CN105801602B

CN105801602B - 5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN105801602B
Application number: CN201410849980.2A
Authority: CN
Inventors: 余洛汀; 魏于全
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN105801602A

Abstract

本发明属于化学医药领域，具体涉及5‑叔丁基异噁唑‑3‑基‑3‑(4‑取代苯基)脲衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种5‑叔丁基异噁唑‑3‑基‑3‑(4‑取代苯基)脲衍生物，其结构如式Ⅰ所示。本发明还提供了5‑叔丁基异噁唑‑3‑基‑3‑(4‑取代苯基)脲衍生物的制备方法和用途。本发明在大量筛选的基础上得到上述的5‑叔丁基异噁唑‑3‑基‑3‑(4‑取代苯基)脲衍生物，具有抑制人急性髓性白血病细胞增殖的活性，为治疗急性髓性白血病药物的开发和应用提供了新的选择。

Description

5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

受体酪氨酸激酶(RTKs)是人体内一类重要的酶，它作为生长因子受体磷酸化下游蛋白，在信号转导途径中发挥核心作用，从而调节细胞的增殖、生长、分化和死亡。在许多疾病中都可以观察到受体酪氨酸激酶(PTKs)的异常或过度活化以及活性失调，例如癌症、炎症、自身免疫性疾病等。

血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)是RTKs的成员，与肿瘤血管生成密切相关。在绝大多数癌症(如胃肠道癌、胰腺腺、膀胱癌、子宫内膜瘤等)中可以检测到VEGFR和其受体VEGFR1、VEGFR2过表达；某些颅内肿瘤(如胶质母细胞瘤、Von Hippel-Lindau综合征等)中VEGFR2高表达。目前已有几十种VEGFR2的抑制剂作为抗肿瘤药物处于临床研究阶段。

Ret激酶是RTKs的另一类成员，是一个在转化中发生重排的原癌基因，它编码细胞膜受体酪氨酸激酶，初步研究表明它介导的信号转导途径较为独特。Ret基因突变与人类4种癌症的发生相关：甲状腺***状腺癌存在Ret基因与其他基因多种重排；多发性内分泌腺瘤2型，家族遗传甲状腺髓样癌等存在7个位点点突变；先天巨结肠疾病与Ret基因缺失相关。一些RET抑制剂已被证明可以有效抑制肿瘤在裸鼠模型身上增殖(Cancer Res.2003,631,5559-5563)。

血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)也是RTKs的成员，能够促进细胞的趋化、***与增殖，在机体生长发育、创伤修复等生理过程中起着积极重要的作用，其活性失调，已经证明与多种增生性疾病有关。如脑胶质瘤和肉瘤患者中可以检测到PDGFR上调(Oncogene.1992,7:627-633)；慢性粒细胞白血病(CMML)患者中观察到PDGFR的组成性激活(Blood.2002,100:1088-1091)；胃肠道肿瘤和特发性嗜酸性细胞增多综合征患者可以检测到PDGFR的功能性突变和小部分缺失(Science.2003,299:708-710)。

巨噬细胞集落刺激因子受体(colony-stimulating factor-1Receptor，CSF-1R)是PDGFR家族第三个成员，是一种具有谱系特异性的细胞因子，由乳腺癌、上皮癌等表达。在大部分实体瘤和血液癌细胞中可以检测到CSF-1R的表达，因此，CSF-1R可以作为潜在肿瘤治疗靶点来进行药物研发。

干细胞因子受体(stem cell factor receptor，Kit)是PDGFR家族另一个成员，Kit突变常作为胃肠道间质瘤癌变的检测标准。伊马替尼，是FDA批准的第一个RTPK抑制剂，用于c-Abl介导的慢性粒细胞白血病的治疗，已经在2002年被FDA批准作为Kit抑制剂来治疗Kit介导的胃肠间质瘤。Kit的功能性突变与肥大细胞/粒细胞白血病和***瘤/无性细胞瘤有关(Nature.2001,411(17):355-365)。在某些黑色素瘤中也发现Kit突变，并作为药物靶点用于黑色素瘤的治疗。

FLT3(Fms-like tyrosine kinase，FMS样的酪氨酸激酶3)是PDGFR家族第二个成员，由树突状细胞(DC)、未成熟造血干细胞、成熟的髓系细胞和淋巴样细胞表达(Leukemia.1995；9:1212-1218)。在急性髓性白血病(AML)中，90％患者的骨髓细胞检测到FLT3高表达，并且FLT3对骨髓细胞的增殖起着重要作用(Blood.2002,100,1532)。

上述众多受体酪氨酸激酶介导的增生、炎症和免疫性疾病，亟待研发新型PTKs抑制剂以治疗PTKs相关的疾病。

发明内容

本发明提供了一种5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

其中，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N、O或S；

R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S；

n＝0～3。

作为本发明优选的方案，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S；n＝0～2。

优选的，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基、C1～C4酰氧基、杂环基、苯基、萘基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S；n＝0～2。

进一步优选的，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基；n＝0～2。

更进一步优选的，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基；n＝0～2。

再进一步优选的，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0～2。

最优的，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0或1。

上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，当X₁、X₃为N，X₂为C时，其结构如式Ⅱ所示：

其中，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N、O或S；

n＝0～3。

作为本发明优选的方案，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S；n＝0～2。

优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基、C1～C4酰氧基、杂环基、苯基、萘基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S；n＝0～2。

进一步优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基；n＝0～2。

更进一步优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基；n＝0～2。

再进一步优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0～2。

最优的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0或1。

上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，当n＝1时，其结构如式Ⅲ所示：

其中，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N、O或S；

R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S。

作为本发明优选的方案，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S。

优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基、C1～C4酰氧基、杂环基、苯基、萘基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S。

进一步优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基。

更进一步优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基。

再进一步优选的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素。

最优的，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素。

上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，当Y₁、Y₂、Y₃均为C时，其结构如式Ⅳ所示：

其中，R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S。

作为本发明优选的方案，R₁、R₂为H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S。

上述5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其结构式为：

本发明还提供了上述5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物的制备方法，合成路线为：

其中，X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N、O或S；R₁、R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基、C1～C6酰氧基、杂环基、C6～C10芳基或芳杂环基；所述的杂环基或芳杂环基为含有1～4个杂原子的5～10元环，所述的杂原子为N、O或S；n＝0～3。

上述5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物的制备方法，其反应步骤为：

将三光气置于四氢呋喃中，向其中缓慢滴加3-氨基-5-叔丁基异噁唑的四氢呋喃溶液，再缓慢滴加三乙胺的四氢呋喃溶液，室温搅拌15min，反应完成后减压蒸出溶剂得产物5-叔丁基-3-异噁唑基异氰酸酯；所述三光气、3-氨基-5-叔丁基异噁唑、三乙胺的摩尔比为1︰1︰3；

将5-叔丁基-3-异噁唑基异氰酸酯溶于氯仿中，随后加入中间体1，加热回流反应30min，反应完成后降至常温，向反应液中加入二氯甲烷和水，剧烈搅拌10min，逐渐有固体析出，直接过滤，用乙醇洗涤固体，得式Ⅰ化合物；所述5-叔丁基-3-异噁唑基异氰酸酯与中间体1的摩尔比为1︰1；所述二氯甲烷和水的体积比为1︰1。

本发明上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，包括了它们的同位素化合物、外消旋体、旋光活性异构体、多晶型形式或其混合物。

本发明还提供了上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物药学上可接受的盐。

本发明还提供了本发明化合物的前药，依据本发明，前药是上述化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

本发明还提供了上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物药学上可接受的水合物。

一种药物组合物，是由式Ⅰ～Ⅳ所示的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物及其盐或水合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

本发明还提供了上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物及其盐或的水合物在制备治疗急性髓性白血病药物中的用途。

本发明在大量筛选的基础上得到上述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，具有抑制人急性髓性白血病细胞增殖的活性，为治疗急性髓性白血病药物的开发和应用提供了新的选择。

附图说明

图1 化合物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物2)抑制MV4-11细胞增殖测试结果。

图2 化合物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物9)抑制MV4-11细胞增殖测试结果。

图3 化合物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物13)抑制MV4-11细胞增殖测试结果。

图4 化合物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-炔基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物26)抑制MV4-11细胞增殖测试结果。

图5 化合物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-炔基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物27)抑制MV4-11细胞增殖测试结果。

