CN105801626A - 一种水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，该化合物的结构式为式中M代表Cr或Mo，R代表H‑、
Description
技术领域
本发明属于合成医药技术领域，具体涉及一种水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物及其制备方法。
背景技术
CO一直被人们称作“无声杀手”，但随着小型信使分子NO和H2S的发展，人们逐渐认识到CO也是人体内的一种重要的信使分子，具有舒张心血管、抑制恶性细胞增殖、保护缺血再灌注损伤、抗炎症、抗菌等诸多治疗功效；但CO具有在水中溶解小、体内易与血红蛋白结合、难定量传输等局限。过渡金属羰基化合物类一氧化碳释放分子(CO ReleasingMolecules，CO-RMs)虽然解决了传输上的局限，但由于配位羰基的强疏水性，大多数过渡金属羰基化合物的水溶性都不好，难以用于以水为介质的生物体系。
三羰基甘氨酸氯化钌(II)(CORM-3)是最早合成的水溶性一氧化碳释放分子，稳定性好，可以缓释CO，可以缓和局部缺血再灌注损伤，抑制同种异体移植排斥反应，抑制巨噬细胞NO生成，减弱心血管炎症和凝血素诱发的神经炎等。CORM-3在纯水中释放半衰期为98小时，生理环境中释放CO的半衰期下降至20.4分钟，而在人体血浆中半衰期下降至3.6分钟，因此使用CORM-3无法迂回血红蛋白进行体内缓释CO治疗。
Lynam和Fairlamb小组发现系列天然氨基酸吡喃酮可作为给电子配体与环戊二烯基羰基铁单元配位，形成水溶性羰基化合物，但是通过对该类化合物做乳酸脱氢酶细胞毒性测试发现(IC50＝71μM)其具有较强的细胞毒性(Dalton Trans，2007年9月，第33期3603～3605页)。
Man小组通过引入水溶性的羧酸官能团成功的合成了系列羰基猛释放分子[Mn(CO)4(η2-S2CNMeCH2CO2H)]，每分子释放分子总共可释放三分子的一氧化碳，通过RAW264.7巨噬细胞毒性测试表明该化合物毒性小，可以抑制脂多糖诱导的亚硝酸盐的产生，但该类释放分子的半衰期仅有0.8分钟(Dalton Trans，2011年，第40卷4230～4235页)。
Ford小组以羰基钨为释放分子前体，采用传统水溶性磷配体大幅度提高此羰基钨的水溶性，CO释放实验表明，如果将其放置在黑暗环境中，会在空气中稳定一段时间，采用300～370nm范围的光激发，此类化合物会光解释放出CO，但此配体不易衍生，只能合成一个释放分子(Inorg.Chem，2010年，第49卷1180～1185页)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有金属羰基化合物存在的缺点，提供一种热稳定较好、毒性较低且具有较好的水溶性和生物相容性、能够实现缓释一氧化碳的水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，以及该化合物的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是该水溶性聚乙二醇修饰的Fischer卡宾化合物的结构式如下所示：
式中M代表Cr或Mo，R代表H-、中的任意一种，n为1～3的整数。
本发明优选R代表H-。
本发明还优选R代表n为2。
上述水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物的制备方法如下：
在无水无氧、N2保护条件下，以甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾与式2所示的聚乙二醇单甲醚氨基酸酯盐酸盐、三乙胺按摩尔比为1:1:1，室温搅拌反应4～6小时，柱色谱分离，得到水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，具体反应方程式如下：
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过聚乙二醇对Fischer卡宾进行修饰，不仅增加了Fischer卡宾的热稳定性、生物相容性，降低了分子的毒性，并且极大地增加了分子的水溶性。
2、本发明合成方法简单易得，所得聚乙二醇化Fischer卡宾化合物在水相中能缓释CO，在紫外光照射下能够迅速释放一氧化碳分子，对光具有较好的响应性，为水溶性一氧化碳释放分子开辟了一条新的道路。
3、本发明聚乙二醇化Fischer卡宾化合物的半衰期均在404s以上。
附图说明
图1是实施例2制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物的单晶结构图。
图2是实施例1～11制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物降解释放2小时后的碳氧肌红蛋白浓度柱状图。
图3是实施例1～11制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物在365nm紫外光照射下的半衰期柱状图。
图4是实施例1制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物在不同浓度下对RAW264.7的抑制率的柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
称取500.2mg(1mmol)式1-1所示的五羰基铬的Fischer卡宾和265.6mg(1mmol)一乙二醇单甲醚氨基酸酯盐酸盐置于Schlenk瓶中，采用真空线操作技术，在无水无氧、N2(99.999％)保护下加入15mL干燥的甲醇和140μL(1mmol)三乙胺，室温搅拌反应5小时，柱色谱分离(以二氯甲烷与石油醚的体积比为3:1的混合液为洗脱液)，得到油状黄色的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(112.9mg，产率64％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1928cm-1，1748cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.34(s，1H)，9.16-9.04(m，0.2H)，4.72(s，0.4H)，4.43(s，2H)，4.22(s，2H)，3.64(s，2H)，3.39(s，3H)，2.84(s，0.6H)，2.67(s，3H)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：287.23，222.73，217.45，167.32，69.86，65.36，58.98，47.89，36.91。
实施例2
