATGAAGTAACCAATGACTTTGACAATATGACTGTATCCACAATTATAGATAAACTGACAATATTCAGCTACTATACATTTTGGTTAACAGCAAGTACTTCAGTTGGAAATGGGAATAAAAGCAGTGACATCATTGAAGTATACACAGATCAAGACATACCTGAAGGGTTTGTTGGAAACCTGACTTACGAATCCATTTCGTCAACTGCAATAAATGTAAGCTGGGTCCCACCGGCTCAACCAAACGGTCTAGTCTTCTACTATGTTTCACTGATCTTACAGCAGACTCCTCGCCATGTGAGACCACCTCTTGTTACATATGAGAGAAGCATATATTTTGATAATCTGGAAAAATACACTGATTATATATTAAAAATTACTCCATCAACAGAAAAGGGATTCTCTGATACCTATACTGCCCAGCTATACATCAAGACTGAAGAAGATGTCCCAGAAACTTCACCAATAATCAACACTTTTAAAAACCTTTCCTCTACCTCAGTTCTCTTATCATGGGATCCCCCAGTAAAGCCAAATGGTGCAATAATAAGTTATGATTTAACTTTACAAGGACCAAATGAAAATTATTCTTTCATTACTTCTGATAATTACATAATATTGGAAGAGCTTTCACCATTTACATTATATAGCTTTTTTGCTGCCGCAAGAACTAGAAAAGGACTTGGTCCTTCCAGTATTCTTTTCTTTTACACAGATGAGTCAGTGCCGTTAGCACCTCCACAAAATTTGACTTTAATCAACTGTACTTCAGACTTTGTATGGCTGAAATGGAGCCCAAGTCCTCTTCCAGGTGGTATTGTTAAAGTATATAGTTTTAAAATTCATGAACATGAAACTGACACTATATATTATAAGAATATATCAGGATTTAAAACTGAAGCCAAACTTGTTGGACTGGAACCAGTCAGCACCTACTCTATCCGTGTATCTGCGTTCACCAAAGTTGGAAATGGCAATCAATTTAGTAATGTAGTAAAATTCACAACCCAAGAATCAGTTCCAGATGTCGTGCAGAATATGCAGTGCATGGCAACTAGCTGGCAGTCAGTTTTAGTGAAATGGGATCCACCCAAAAAGGCAAATGGAATAATAACGCAGTATATGGTAACAGTTGAAAGGAATTCTACAAAAGTTTCTCCCCAAGATCACATGTACACTTTCATAAAGCTTCTTGCCAATACCTCATATGTCTTTAAAGTAAGAGCTTCAACCTCAGCTGGTGAAGGTGATGAAAGCACATGCCATGTCAGCACACTACCTGAAACAGTTCCCAGTGTTCCCACAAATATTGCTTTTTCTGATGTTCAGTCAACTAGTGCAACATTGACATGGATAAGACCTGACACTATCCTTGGCTACTTTCAAAATTACAAAATTACCACTCAACTTCGTGCTCAAAAATGCAAAGAATGGGAATCCGAAGAATGTGTTGAATATCAAAAAATTCAATACCTCTATGAAGCTCACTTAACTGAAGAGACAGTATATGGATTAAAGAAATTTAGATGGTATAGATTCCAAGTGGCTGCCAGCACCAATGCTGGCTATGGCAATGCTTCAAACTGGATTTCTACAAAAACTCTGCCTGGCCCTCCAGATGGTCCTCCTGAAAATGTTCATGTAGTAGCAACATCACCTTTTAGCATCAGCATAAGCTGGAGTGAACCTGCTGTCATTACTGGACCAACATGTTATCTGATTGATGTCAAATCGGTAGATAATGATGAATTTAATATATCCTTCATCAAGTCAAATGAAGAAAATAAAACCATAGAAATTAAAGATTTAGAAATATTCACAAGGTATTCTGTAGTGATCACTGCATTTACTGGGAACATTAGTGCTGCATATGTAGAAGGGAAGTCAAGTGCTGAAATGATTGTTACTACTTTAGAATCAGCCCCAAAGGACCCACCTAACAACATGACATTTCAGAAGATACCAGATGAAGTTACAAAATTTCAATTAACGTTCCTTCCTCCTTCTCAACCTAATGGAAATATCCAAGTATATCAAGCTCTGGTTTACCGAGAAGATGATCCTACTGCTGTCCAGATTCACAACCTCAGTATTATACAGAAAACCAACACATTCGTCATTGCAATGCTAGAAGGACTAAAAGGTGGACATACATACAATATCAGTGTTTACGCAGTCAATAGTGCTGGTGCAGGTCCAAAGGTTCCGATGAGAATAACCATGGATATCAAAGCTCCAGCACGACCAAAAACCAAACCAACCCCTATTTATGATGCCACAGGAAAACTGCTTGTGACTTCAACAACAATTACAATCAGAATGCCAATATGTTACTACAGTGATGATCATGGACCAATAAAAAATGTACAAGTGCTTGTGACAGAAACAGGAGCTCAGCATGATGGAAATGTAACAAAGTGGTATGATGCATATTTTAATAAAGCAAGGCCATATTTTACAAATGAAGGCTTTCCTAACCCTCCATGTACAGAAGGAAAGACAAAGTTTAGTGGCAATGAAGAAATCTACATCATAGGTGCTGATAATGCATGCATGATTCCTGGCAATGAAGACAAAATTTGCAATGGACCACTGAAACCAAAAAAGCAATACTTATTTAAATTTAGAGCTACAAATATTATGGGACAATTTACTGACTCTGATTATTCTGACCCTGTTAAGACTTTAGGGGAAGGACTTTCAGAAAGAACCGTAGAGATCATTCTTTCCGTCACTTTGTGTATCCTTTCAATAATTCTCCTTGGAACAGCTATTTTTGCATTTGCAAGAATTCGACAGAAGCAGAAAGAAGGTGGCACATACTCTCCTCAGGATGCAGAAATTATTGACACTAAATTGAAGCTGGATCAGCTCATCACAGTGGCAGACCTGGAACTGAAGGACGAGAGATTAACGCGGTTACTTAGTTATAGAAAATCCATCAAGCCAATAAGCAAGAAATCCTTCCTGCAACATGTTGAAGAGCTTTGCACAAACAACAACCTAAAGTTTCAAGAAGAATTTTCGGAATTACCAAAATTTCTTCAGGATCTTTCTTCAACTGATGCTGATCTGCCTTGGAATAGAGCAAAAAACCGCTTCCCAAACATAAAACCATATAATAATAACAGAGTAAAGCTGATAGCTGACGCTAGTGTTCCAGGTTCGGATTATATTAATGCCAGCTATATTTCTGGTTATTTATGTCCAAATGAATTTATTGCTACTCAAGGTCCACTACCAGGAACAGTTGGAGATTTTTGGAGAATGGTGTGGGAAACCAGAGCAAAAACATTAGTAATGCTAACACAGTGTTTTGAAAAAGGACGGATCAGATGCCATCAGTATTGGCCAGAGGACAACAAGCCAGTTACTGTCTTTGGAGATATAGTGATTACAAAGCTAATGGAGGATGTTCAAATAGATTGGACTATCAGGGATCTGAAAATTGAAAGGCATGGGGATTGCATGACTGTTCGACAGTGTAACTTTACTGCCTGGCCAGAGCATGGGGTTCCTGAGAACAGCGCCCCTCTAATTCACTTTGTGAAGTTGGTTCGAGCAAGCAGGGCACATGACACCACACCTATGATTGTTCACTGCAGTGCTGGAGTTGGAAGAACTGGAGTTTTTATTGCTCTGGACCATTTAACACAACATATAAATGACCATGATTTTGTGGATATATATGGACTAGTAGCTGAACTGAGAAGTGAAAGAATGTGCATGGTGCAGAATCTGGCACAGTATATCTTTTTACACCAGTGCATTCTGGATCTCTTATCAAATAAGGGAAGTAATCAGCCCATCTGTTTTGTTAACTATTCAGCACTTCAGAAGATGGACTCTTTGGACGCCATGGAAGGTGATGTTGAGCTTGAATGGGAAGAAACCACTATGTAAATATTCAGACCAAAGGATACAATTGGAAGAGATTTTTAAATCCCAGGGGCCAAAGTTACCCCCTCATTCTTCCGAATTGAAATGTGCAACCTTAAAGAAATATCTATGCTTCTCTCACTGTGCCTTTCCAAACGGATTGAACATTTTAAGACTAGTTCTTGAAAATAGCTAATACAGAATAATTATTTGTTTTGTACAGAATAAATATTATGCATTTTAAATGCTTAAGAAAAGACATCCCATATGTTTTTGAAGTCCTCCATATTTTGGAATAAGCCAAATAGAAAATTATTATTATATTAGCATTAATGTTTCAATGTGAATTTTCCCTATGTATTGGATTTAATTTTGAGCAAAAGTTGTAAATGTTGATTCAGTAGTGTTGTTTTGGCTTACAGGGTATTGATGTTTCTTGTGGATAATTTCCAGGACTGTCATAATGATCTGTACTTCCATGTACACCCCTGTGTTTTGAATCCTCTGTTTTATGAGTGCTGAGATATCATCTCATGATCCCGAACAGCTGAACAGTAACCCCCTGACACTGCAGGGATTACTTGGCCTTTATACAACACACAGTAGCTCTTCAGGGACACTTAGGGCTATTTAATTTGCATTGTGATCTTCAGTTTGAGAACCTTAAAAGAAAAATTAAAAGTGCAATTGCACACATGAAATTACAGAGTACCATTCTAGCAAACCTACATTTGTAAACTTTAAAACACAAGTTTTACCCCCTGTATTGTATATTCAAATATATAGTAAATGTATCAGAGTATTTGCCCATTAGATATAGTCAACCTAATATTAACAATTCTGAAGAGTTTCTTCAGCAAAAATGTATCAAAAGAGTAATAAAAACACTGTGCGTGTTTCAAGCTTGTAAACCAATGATGTGCTGCTGTGGTGCCAACAGAGACTTCCAAATGGATTATGTTAAATGGCCGTCATTTCATTTCCCAAGGTTGATTTTGAGCAGTATACTTGGTGGAACTGAAAACAAAGAAATTAACCATGTATAGCAAATTCAAGGTTTCTTTATAGAAAATCTTTCAGCCTCCATCTTATTAAATAGTGACAATGTGGTAAGTTTTGAATTACATGAACTCATTTTGTCATAGATTTCAATTAAGAGTAATAAATAGTATTAATTATTCTCTTCTATG(SEQ ID NO：1)，其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MDFLIIFLLLFIGTSETQVDVSNVVPGTRYDITISSISTTYTSPVTRIVTTNVTKPGPPVFLAGERVGSAGILLSWNTPPNPNGRIISYIVKYKEVCPWMQTVYTQVRSKPDSLEVLLTNLNPGTTYEIKVAAENSAGIGVFSDPFLFQTAESAPGKVVNLTVEAYNASAVKLIWYLPRQPNGKITSFKISVKHARSGIVVKDVSIRVEDILTGKLPECNENSESFLWSTASPSPTLGRVTPPSRTTHSSSTLTQNEISSVWKEPISFVVTHLRPYTTYLFEVSAATTEAGYIDSTIVRTPESVPEGPPQNCVTGNITGKSFSILWDPPTIVTGKFSYRVELYGPSGRILDNSTKDLKFAFTNLTPFTMYDVYIAAETSAGTGPKSNISVFTPPDVPGAVFDLQLAEVESTQVRITWKKPRQPNGIINQYRVKVLVPETGIILENTLLTGNNEYINDPMAPEIVNIVEPMVGLYEGSAEMSSDLHSLATFIYNSHPDKNFPARNRAEDQTSPVVTTRNQYITDIAAEQLSYVIRRLVPFTEHMISVSAFTIMGEGPPTVLSVRTRQQVPSSIKIINYKNISSSSILLYWDPPEYPNGKITHYTIYAMELDTNRAFQITTIDNSFLITGLKKYTKYKMRVAASTHVGESSLSEENDIFVRTSEDEPESSPQDVEVIDVTADEIRLKWSPPEKPNGIIIAYEVLYKNIDTLYMKNTSTTDIILRNLRPHTLYNISVRSYTRFGHGNQVSSLLSVRTSETVPDSAPENITYKNISSGEIELSFLPPSSPNGIIQKYTIYLKRSNGNEERTINTTSLTQNIKVLKKYTQYIIEVSASTLKGEGVRSAPISILTEEDAPDSPPQDFSVKQLSGVTVKLSWQPPLEPNGIILYYTVYVWNRSSLKTINVTETSLELSDLDYNVEYSAYVTASTRFGDGKTRSNIISFQTPEGAPSDPPKDVYYANLSSSSIILFWTPPSKPNGIIQYYSVYYRNTSGTFMQNFTLHEVTNDFDNMTVSTIIDKLTIFSYYTFWLTASTSVGNGNKSSDIIEVYTDQDIPEGFVGNLTYESISSTAINVSWVPPAQPNGLVFYYVSLILQQTPRHVRPPLVTYERSIYFDNLEKYTDYILKITPSTEKGFSDTYTAQLYIKTEEDVPETSPIINTFKNLSSTSVLLSWDPPVKPNGAIISYDLTLQGPNENYSFITSDNYIILEELSPFTLYSFFAAARTRKGLGPSSILFFYTDESVPLAPPQNLTLINCTSDFVWLKWSPSPLPGGIVKVYSFKIHEHETDTIYYKNISGFKTEAKLVGLEPVSTYSIRVSAFTKVGNGNQFSNVVKFTTQESVPDVVQNMQCMATSWQSVLVKWDPPKKANGIITQYMVTVERNSTKVSPQDHMYTFIKLLANTSYVFKVRASTSAGEGDESTCHVSTLPETVPSVPTNIAFSDVQSTSATLTWIRPDTILGYFQNYKITTQLRAQKCKEWESEECVEYQKIQYLYEAHLTEETVYGLKKFRWYRFQVAASTNAGYGNASNWISTKTLPGPPDGPPENVHVVATSPFSISISWSEPAVITGPTCYLIDVKSVDNDEFNISFIKSNEENKTIEIKDLEIFTRYSVVITAFTGNISAAYVEGKSSAEMIVTTLESAPKDPPNNMTFQKIPDEVTKFQLTFLPPSQPNGNIQVYQALVYREDDPTAVQIHNLSIIQKTNTFVIAMLEGLKGGHTYNISVYAVNSAGAGPKVPMRITMDIKAPARPKTKPTPIYDATGKLLVTSTTITIRMPICYYSDDHGPIKNVQVLVTETGAQHDGNVTKWYDAYFNKARPYFTNEGFPNPPCTEGKTKFSGNEEIYIIGADNACMIPGNEDKICNGPLKPKKQYLFKFRATNIMGQFTDSDYSDPVKTLGEGLSERTVEIILSVTLCILSIILLGTAIFAFARIRQKQKEGGTYSPQDAEIIDTKLKLDQLITVADLELKDERLTRLLSYRKSIKPISKKSFLQHVEELCTNNNLKFQEEFSELPKFLQDLSSTDADLPWNRAKNRFPNIKPYNNNRVKLIADASVPGSDYINASYISGYLCPNEFIATQGPLPGTVGDFWRMVWETRAKTLVMLTQCFEKGRIRCHQYWPEDNKPVTVFGDIVITKLMEDVQIDWTIRDLKIERHGDCMTVRQCNFTAWPEHGVPENSAPLIHFVKLVRASRAHDTTPMIVHCSAGVGRTGVFIALDHLTQHINDHDFVDIYGLVAELRSERMCMVQNLAQYIFLHQCILDLLSNKGSNQPICFVNYSALQKMDSLDAMEGDVELEWEETTM(SEQ ID NO：2)。