图6 化合物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物28)抑制MV4-11细胞增殖测试结果。

图7 化合物28体内对肿瘤的抑制活性。

图8 化合物28处理后的肿瘤染色图。

图9 化合物28对细胞内FLT3磷酸化水平的作用。

图10 化合物28对细胞凋亡的影响。

具体实施方式

实施例1 中间体5-叔丁基-3-异噁唑基异氰酸酯的合成

将三光气296.8mg(1mmol)置于25mL圆底烧瓶中，并加入3mL四氢呋喃将其溶解，将3-氨基-5-叔丁基异噁唑140.2mg(1mmol)溶于2mL四氢呋喃中后缓慢滴加入上述烧瓶，再量取三乙胺0.416mL(3mmol)溶于2mL四氢呋喃中，缓慢滴加入上述烧瓶，室温搅拌15min，反应完成后减压蒸出溶剂得产物5-叔丁基-3-异噁唑基异氰酸酯。

实施例2 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基}脲(化合物1)的合成

将2-氨基噻唑500.65mg(5mmol)溶于无水乙醇(15mL)中，随后加入2-溴-4-硝基苯基苯乙酮1.464g(6mmol)，加热回流12h，反应完成后有固体析出，直接过滤、洗涤得6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-B]噻唑。

将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑245mg(1mmol)溶于无水乙醇(9mL)与水(3mL)中，随后加入氯化铵213.9mg(4mmol)和铁粉558mg(10mmol)，加热回流30min，反应完成后过滤除去未反应的铁粉，将滤液减压浓缩后溶于乙酸乙酯(100mL)，稀盐酸(1N)洗涤三次，加入无水硫酸镁干燥后减压蒸出溶剂得6-(4-氨基苯基)咪唑并[2,1-B]噻唑。

将5-叔丁基-3-异噁唑基异氰酸酯132mg(0.8mmol)溶于氯仿(15mL)中，随后加入6-(4-氨基苯基)咪唑并[2,1-B]噻唑172mg(0.8mmol)，加热回流30min，反应完成后降至常温，向反应液中加入二氯甲烷(10mL)和水(10mL)，剧烈搅拌10min，逐渐有固体析出，直接过滤，用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.53(s,1H),8.87(s,1H),8.14(s,1H),7.92(d,J＝3.8Hz,1H),7.77(d,J＝8.1Hz,2H),7.49(d,J＝8.1Hz,2H),7.24(d,J＝3.8Hz,1H),6.53(s,1H),1.30(s,9H)；MS(ES⁺)m/z：382.2(M+H⁺)。

实施例3 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物2)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.56(s,1H),8.92(s,1H),8.50(d,J＝6.6Hz,1H),8.32(s,1H), 7.92(d,J＝7.8Hz,2H),7.56(d,J＝7.5Hz,2H),7.52(d,J＝6.68Hz,1H),7.22(t,J＝7.8Hz,1H),6.87(t,J＝6.5Hz,1H),6.54(s,1H),1.30(s,9H)；MS(ES⁺)m/z：376.2(M+H⁺)。

实施例4 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物3)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-3-氯吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.55(s,1H),8.91(s,1H),8.31(s,1H),8.18(s,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,2H),7.53(d,J＝7.9Hz,2H),7.45(d,J＝9.2Hz,1H),6.96(d,J＝9.2Hz,1H),6.53(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：410.2(M+H⁺)。

实施例5 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物4)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-3-甲基吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.55(s,1H),8.95(s,1H),8.33(d,J＝6.6Hz,1H),8.29(s,1H),7.92(d,J＝6.8Hz,2H),7.55(d,J＝6.9Hz,2H),7.01(d,J＝6.7Hz,1H),6.77(t,J＝7.2Hz,1H),6.54(s,1H),2.53(s,3H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：390.2(M+H⁺)。

实施例6 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物5)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-3-氟吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.56(s,1H),8.95(s,1H),8.74(s,1H),8.32(s,1H),7.90(d,J ＝8.2Hz,2H),7.62(d,J＝7.9,5.0Hz,1H),7.54(d,J＝8.2Hz,2H),7.31(t,J＝9.0Hz,1H),6.53(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：394.2(M+H⁺)。

实施例7 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-三氟甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物6)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-3-三氟甲基吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(8-三氟甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.55(s,1H),8.97(s,1H),8.79(d,J＝5.5Hz,1H),8.51(s,1H),7.94(d,J＝7.4Hz,2H),7.69(d,J＝5.8Hz,1H),7.57(d,J＝7.5Hz,2H),7.02(t,J＝7.8Hz,1H),6.54(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：444.2(M+H⁺)。