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的一乙二醇单甲醚苯丙氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(276mg，产率62％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1744cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.16(s，1H)，8.75(s，0.35H)，7.33(s，3H)，7.19(s，2H)，4.77(s，1H)，4.46-4.28(m，2H)，3.58(d，2H)，3.40(s，3H)，3.17(d，2H)，2.29(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：282.38，224.13，218.82，170.46，135.12，130.83，129.44，71.27，66.72，61.62，60.32，40.60，36.95。
将所得产物溶解于二氯甲烷中，并加入二氯甲烷体积2.5倍的正己烷，在-21℃下放置3天，得到黄色针状聚乙二醇化Fischer卡宾化合物晶体，其单晶结构如图1所示，属于正方晶系，P4(1)空间群，晶胞参数 α＝90°，β＝90°，γ＝90°，晶胞体积为Z＝4，晶体大小为0.14mm×0.12mm×0.10mm。
实施例3
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的一乙二醇单甲醚酪氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(103mg，产率23％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1928cm-1，1735cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.14(s，1H)，7.02(s，2H)，6.82(s，2H)，6.51-5.74(m，2H)，4.70(s，1H)，4.09(s，2H)，3.86(s，3H)，3.08(d，2H)，2.32(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：285.04，222.78，217.44，171.61，155.82，130.66，125.76，116.00，69.87，65.15，60.49，58.90，38.23，35.57。
实施例4
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的二乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(198mg，产率48％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1747cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.33(s，1H)，4.44(s，2H)，4.21(s，2H)，3.75(s，2H)，3.64(d，2H)，3.55(s，2H)，3.38(s，3H)，2.68(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：218.88，73.27，71.94，70.03，60.49，49.35。
实施例5
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的二乙二醇单甲醚苯丙氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物化合物，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1748cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.23(s，1H)，7.33(s，3H)，7.19(s，2H)，4.76(s，1H)，4.41(s，2H)，3.74(s，2H)，3.65(s，2H)，3.56(s，2H)，3.38(s，3H)，3.30-3.08(m，2H)，3.17-2.99(m，1H)，2.27(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：286.99，224.14，218.84，170.41，135.57，130.85，130.64，128.57，71.92，70.00，66.78，61.67，60.49，40.60，36.94。
实施例6
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的二乙二醇单甲醚酪氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(76mg，产率30％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1745cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.13(s，1H)，7.02(d，2H)，6.81(d，2H)，4.70(d，1H)，4.12(d，2H)，3.85(s，3H)，3.22-3.00(m，2H)，3.00(dd，2H)，2.32(s，3H)，2.04(s，2H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：286.87，224.14，218.85，170.99，157.09，132.01，127.26，117.56，61.99，61.78，54.64，39.86，36.99，22.47，15.57。
实施例7
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的一乙二醇单甲醚亮氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(139mg，产率31％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1742cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.07(s，1H)，4.57(d，1H)，4.36(ddd，2H)，3.61(s，2H)，3.37(s，3H)，2.69(s，3H)，1.92-1.77(m，2H)，1.76-1.64(m，1H)，0.99(dd，6H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：224.14，218.96，171.07，71.32，66.40，60.30，59.62，43.05，37.31，26.29，23.87，23.59，2.43。