发明人发现的两种PTPRQ基因突变体，其中之一与SEQ ID NO：1相比，具有c.3125A>G突变，即相对于野生型PTPRQ基因，该PTPRQ基因突变体的cDNA中第3125位碱基A突变为G，由此，其所编码的产物与野生型PTPRQ(SEQ ID NO：2)相比，具有p.D1042G突变，即该突变是由于c.3125A>G突变而引起的错义突变，导致第1042位氨基酸天冬氨酸突变为甘氨酸。

而另一种PTPRQ基因突变体，其与SEQ ID NO：1相比，具有c.5981A>G突变，即相对于野生型PTPRQ基因，该PTPRQ基因突变体的cDNA中第5981位碱基A突变为G，由此，其所编码的产物与野生型PTPRQ(SEQ ID NO：2)相比，具有p.E1994G的错义突变，即其第1994位氨基酸从谷氨酸突变为甘氨酸。

本发明公开了已知耳聋基因PTPRQ的两种新突变，首次证实了PTPRQ基因的c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变导致患者出现常染色体隐性非综合型耳聋的症状，即其为常染色体隐性遗传性耳聋的分子病因。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型PTPRQ相比，该述分离的多肽具有p.D1042G突变，或者p.E1994G突变。根据本发明的一些具体示例，具有p.D1042G突变的多肽是由前述分离的编码具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体的核酸编码的，具有p.E1994G突变的多肽是由前述分离的编码具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否同时存在，有效地预测生物体是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。

筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的方法的***。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品PTPRQ是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中PTPRQ是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含PTPRQ编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的效率。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序平台进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应PTPRQ的编码序列即可。

另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集PTPRQ外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块(图中未示出)，在该PCR扩增模块中设置有PTPRQ外显子特异性引物，以便利用PTPRQ外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。由此，可以通过PCR扩增，富集PTPRQ外显子，从而能够进一步提高筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的效率。根据本发明的具体实施例，针对c.3125A>G突变，所述PTPRQ基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；针对c.5981A>G突变，所述PTPRQ基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列：

突变	上游引物(5’→3’，SEQ ID NO：)	下游引物(5’→3’，SEQ ID NO：)
			c.3125A>G	TGTCGATTTTCCTAAAACAACAT(3)	GCAGTTTTCTTGAACAGAAGAGG(4)
c.5981A>G	TGATTTTGGGGATGTCCATT(5)	TCAAGGCCAGAGTCCTTCAT(6)

发明人惊奇地发现，通过采用上述引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对PTPRQ外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3-6所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

根据本发明的实施例，可以用于进行测序的设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序平台，也可以采用第三代以及***或者更先进的测序平台。根据本发明的具体示例，测序单元202可以为选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。由此，利用该***，能够有效地筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。

具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变，判断生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变，是生物样品易患常染色体隐性非综合型耳聋的指示。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒包括：适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体的试剂。利用根据本发明实施例的试剂盒，通过筛选同时存在上述两种PTPRQ基因突变体的生物样品，能够有效地筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测两种PTPRQ突变体编码基因的试剂，也可以是检测PTPRQ突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，针对与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；针对与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒，在此不再赘述。

构建体及重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码PTPRQ突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码PTPRQ突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种PTPRQ基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的PTPRQ基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞同时表达与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的核酸。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的药物筛选模型，能够有效地筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物。

需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞同时表达前述的两种PTPRQ基因突变体(与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的核酸)即可。例如，可以采用基因转化的方法，将前面所述的本发明的构建体转入受体动物(非人)，从而使动物的至少一部分细胞同时表达前述的两种PTPRQ基因突变体；也可以采用CRISPR/Cas9基因编辑技术、盒式突变、SOE PCR等方法，使受体动物的PTPRQ基因发生c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变，并有效表达前述的两种多肽，从而该受体动物能够发生常染色体隐性非综合型耳聋，进而能够有效地用于筛选治疗常染色体隐性非综合型耳聋的药物，也即能够有效用作药物筛选模型。