实施例8 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-基)苯基}脲(化合物7)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基嘧啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.34(s,1H),10.03(s,1H),9.32(d,J＝6.1Hz,1H),8.96(d,J＝5.8Hz,1H),8.69(s,1H),7.96(d,J＝7.9Hz,2H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.64(t,J＝6.5Hz,1H),6.53(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：377.2(M+H⁺)。

实施例9 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物8)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-4-氯吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.81(s,1H),9.63(s,1H),8.83(d,J＝7.1Hz,1H),8.65(s,1H),8.01(s,1H),7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.66(d,J＝8.2Hz,2H),7.48(d,J＝6.8Hz,1H),6.53(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：410.1(M+H⁺)。

实施例10 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物9)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-4-甲基吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.57(s,1H),8.97(s,1H),8.37(d,J＝7.1Hz,1H),8.21(s,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,2H),7.53(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(s,1H),6.71(d,J＝6.8Hz,1H),6.53(s,1H),2.34(s,3H),1.29(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：390.2(M+H⁺)。

实施例11 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-溴咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物10)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-4-溴吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-溴咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.03(s,1H),9.95(s,1H),8.73(s,1H),8.63(d,J＝6.3Hz,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,2H),7.66(s),7.64(d,J＝8.0Hz,2H),7.27(d,J＝5.8Hz,1H),6.54(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：454.1(M+H⁺)。

实施例12 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-基)苯基}脲(化合物11)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基吡嗪，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.58(s,1H),9.05(s,1H),8.99(s,1H),8.58(d,J＝6.5Hz,1H),8.53(s,1H),7.98(d,J＝7.9Hz,2H),7.89(d,J＝6.3Hz,1H),7.58(d,J＝8.2Hz,2H),6.53(s,1H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：377.2(M+H⁺)。

实施例13 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物12)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-5氯吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.96(s,1H),8.80(s,1H),8.30(s,1H),7.91(d,J＝7.5Hz,2H),7.61(d,J＝9.3Hz,1H),7.55(d,J＝7.5Hz,2H),7.28(d,J＝9.3Hz,1H),6.54(s,1H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：410.2(M+H⁺)。

实施例14 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物13)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-5-甲基吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.88(s,1H),9.82(s,1H),8.68(s,1H),8.63(s,1H),7.93(d,J＝8.3Hz,2H),7.86(d,J＝9.1Hz,1H),7.79(d,J＝9.1Hz,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),6.54(s,1H),2.42(s,3H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：390.2(M+H⁺)。

实施例15 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物14)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-5-氟吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.61(s,1H),9.08(s,1H),8.52(d,J＝6.3Hz,1H),8.45(s,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,2H),7.57(d,J＝7.8Hz,2H),7.41(d,J＝7.1Hz,1H),6.87(t,J＝6.6Hz,1H),6.54(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：394.2(M+H⁺)。

实施例16 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物15)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-5-溴吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.60(s,1H),9.06(s,1H),8.86(s,1H),8.29(s,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(d,J＝9.0Hz,1H),7.34(d,J＝9.5Hz,1H),6.53(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：454.1(M+H⁺)。

实施例17 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-碘咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物16)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-5-碘吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-碘咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.92(s,1H),9.88(s,1H),9.21(s,1H),8.55(s,1H),8.04(d,J＝8.7Hz,1H),7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.73(d,J＝8.8Hz,1H),7.63(d,J＝7.7Hz,2H),6.52(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：502.1(M+H⁺)。

实施例18 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(5-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物17)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-6-氯吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(5-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.99(s,1H),9.93(s,1H),8.89(s,1H),8.07(d,J＝8.0Hz,2H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),7.69(d,J＝7.2Hz,1H),7.63(d,J＝8.0Hz,2H),6.55(s,1H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：410.2(M+H⁺)。

实施例19 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(5-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物18)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为2-氨基-6-甲基吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(5-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.57(s,1H),8.93(s,1H),8.28(s,1H),7.98(d,J＝6.2Hz,2H),7.54(d,J＝6.4Hz,2H),7.46(d,J＝7.8Hz,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),6.77(d,J＝6.8Hz,1H),6.54(s,1H),2.63(s,3H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：382.2(M+H⁺)。

实施例20 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)苯基}脲(化合物19)的合成

按实施例2的制备方法，将原料替换为3-氨基哒嗪，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.64(s,1H),9.16(s,1H),8.77(s,1H),8.47(d,J＝8.3Hz,1H),8.09(d,J＝8.1Hz,1H),7.99(d,J＝7.1Hz,2H),7.57(d,J＝7.1Hz,2H),7.21(t,d,J＝8.5Hz,1H),6.54(s,1H),1.29(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：377.2(M+H⁺)。

