CN105832814A - 具有治疗糖尿病作用的总黄酮及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有治疗糖尿病作用的总黄酮及其制备方法与应用。本发明以苦豆子药材为原料，通过大量实验筛选出最佳的分离纯化工艺，尤其是利用聚酰胺柱色谱和大孔树脂柱联用，并采用优选洗脱溶液洗脱，分离得到的精制总黄酮纯度高，杂质含量少，分离得到的苦豆子总黄酮活性强，实验结果表明本发明提供的精制总黄酮具有很好的治疗糖尿病的作用，对糖尿病及其糖尿病合并肝病等相关性疾病均具有非常好的治疗效果，且实验过程中，未表现出副作用等不良反应，有望开发成为安全有效，用于防治糖尿病的药物。

Description

具有治疗糖尿病作用的总黄酮及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及苦豆子总黄酮，尤其涉及从苦豆子中富集总得到黄酮及其在治疗2型糖尿病及2型糖尿病肝病的新药理用途。

背景技术：

糖尿病是世界范围的最常见的流行性疾病之一，其死亡率在发达国家仅次于血管疾病、恶性肿瘤，成为第三位的致死病因疾病。它是一种与遗传因素有关，同时又与多种环境因素相关的慢性全身性疾病，是因胰岛素分泌或利用不足而引起的机体糖类、脂肪代谢紊乱的综合征，且糖尿病肝病已成为糖尿病慢性并发症中除肾脏、心脏、视网膜、神经病变外另一个日益引起人们重视的慢性并发症。我国糖尿病患者近年来数量呈十分明显的上升趋势，且其中主要类型是2型糖尿病患者，已成为主要威胁我国人民生命健康的问题之一。

尽管有大量的降血糖药物在临床应用，但由于其副作用大、使用不便、疗效不稳定，目前仍未发现一种有效的治疗药物。天然抗糖尿病药物以其毒副作用小和不易产生耐药性普遍受到医学界的关注。苦豆子中含有黄酮、黄酮醇、查耳酮等多种类型的黄酮类化合物。近年来，苦豆子的镇静、镇痛、抗惊厥、降温、抗心律失常、抗炎、抗肿瘤、心肌保护、降血脂等药理作用的研究逐渐为人们所了解，而针对代谢类疾病的报道较少。

苦豆子别名苦豆根、苦甘草、布亚(维吾尔语)等，是豆科Leguminosae槐属植物苦豆子Sophora alopecuroides.L的干燥全草、根及种子，生长于中亚、西亚一带和我过西北省区荒漠内较潮湿的地段。在我国组要分布于新疆、内蒙古、陕西、山西、宁夏、甘肃、西藏等省区。全株味寒性苦，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用。

苦豆子中主要化学成分除生物碱外，还含有黄酮、有机酸、氨基酸、蛋白质和多糖等。目前，国内外研究的热点是生物碱。近年来，有关苦豆子黄酮类成分的药理活性的报道引起了人们的兴趣。现代药理学、药效学研究表明，苦豆子总黄酮能明显减弱家兔和大鼠的心率；且有抗异丙肾上腺素的正性频率作用，对离体豚鼠心房肌有负性频率作用，延长有效不应期，并具有抗脂质过氧化作用。显然，从苦豆子中提取总黄酮有着较高的经济效益和社会效益。

目前苦豆子总黄酮的提取工艺主要有热回流法、冷浸法和索氏提取法。这些方法总黄酮提取量低且杂质较多，影响苦豆子总黄酮的综合利用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种以苦豆子为原料，经过优选工艺分离得到的精制总黄铜。本发明另一个目的是提供苦豆子精制总黄铜的制备方法及其应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有治疗糖尿病作用的总黄酮，它是通过以下方法制备得到的：

(1)将苦豆子药材晒干，粉碎为粗粉，粉碎后的药材用乙醇回流提取1～3次，每次1～2小时，提取液过滤合并，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；

(2)取步骤(1)制备得到的浓缩液，上色谱柱进行分离，以乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；

(3)取步骤(2)乙醇洗脱后的浓缩液，加水稀释，边加水边搅拌进行水沉，然后静置，离心，取沉淀；

(4)取步骤(3)制备得到的沉淀，上色谱柱纯化，先以水洗脱，再用体积浓度50～60％乙醇洗脱，收集洗脱液，合并，真空干燥，得到苦豆子总黄酮提取物。

作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮，步骤(2)和步骤(4)所述的色谱柱为聚酰胺色谱柱或大孔树脂色谱柱。

本发明提供的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)将苦豆子药材晒干，粉碎为粗粉，粉碎后的药材用乙醇回流提取1～3次，每次1～2小时，提取液过滤合并，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；

(2)取步骤(1)制备得到的浓缩液，上色谱柱进行分离，以乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；