需要说明的是，本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个常染色体隐性非综合型耳聋患者家系进行全基因组外显子组测序分析，从而发现了2个常染色体隐性非综合型耳聋致病基因PTPRQ的新突变位点。与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术相比，外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精度更高，可以更准确的定位常染色体隐性非综合型耳聋的致病基因及其突变位点，进而为阐明S综合症的分子发病机制，开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1 确定常染色体隐性非综合型耳聋致病突变

1、样本收集

发明人收集到一个中国汉族2代常染色体隐性非综合型耳聋患者家系其家系图见图2。如图2所示，该家系包含4个成员，包括2名患者(即家系图中的II1、II2)、2名家系内正常人(即该2例患者的父母I1、I2，其均未发病)，符合常染色体隐性遗传模式。其中，○表示正常女性，□表示正常男性，■表示男性患者，箭头所指为先证者。

其中，该家系中两个患者的纯音测听结果见图3。在图3中，横坐标表示纯音的频率，纵坐标表示听力级，如果听力正常阈值曲线应该是在0附近浮动的，曲线往下走表示听力下降。如图3所示，左图为患者II1的检测结果，右图为患者II2的检测结果，结果显示患者II1、II2的听力均为双侧中-重度感音神经性耳聋。

发明人收集该家系内所有成员的外周血样，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。所有血样均签属知情同意书。

2、DNA提取

取上述家系所有成员的外周血，分别利用QIAmp Blood kit(Qiagen,Hilden,Germany)抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用Qubit Fluorometer和琼脂糖凝胶电泳测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于50纳克/微升，总量不少于3微克。

3、外显子捕获测序

发明人利用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0全外显子捕获平台，结合Illumina Hiseq 2000的高通量测序技术，对上述常染色体隐性非综合型耳聋患者家系中的两位患者及其表型正常的父母的外显子组序列进行了测序。

具体如下：

1)利用超声波仪(CovarisS2,Massachusetts,USA)将各基因组DNA样本随机打断成250-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文)。

2)文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为50×。

3)变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software 1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2(可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文)比对到参考基因组UCSC NCBI37/hg19，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,YangH,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，在病例1(II1)中发现94316个单核苷酸多态性(SNPs)和6774个***/缺失(Indels)，在病例2(II:2)中发现93434个SNP和6807个Indel，在父亲(I:1)中发现93657个SNP和6753个Indel，在母亲(I:2)中发现99942个SNP和7055个Indel。随后通过dbSNP数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz)，HapMap数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，千人基因组数据库(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异(变异MAF值高，通常为不致病的普通多态性)，并利用SIFT软件进行SNP功能预测。

其中，感音神经性耳聋属于有常隐和常显两种遗传模式，发明人结合家系实际情况，使用隐性遗传策略分析。将分析后的加息结果与目前已经报道的与耳聋相关的基因列表取交集，验证得到22个复合杂合突变的基因和两个纯合突变的基因。发明人综合测序质量、信息分析数据筛选参考，结合隐性遗传模式：即父母杂合突变、孩子纯合突变或者父母同一基因各带有一个突变、孩子同时拥有两个突变(复合杂合)，发现ARNSHL已知基因PTPRQ上的突变符合条件。PTPRQ上有两个错义突变为患者共有的：c.3125A>G(p.D1042G)，c.5981A>G(p.E1994G)。根据信息学分析，此家系中如父母各带一个突变，PTPRQ中的两个错义突变可形成复合杂合突变。

PTPRQ为已知耳聋致病基因，该基因包含45个外显子，编码蛋白大小为260.924KDa。PTPRQ编码的蛋白属于III型受体蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)家族，该蛋白在细胞增殖和分化中可起到催化磷酸和磷酸酰肌醇磷酸化的作用。研究表明，该基因的突变可引起常染色体隐性遗传性耳聋。

进一步，对两个患者及其正常父母进行sanger测序验证，结果发现上述突变位点符合常染色体隐性遗传模式的共分离。由此，发明人认为，PTPRQ基因的c.3125A>G(p.D1042G)和c.5981A>G(p.E1994G)突变极可能为常染色体隐性非综合型耳聋的新的致病突变。