实施例21 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-环丙基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物20)的合成

将6-溴-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶634mg(2mmol)溶于甲苯(25mL)中，依次加入环丙基硼酸188.98mg(2.2mmol)和磷酸钾1.273g(6mmol)，氮气保护下加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物81.7mg(0.1mmol)，加热至90℃反应4h，反应完成后过滤除去未反应的[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，将滤液减压浓缩，柱层析后得6-环丙基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为6-环丙基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-环丙基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.52(s,1H),8.89(s,1H),8.32(s,1H),8.18(s,1H),7.87(d,J＝8.1Hz,2H),7.52(d,J＝8.1Hz,2H),7.45(d,J＝9.2Hz,1H),6.97(d,J＝9.3Hz,1H),6.52(s,1H),2.04–1.88(m,1H),1.30(s,9H),0.94(d,J＝7.9Hz,2H),0.71(d,J＝4.4Hz,2H)。MS(ES⁺)m/z：416.3(M+H⁺)。

实施例22 1-{4-(苯并[d]噁唑-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲(化合物21)的合成

将邻氨基苯酚327mg(3mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入25mL甘油和5mL甲醇，加热至90℃搅拌30min，随后加入对硝基苯甲醛453.36mg(3mmol)，90℃反应2h，反应完成后向反应体系中加入20mL乙酸乙酯，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后减压浓缩除去溶剂，将产物置于研钵中，加入[双(三氟乙酰氧基)碘]苯1.311g(3.05mmol)，室温研磨15min，反应完成后，反应体系变为黑色，有液体产生，向反应体系中加入50mL乙酸乙酯，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后减压浓缩除去溶剂，柱层析后得2-(4-硝基苯基)苯并[d]噁唑。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为2-(4-硝基苯基)苯并[d]噁唑，最后用乙醇洗涤得产物1-{4-(苯并[d]噁唑-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),9.21(s,1H),8.15(d,J＝7.8Hz,2H),7.77(s,2H),7.71(d,J＝7.8Hz,2H),7.40(d,J＝4.0Hz,2H),6.55(s,1H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：377.2(M+H⁺)。

实施例23 1-{4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲(化合物22)的合成

按实施例22的制备方法，将原料替换为邻氨基苯硫酚，最后用乙醇洗涤1-{4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.65(s,1H),9.19(s,1H),8.12(d,J＝7.7Hz,1H),8.06(d,J＝7.8Hz,2H),8.02(d,J＝7.5Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.54(t,J＝7.2Hz,1H),7.44(t,J＝7.2Hz,1H),6.55(s,1H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：393.1(M+H⁺)。

实施例24 1-{4-(苯并[d]噻吩-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲(化合物23)的合成

将苯并噻吩-2-硼酸783.2mg(4.4mmol)溶于甲苯(25mL)中，依次加入对硝基溴苯804mg(4mmol)和磷酸钾2.547g(12mmol)，氮气保护下加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物163.3mg(0.2mmol)，加热至90℃反应4h，反应完成后过滤除去未反应的[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，将滤液减压浓缩，柱层析后得2-(4-硝基苯基)苯并[d]噻吩。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为2-(4-硝基苯基)苯并[d]噻吩，最后用乙醇洗涤得产物1-{4-(苯并[d]噻吩-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.60(s,2H),7.94(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.76(s,1H),7.72(d,J＝8.0Hz,2H),7.60(d,J＝8.0Hz,2H),7.38(d,J＝7.8Hz,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),6.54(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：414.2(M+Na⁺)。

实施例25 1-{4-(苯并[d]呋喃-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲(化合物24)的合成

将邻羟基苯甲醛610.6mg(5mmol)溶于25mL的DMF中，随后加入对硝基苄溴1.08g(5mmol)和叔丁醇钾1.68g(15mmol)，加热回流4h，反应完成后，将反应液降至室温，加入100mL乙酸乙酯，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后减压浓缩除去溶剂，柱层析后得2-(4-硝基苯基)苯并[d]呋喃。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为2-(4-硝基苯基)苯并[d]呋喃，最后用乙醇洗涤得产物1-{4-(苯并[d]呋喃-2-基)苯基}-3-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.61(s,1H),9.06(s,1H),7.86(d,J＝6.0Hz,2H),7.62(s,4H),7.29(d,J＝6.2Hz,2H),7.25(s,1H),6.54(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：398.2(M+Na⁺)。