(3)取步骤(2)乙醇洗脱后的浓缩液，加水稀释，边加水边搅拌进行水沉，然后静置，离心，取沉淀；

(4)取步骤(3)制备得到的沉淀，上色谱柱纯化，先以水洗脱，再用体积浓度50～60％乙醇洗脱，收集洗脱液，合并，真空干燥，得到苦豆子总黄酮提取物。

作为优选方案，步骤(2)和步骤(4)所述的色谱柱为聚酰胺色谱柱或大孔树脂色谱柱。特别优选步骤(2)为聚酰胺色谱柱，步骤(4)为大孔树脂色谱柱。

作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，步骤(2)中采用体积浓度为30％和70％乙醇洗脱。本发明通过大量实验优选出最佳体积浓度的乙醇洗脱液，采用该浓度的乙醇洗脱液，可最大程度上将黄酮类化合物洗脱，杂质少。

作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，步骤(4)中用体积浓度50％乙醇洗脱。本发明通过大量实验优选，才有聚酰胺色谱柱和大孔吸附树脂柱联用，并筛选出最佳体积浓度的乙醇洗脱液，采用50％乙醇洗脱，可最大程度上将黄酮类化合物洗脱，杂质少。

本发明制备得到具有治疗糖尿病作用的总黄酮具有很好的防治糖尿病或糖尿病肝病的作用，可用于制备防治糖尿病或糖尿病肝病药物。

作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮在制备治疗糖尿病或糖尿病肝病药物的作用，将精制总黄酮和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、锭剂、栓剂、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

本发明提供的精制总黄酮制成胶囊剂时，把精制总黄酮和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的精制总黄酮制成片剂时，把精制总黄酮和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的精制总黄酮制成颗粒剂时，把精制总黄酮和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的精制总黄酮制成注射液时，取精制总黄酮加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

本发明提供的精制总黄酮除热原之后，经无菌过滤，冷冻干燥，得到注射用粉针剂。

有益效果：本发明提供的具有治疗糖尿病作用的精制总黄酮及其制备方法具有以下优点：

本发明提供的具有治疗糖尿病作用的精制总黄酮，有效成分黄酮含量高，杂质少，防治糖尿病功效好。

本发明提供的具有治疗糖尿病作用的精制总黄酮的制备方法，工艺设计合理，尤其是通过大量实验筛选出最佳的分离工艺，纯化效率高，得率高；利用聚酰胺柱色谱和大孔树脂柱联用，并采用优选洗脱溶液洗脱，分离得到的精制总黄酮纯度高，杂质含量少，分离得到的苦豆子总黄酮活性强。

实验结果表明本发明提供的具有治疗糖尿病作用的精制总黄酮具有很好的治疗糖尿病的作用，对糖尿病及其糖尿病合并肝病等相关性疾病均具有非常好的治疗效果，且实验过程中，未表现出副作用等不良反应，有望开发成为新一代安全有效，用于防治糖尿病的药物。

附图说明

图1为各实验组大鼠肝组织病理切片图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

在以下的实施例中，未详细描述的过程和方法是本领域中公认的常规方法。

实验例1从苦豆子根茎中富集苦豆子总黄酮类化合物

1.实验材料

实验用药材为豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides.L)

2.实验仪器、设备

粉碎机、电热套、旋转蒸发仪、低速大容量多管离心机、超声仪、真空干燥箱、聚酰胺、DM-130大孔树脂

3.提取与富集

(1)将采集到的苦豆子药材进一步晒干，称重，粉碎过20目，粉碎后的药材用8倍量，浓度为70％乙醇回流提取3次，每次两小时，提取液过滤合并，65℃下减压浓缩至无醇味；

(2)取步骤(1)浓缩物上聚酰胺柱进行分离纯化，分别用体积浓度为30％和70％乙醇溶液洗脱，浓缩洗脱液；

(3)将步骤(2)所得浓缩液加入水稀释，边加水边搅拌进行水沉。然后静置8h，离心(3000rpm,30min)取沉淀。

(4)取步骤(3)分离得到的沉淀，采用DM-130大孔树脂分离，湿法装柱，pH值4～6，上样量为药材与树脂质量之比为3∶1，室温下以3.0BV/h的体积流量进行吸附饱和；解吸时，先以4BV的水洗脱(弃去)，再用50％乙醇洗脱，收集5BV洗脱液，合并并真空干燥，即得到苦豆子总黄酮提取物。检测总黄酮含量为87％，得率为46％。

实验例2苦豆子总黄酮混合物对2型糖尿病及2型糖尿病肝病的治疗作用

1.动物：纯系清洁级Wistar大鼠40只，180-220g。

2.分组：所有大鼠预饲养1w后，随机分为两组：正常组(K组)8只给予正常饮食；其余32只给予高脂高糖饮食加尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)进行造模，并于8周后进行空腹血糖(FBG)测定，FBG≥16.8mmol/L者为造模成功。将造模成功的24只大鼠随机分为四组：模型组(M组)、二甲双胍组(Y组，150mg/kg，作为阳性药对照)、实施例1制备得到的高浓度苦豆子总黄酮组(G1组)、实施例1制备得到的低浓度苦豆子总黄酮组(D1组)均继续给予高脂高糖饮食；正常组仍给予正常饮食。