实施例2 Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述的常染色体隐性非综合型耳聋患者家系中的所有家系成员(包括2个患者和2个正常家系成员)以及328名随机挑取的家系外正常人的PTPRQ基因进行检测：针对PTPRQ基因的c.3125A>G和c.5981A>G突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证PTPRQ基因的c.3125A>G和c.5981A>G突变与常染色体隐性非综合型耳聋之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库GRCh37/hg19，设计得到针对PTPRQ基因的c.3125A>G和c.5981A>G突变的外显子特异性引物，具体序列如下：

突变	上游引物(5’→3’，SEQ ID NO：)	下游引物(5’→3’，SEQ ID NO：)
			c.3125A>G	TGTCGATTTTCCTAAAACAACAT(3)	GCAGTTTTCTTGAACAGAAGAGG(4)
c.5981A>G	TGATTTTGGGGATGTCCATT(5)	TCAAGGCCAGAGTCCTTCAT(6)

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系(20μl)：

PCR反应条件：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。

基于测序结果，在本发明的常染色体隐性非综合型耳聋患者家系中对PTPRQ基因的c.3125A>G(p.D1042G)和c.5981A>G(p.E1994G)突变位点进行突变排查，结果发现该家系中两个患者均携带c.3125A>G(p.D1042G)和c.5981A>G(p.E1994G)的复合杂合突变，而表现正常的父母分别携带其中的一种杂合突变：父亲仅携带c.5981A>G(p.E1994G)的错义突变，而母亲仅携带c.3125A>G(p.D1042G)的错义突变(具体结果见图4)。此外，在328个正常对照样本中，仅有2个样本具有c.3125A>G突变，而c.5981A>G突变在这些样本中均不存在。其中，图4为上述ARNSHL患者家系中所有家系成员的PTPRQ基因c.3125A>G、c.5981A>G突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

由此，进一步证明PTPRQ基因的c.3125A>G(p.D1042G)和c.5981A>G(p.E1994G)是常染色体隐性非综合型耳聋的新的致病位点，PTPRQ基因的c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变，能够导致该病。

实施例3 检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含能够检测PTPRQ基因的c.3125A>G和c.5981A>G突变的引物，用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品，其中这些引物为PTPRQ基因外显子特异性引物，其序列如实施例2中SEQ ID NO：3-6所示。

利用上述试剂盒筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的具体步骤为：按照实施例1的步骤2所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述PTPRQ基因的外显子特异性引物进行PCR反应(PCR反应体系和反应条件参见实施例2)，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否同时具有c.3125A>G和c.5981A>G突变，能够有效地检测本发明的两种PTPRQ基因突变体在待测者DNA中是否同时存在，从而能够有效地检测待测者是否易患常染色体隐性非综合型耳聋，进一步，能够从待测者中筛选出易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种分离的编码PTPRQ突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有c.3125A>G突变，或者c.5981A>G突变，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.D1042G突变，或者p.E1994G突变，

任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。

3.一种筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的***，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.3125A>G和c.5981A>G的复合杂合突变，判断所述生物样品是否易患常染色体隐性非综合型耳聋。

4.根据权利要求3所述的***，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

5.根据权利要求3所述的***，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

6.根据权利要求5所述的***，其特征在于，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有PTPRQ基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，

针对c.3125A>G突变，所述PTPRQ基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；

针对c.5981A>G突变，所述PTPRQ基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

7.一种用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体的试剂，

任选地，所述试剂为核酸探针或引物，

任选地，针对与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的PTPRQ基因突变体，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；

针对与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的PTPRQ基因突变体，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列。

8.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码PTPRQ突变体的核酸。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求8所述的构建体转化受体细胞而获得的。

10.一种构建药物筛选模型的方法，其特征在于，包括：

使动物的至少一部分细胞同时表达与SEQ ID NO：1相比具有c.3125A>G突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.5981A>G突变的核酸，

任选地，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。