实施例26 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(3-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物25)的合成

将3-氯-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶478.14mg(2mmol)溶于DMF中(15mL)，加入N-氯代丁二酰亚胺280mg(2.1mmol)，常温搅拌6h，反应完成后，向反应体系内加入25mL水，搅拌15min，有固体析出，直接过滤并用水洗涤得产物3-氯-2-(4-氨基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为3-氯-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(3-氯咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.88(s,1H),9.81(s,1H),8.81(d,J＝6.4Hz,1H),8.71(s,1H),7.97(s,1H),7.95(d,J＝8.2Hz,2H),7.67(d,J＝8.1Hz,2H),7.42(d,J＝6.5Hz,1H),6.54(s,1H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：410.2(M+H⁺)。

实施例27 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-炔基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物26)的合成

将7-溴-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶634mg(2mmol)溶于20mL四氢呋喃中，然后依次加入双三苯基膦二氯化钯140.4mg(0.2mmol)，碘化亚铜38.09mg(0.2mmol)，三苯基膦53mg(0.2mmol)，加热至65℃反应30min，然后加入三甲基硅乙炔0.8mL(5.6mmol)，三乙胺2.68mL(20mmol)，65℃继续反应12h，反应完成后，柱层析得7-((三甲基硅基)炔基)-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶。

将7-((三甲基硅基)炔基)-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶536.17mg(1.6mmol)溶于15mL甲醇中，然后加入无水碳酸钾442.27mg(3.2mmol)，常温搅拌2h，反应完成后，加压浓缩除去溶剂，加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后减压浓缩除去溶剂得7-炔基-2-(4-氨基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为7-炔基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-炔基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.83(s,1H),9.68(s,1H),8.74(d,J＝6.5Hz,1H),8.64(s,1H),8.13(s,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,2H),7.66(d,J＝8.2Hz,2H),7.56(d,J＝6.1Hz,1H),6.53(s,1H),3.07(s,1H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：400.3(M+H⁺)。

实施例28 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-炔基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物27)的合成

按实施例27的制备方法，将7-溴-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶换成6-溴-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(6-炔基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.33(s,1H),8.74(s,1H),8.56(d,J＝6.2Hz,1H),8.05(d,J＝6.0Hz,1H),7.66(d,J＝8.2Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),7.27(s,1H),7.00(s,1H),6.29(s,1H),4.02(s,1H),1.05(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：400.3(M+H⁺)。

实施例29 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物28)的合成

将7-溴-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶1.902g(6mmol)溶于20mL的1,4-二氧六环中，依次加入醋酸钾1.766g(18mmol)，联硼酸频那醇酯5.142g(13.5mmol)，氮气保护下加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物489mg(0.6mmol)，氮气保护下90℃反应6h，反应完成后向反应体系中加入冰醋酸0.68mL(12mmol)，2mL水，1.224mL(12mmol)30％的H₂O₂，室温反应2h，反应完成后有固体产生，直接过滤得产物7-羟基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶。

将7-羟基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶510mg(2mmol)溶于15mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，然后依次加入碳酸钾552.8mg(4mmol)，碘甲烷149.6μL(2.4mmol)，常温反应2h，反应完成后向反应液中加入30mL水，搅拌，有固体析出，直接过滤得7-甲氧基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为7-甲氧基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.54(s,1H),8.91(s,1H),8.36(d,J＝7.1Hz,1H),8.11(s,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,2H),7.52(d,J＝8.0Hz,2H),6.95(s,1H),6.60(d,J＝7.0Hz,1H),6.53(s,1H),3.84(s,3H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：406.2(M+H⁺)。

实施例30 1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-乙氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲(化合物29)的合成

按实施例29的制备方法，将碘甲烷替换为碘乙烷，最后用乙醇洗涤得产物1-(5-叔丁基异噁唑-3-基)-3-{4-(7-乙氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苯基}脲。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.55(s,1H),8.90(s,1H),8.35(d,J＝7.2Hz,1H),8.11(s,1H),7.84(d,J＝8.0Hz,2H),7.51(d,J＝8.1Hz,2H),6.92(s,1H),6.59(d,J＝7.2Hz,1H),6.53(s,1H),4.10(dd,J＝13.4,6.6Hz,2H),1.37(t,J＝6.4Hz,3H),1.30(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：420.3 (M+H⁺)。