实施例8
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的三乙二醇单甲醚苯丙氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到黄色油状聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(278mg，产率53％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1747cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.52(s，1H)，7.33(d，3H)，7.19(d，2H)，4.77(s，1H)，4.39(s，2H)，3.75(s，2H)，3.66(s，3H)，3.64(s，2H)，3.55(s，2H)，3.37(s，3H)，3.29(d，2H)，3.23-3.00(m，2H)；13CNMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：282.21，224.25，218.90，170.40，135.76，130.85，130.59，129.35，71.98，69.98，66.77，61.77，60.41，48.85，40.51，36.85。
实施例9
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的三乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(247mg，产率56％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：2056cm-1，1928cm-1，1748cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.53(s，1H)，4.47-4.35(m，2H)，4.22(d，2H)，3.73(dd，2H)，3.67-3.59(m，6H)，3.54(dd，2H)，3.36(s，3H)，2.65(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：284.82，221.92，216.55，166.37，76.45，76.13，75.81，70.87，69.72-69.24，67.51，64.33，57.90，46.97，35.70。
实施例10
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的五羰基铬的Fischer卡宾用等摩尔的五羰基钼的Fischer卡宾替换，其它步骤与实施例1相同，得到酒红色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(243mg，产率61％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1927cm-1，1747cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.15(d，1H)，4.66(d，2H)，4.43(d，2H)，3.73-3.56(m，2H)，3.40(d，3H)，2.82(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：168.67，156.95，130.32，124.21，115.49，69.63，64.81，57.70，54.02，35.15。
实施例11
以制备结构式如下的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物为例：
在实施例1中，所用的五羰基铬的Fischer卡宾用等摩尔的五羰基钼的Fischer卡宾替换，所用的一乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐用等摩尔的二乙二醇单甲醚甘氨酸酯盐酸盐替换，其它步骤与实施例1相同，得到酒红色油状的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(299mg，产率68％)，其反应方程式如下：
所得产物的结构表征数据为：IR(CH2Cl2，cm-1)：Vco＝2056cm-1，1931cm-1，1748cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：9.30(s，1H)，9.0(s，0.3H)，4.65(d，0.6H)，4.44(dd，2H)，4.18(d，2H)，3.80-3.72(m，2H)，3.65(dd，2H)，3.59-3.53(m，2H)，3.48(s，0.5H)，3.40-3.36(m，3H)，2.82(s，1H)，2.65(s，3H)；13C NMR(101MHz，CDCl3)δ(ppm)：279.67，214.46，207.89，168.72，73.27，71.93，70.02，66.82，60.48，48.86，38.51。
为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1～11制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物(以下简称待测物)进行了各种性能测试，具体测试情况如下：
1、水溶性测试
采用油水分配系数测定法测试待测物的水溶性，结果见表1。
表1水溶性测试结果
| 待测物 | 待测物在正辛醇相浓度 | 待测物在水相浓度 | LogD |
| 实施例1 | 2.4386 | 0.1026 | 1.38 |
| 实施例2 | 2.1109 | 0.0391 | 1.73 |
| 实施例3 | 1.9222 | 0.06648 | 1.46 |
| 实施例4 | 2.1461 | 0.09593 | 1.35 |
| 实施例5 | 1.8522 | 0.05198 | 1.55 |
| 实施例6 | 1.7352 | 0.06478 | 1.43 |
| 实施例7 | 2.229 | 0.05645 | 1.60 |
| 实施例8 | 1.554 | 0.08368 | 1.27 |
| 实施例9 | 1.8889 | 0.0968 | 1.29 |
| 实施例10 | 2.2308 | 0.0749 | 1.47 |