3.给药方案：从第10周起二甲双胍组给予二甲双胍水溶液150mg/kg灌胃；本发明实施例1制备得到的苦豆子总黄酮组，每日分别给予高浓度总黄酮水溶液、低浓度总黄酮水溶液灌胃；正常组和模型组则给予等体积蒸馏水灌胃，药物干预共1周。

4.实验试剂：实施例1制备得到的苦豆子总黄酮、盐酸二甲双胍片、链脲佐菌素、ALT、AST测定试剂盒、胰岛素放射免疫分析试剂盒。

5.检测指标：1.血糖、胰岛素及肝功的变化；2.采用苏木素-伊红(HE)染色法检测大鼠肝组织病理变化情况。

6.统计学分析：应用SPSS13.0统计软件进行分析，以x±s表示；组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验；指标之间的关系用相关性分析。

7.实验结果

7.1血糖、胰岛素及肝功的变化

模型组与正常组相比较，空腹血糖值明显增加，经阳性药治疗后数值降低，经本发明实施例1制备得到的高浓度总黄酮、低剂量总黄酮给药5天后FBG值较模型组就明显降低，且有统计学意义；并且经本发明实施例1制备得到的苦豆子总黄酮提取物治疗后，胰岛素含量较模型组明显降低，且具有统计学意义；ALT、AST含量较模型组比较也随之降低，且具有统计学意义。详细结果见表1。

表1各组大鼠血糖、胰岛素及肝功变化(x±s，n＝6)

计量资料以表示。与模型组比较，统计学的显著性差异为：**P＜0.001，*P＜0.05。

以上实验结果表明，本发明提供的精制总黄酮能快速降低糖尿病大鼠的血糖值，减弱胰岛素抵抗，并且对糖尿病大鼠的肝脏病理损伤有明显的改善功效。

7.2各组大鼠肝组织的病理变化

与模型组相比，本发明实施例1制备得到的总黄酮组，肝细胞胞质内脂滴数量减少，脂肪变性、肝小叶边界不清、肝索排列紊乱、肝窦和中央静脉扩张现象均明显减轻。详细结果见图1。

由以上实验结果表明，本发明提供的精制总黄酮不仅具有明显降血糖作用，能够有效纠正糖尿病的糖代谢紊乱，提高糖耐量的作用，并且能够显著减轻糖尿病肝病大鼠脂肪变性、肝小叶边界不清、肝索排列紊乱、肝窦和中央静脉扩张现象，且未见有不良反应，安全性好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有治疗糖尿病作用的总黄酮，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：

(1)将苦豆子植物根茎晒干，粉碎为粗粉，粉碎后的药材用乙醇回流提取1～3次，每次1～2小时，提取液过滤合并，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；

(2)取步骤(1)制备得到的浓缩液，上色谱柱进行分离，以乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；

(3)取步骤(2)乙醇洗脱后的浓缩液，加水稀释，边加水边搅拌进行水沉，然后静置，离心，取沉淀；

(4)取步骤(3)制备得到的沉淀，上色谱柱纯化，先以水洗脱，再用体积浓度50～60％乙醇洗脱，收集洗脱液，合并，真空干燥，得到苦豆子总黄酮提取物。

2.根据权利要求1所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)所述的色谱柱为聚酰胺色谱柱或大孔树脂色谱柱。

3.权利要求1所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将苦豆子药材晒干，粉碎为粗粉，粉碎后的药材用乙醇回流提取1～3次，每次1～2小时，提取液过滤合并，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；

(2)取步骤(1)制备得到的浓缩液，上色谱柱进行分离，以乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；

(3)取步骤(2)乙醇洗脱后的浓缩液，加水稀释，边加水边搅拌进行水沉，然后静置，离心，取沉淀；

(4)取步骤(3)制备得到的沉淀，上色谱柱纯化，先以水洗脱，再用体积浓度50～60％乙醇洗脱，收集洗脱液，合并，真空干燥，得到苦豆子总黄酮提取物。

4.根据权利要求3所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)所述的色谱柱为聚酰胺色谱柱或大孔树脂色谱柱。

5.根据权利要求3所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用体积浓度为30％和70％乙醇洗脱。

6.根据权利要求3所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤(4)中用体积浓度50％乙醇洗脱。

7.权利要求1或2所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮在制备治疗糖尿病或糖尿病肝病药物的作用。

8.根据权利要求7所述的具有治疗糖尿病作用的总黄酮在制备治疗糖尿病或糖尿病肝病药物的作用，其特征在于，将总黄酮和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、锭剂、栓剂、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。