实施例31 2-(4-(3-(5-叔丁基异噁唑-3-基)脲基)苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基乙酸酯(化合物30)的合成

将7-羟基-2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶510mg(2mmol)溶于15mL二氯甲烷中，依次加入乙酰氯284.4μL(4mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)24.5mg(0.2mmol)，30℃搅拌反应15min，反应完成后减压浓缩除去溶剂，加入50mL乙酸乙酯溶解产物，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后减压浓缩除去溶剂得2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基乙酸酯。

按实施例2的制备方法，将6-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑替换为2-(4-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基乙酸酯，最后用乙醇洗涤得产物2-(4-(3-(5-叔丁基异噁唑-3-基)脲基)苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基乙酸酯。产品的结构鉴定数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.56(s,1H),8.96(s,1H),8.55(d,J＝8.1Hz,1H),8.33(s,1H),7.89(d,J＝7.3Hz,2H),7.54(d,J＝7.9Hz,2H),7.35(s,1H),6.81(d,J＝7.4Hz,1H),6.53(s,1H),2.32(s,3H),1.31(s,9H)。MS(ES⁺)m/z：434.2(M+H⁺)。

药效学实验部分

本实发明中所使用的细胞、激酶、试剂的来源为：IMDM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自美国Sigma公司；PVDF膜购自美国Millipor公司；FLT3抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG和抗鼠购自北京中杉金桥有限公司；IgG、Annexin V-FICT/PI凋亡检测试剂盒、TUNEL(脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)检测试剂盒、Ki67检测试剂盒购自美国Roche公司；MV4-11(人急性髓性白血病细胞株)来自美国模式菌种保存中心(ATCC)；NOD-SCID小鼠，SPF(specific pathogenfree)级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；FLT3抗体、p-FLT3抗体购自美国CellSignaling公司；β-actin抗体购自中国博士德公司。

实施例32 化合物体外MV4-11细胞增殖抑制试验和FLT3激酶检测试验

MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其作用原理是可溶性的四氮唑蓝(Tetrazolium salt,MTT)在活细胞的线粒体脱氢酶的参与下被还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，此作用随细胞的死亡而丧失。20％的SDS水溶液能溶解细胞中的甲瓒，形成溶液，通过自动酶标仪测定570nm处的光密度OD(Optical density，OD)值或称吸光度(A)值的变化可直接反映MV4-11细胞的存活率。在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数量成正比，由此可通过OD值来定量药物对MV4-11细胞的增殖抑制程度。

ADP-Glo^TM激酶检测试剂盒是一个发光法的激酶检测试剂盒，它检测激酶反应中所形成的ADP；ADP被转化成ATP，然后ATP再被Ultra-Glo^TM萤光素酶转化成光，发光信号与激酶活性正相关。当化合物与FLT3结合后，ATP将无法与FLT3结合，从而无法生成ADP，导致发光信号减弱，因此发光信号与化合物和FLT3的结合能力成反比，可通过发光信号的强弱定量化合物与FLT3的结合能力。

表1为部分化合物对MV4-11(人急性髓性白血病细胞株)的体外增殖抑制结果和对FLT3体外作用结果：

表1 部分化合物对MV4-11的体外增殖抑制和对FLT3体外作用结果

注：*文献值：IC50＝0.56nM；**AC220是处于临床Ⅱ期研究的急性髓性白血病(AML)抑制剂，具有较好的治疗AML的效果，测试时以此作为阳性对照，该结果处于正常范围之内；其中，AC220购买于南京天尊泽众化学有限公司，其结构式为：

由上表可以看出，对照物AC220测试结果处于正常范围，从测试数据可以看出，化合物2、9、13、26、27、28在低纳摩尔浓度下均具有较好的体外MV4-11抑制能力，对FLT3也有很好的抑制作用。

化合物2、9、13、26、27、28对MV4-11的抑制作用还具有剂量依赖性，见图1～图6。

实施例33 化合物28的体内活性以及初步机制研究结果

1、化合物28的体内活性

采用皮下接种的方法，在NOD-SCID小鼠身上建立MV4-11移植肿瘤模型，并将其分为对照组和药物治疗组，药物治疗组分别口服给与10，30，60mg/kg化合物28，对照组给与不含药物的空白制剂。在实验过程中，记录裸鼠的肿瘤体积、生活状态等，根据对照组和给药组的肿瘤体积来初步判定药物的体内抗肿瘤活性，并在对照组肿瘤长到一定体积时将小鼠处死，取肿瘤进行免疫组化。