| 实施例11 | 1.9903 | 0.07158 | 1.44 |
由表1可见，本发明聚乙二醇化显著提高了Fischer卡宾化合物的水溶性。
2、CO释放性能测试
称取5mg肌红蛋白加入到5mL容量瓶中，然后用5mL pH＝7.4的磷酸缓冲溶液充分溶解，配制成肌红蛋白溶液。用移液枪吸取1mL肌红蛋白溶液加入比色皿中，然后加入25mgNa2S2O4，在室温条件下，采用紫外-可见分光光度计测试被还原的肌红蛋白在波长为500～600nm范围内的紫外吸收光谱，然后向被还原的肌红蛋白溶液中通入CO气体直至溶液颜色变红，测试其在波长为500～600nm范围内的紫外吸收光谱。
将1.3mg待测物溶解于130μLDMSO中，得到母液，然后将母液用DMSO稀释，配制成60μmol/L和20μmol/L的待测物标准溶液。
(1)水相降解CO释放
将5μL60μmol/L待测物标准溶液和1mL肌红蛋白溶液加入到比色皿中，并加入25mgNa2S2O4，混合均匀，比色皿上方加入1滴石蜡油密封，然后采用紫外-可见分光光度计测试在波长为500～600nm范围内的紫外吸收光谱，待测物不释放CO后停止测试，其中降解释放2小时后的碳氧肌红蛋白浓度如图2所示。由图可见，本发明实施例1、3、4、6、9、10、11制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物在水相中均能释放较多的CO。
(2)365nm光诱导CO释放
将5μL20μmol/L待测物标准溶液和1mL肌红蛋白溶液加入到比色皿中，并加入25mgNa2S2O4，混合均匀，比色皿上方加入1滴石蜡油密封，然后采用紫外-可见分光光度计测试在波长为500～600nm范围内的紫外吸收光谱。刚开始没有光刺激的条件下扫描测试5次(每次扫描间隔30s，每次测5组数据)，待测物有弱的CO释放，然后采用波长为365nm的紫外光在10％的透过率下照射1s，待测物能快速释放CO，扫描7次后，所有化合物几乎不释放CO；然后采用波长为365nm的紫外光在100％的透过率下照射5s，扫描2次后，待测物不再有CO释放。由图3可见，本发明聚乙二醇化Fischer卡宾化合物的半衰期最大能达到1940s，最小也能达到404s。
由上述实验结果可见，实施例1～11制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物在水相中较慢的释放一氧化碳，有一些甚至水相不释放一氧化碳。而在光照的条件下很快的释放一氧化碳，说明聚乙二醇化Fischer卡宾化合物具有非常好的光响应性，并且具有较好CO释放性能、每一分子的化合物释放出较多的CO。
3、细胞毒性试验
上述实验充分说明聚乙二醇化Fischer卡宾化合物可以作为CO释放分子，在水相或光诱导下释放CO，因此，其可以应用于医学领域用于治疗或预防疾病，下面以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)为例，采用实施例1制备的聚乙二醇化Fischer卡宾化合物进行试验，具体试验如下：
(1)细胞处理
取冻存的RAW264.7(DMEM)细胞系，在37℃快速解冻后，1000转/分钟离心5分钟，用培养基清洗1～2次(因为在冷冻的过程中加入了对细胞繁殖生长有害的物质)，用培养基重悬后再离心，所得RAW264.7细胞加入完全培养基进行培养，每天换一次培养基，观察细胞生长状况，长满后备用。
(2)细胞活力测试
待RAW264.7细胞长满后调整细胞浓度为5×104cells/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。然后在96孔板中按实验分组加入不同浓度梯度的(0、50、100、200、300、400、500μmol/L)聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，每孔150μL，每组三个复孔，培养2小时。随后，将培养的不同浓度的细胞分别用365nm紫外灯光照20分钟和不光照，并放置暗处8小时后进行MTT检测：在每孔加入15μL四唑盐(MTT)，在37℃、5％CO2培养箱内培养避光孵育4小时，吸净孔内的液体，加入200μL DMSO，室温于摇床震荡10分钟，用酶标仪在492nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞增殖影响的分析。
由MTT结果可知：RAW264.7细胞光照条件下的IC50值为238.5μmol/L，RAW264.7细胞不光照条件下的IC50值为152.3μmol/L。CO对细胞的增殖抑制作用用抑制率表示，分别计算各组抑制率：抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％，以浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘制曲线，结果见图4。
上述图4的实验结果可见，当加入的释放分子浓度逐渐增大时，细胞抑制率也逐渐增大，而当浓度为500μmol/L时不光照的情况下其抑制率可达到90.6％。说明本发明聚乙二醇化Fischer卡宾化合物的水溶性增加，降低了其细胞毒性。
Claims (4)
1.一种水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，其特征在于该化合物的结构式如下所示：
式中M代表Cr或Mo，R代表H-、中的任意一种，n为1～3的整数。
2.根据权利要求1所述的水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，其特征在于：所述的R代表H-。
3.根据权利要求1所述的水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物，其特征在于：所述的R代表n为2。
4.权利要求1所述的水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物的制备方法，其特征在于：在无水无氧、N2保护条件下，以甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾与式2所示的聚乙二醇单甲醚氨基酸酯盐酸盐、三乙胺按摩尔比为1:1:1，室温反应4～6小时，柱色谱分离，得到水溶性聚乙二醇化Fischer卡宾化合物；
上述M代表Cr或Mo，R代表H-、中的任意一种，n为1～3的整数。
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Granted publication date: 20180306 Termination date: 20210322 |
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