图7所示的实验结果：60mg/kg/d剂量口服给与化合物28可使肿瘤在27天时消退；10mk/kg/d和30mg/kg/d口服给与化合物28，抑瘤率分别为51％和87％。给药期间，小鼠体重未有明显变化。证明口服给与化合物28可在小鼠体内有效抑制MV4-11肿瘤的生长，并且具有剂量依赖性。

Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝***密切相关，在细胞增殖中不可缺少。Ki67试剂盒检测原理：利用免疫学抗原抗体分子由于结构的互补和彼此亲和性所发生特异性结合原理，并通过氧化还原化学反应使标记抗体的酶显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性。首先是联结鼠抗人Ki67免疫组化单克隆抗体和组织上的Ki67抗原；第二是酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物识别已经连接上的Ki67抗体；第三，加入底物，聚合物上的辣根过氧化物酶部分可以催化DAB显色液中的H₂O₂分解，使联苯胺氧化变成联苯亚胺，使组织切片中抗原位点上出现黄色或棕黄色着色；最后对样本进行复染和封片。通过显微镜观测显色情况，推断组织切片上Ki67的存在位点和情况。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素(biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'-OH末端，并与连接辣根过氧化酶(HRP，horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；相反的，正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，所以很少能够被染色。

图8所示的实验结果：化合物28处理后的肿瘤用Ki67染色后发现，与溶剂对照组相比时，增殖的细胞发生明显减少；而用TUNEL染色后发现化合物28处理后的肿瘤组织中凋亡的细胞明显增多。这些数据表明化合物28在体内可以抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡。

2、化合物28对细胞内FLT3磷酸化水平的作用

实验原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(PVDF膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

用不同浓度的化合物28处理MV4-11细胞2个小时后，化合物28显示出了对FLT3表达量及磷酸化水平剂量依赖性的抑制作用，见图9所示。

3、化合物28对细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测原理：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素(FITC、Alexa Fluor488等)标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。另外，碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以检测出凋亡早期、晚期以及死细胞的比例。

不同浓度的化合物28作用于MV4-11，48小时后检测细胞凋亡情况，见图10所示。

结果显示化合物28可以剂量依赖性诱导MV4-11细胞凋亡，100nM浓度时，凋亡细胞比例为29.8％。

综上所述，本发明提供的化合物对MV4-11具有较强的体外增殖抑制作用，且在分子水平对FLT3也有很好的抑制作用。另外，本发明所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得，操作及后处理简单、总产率较高、环境污染较小等优点。

Claims

1.5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基或C1～C6酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C6烷基；n＝0～3。

2.根据权利要求1所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基或C1～C6酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C6烷基；n＝0～2。

3.根据权利要求2所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基；n＝0～2。

4.根据权利要求3所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基；n＝0～2。

5.根据权利要求4所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0～2。

6.根据权利要求5所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：X₁、X₂、X₃独立地为C、N、O或S；Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0或1。

7.根据权利要求1所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：当X₁、X₃为N，X₂为C时，其结构如式Ⅱ所示：

其中，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N、O或S；

8.根据权利要求7所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基或C1～C6酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C6烷基；n＝0～2。

9.根据权利要求8所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基；n＝0～2。

10.根据权利要求9所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基；n＝0～2。

11.根据权利要求10所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0～2。

12.根据权利要求11所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素；n＝0或1。

13.根据权利要求7所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：当n＝1时，其结构如式Ⅲ所示：

其中，Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N、O或S；

R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基或C1～C6酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C6烷基。

14.根据权利要求13所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基或C1～C6酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C6烷基。

15.根据权利要求14所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基。

16.根据权利要求15所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基。

17.根据权利要求16所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：Y₁、Y₂、Y₃独立地为C、N或S；R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素。

18.根据权利要求13所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：当Y₁、Y₂、Y₃均为C时，其结构如式Ⅳ所示：

其中，R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C3～C8环烷基或C1～C6酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C6烷基。

19.根据权利要求18所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C1～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基。

20.根据权利要求19所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H、卤素、-CF₃或C1～C4烷基。

21.根据权利要求20所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其特征在于：R₁为-H、卤素、-CF₃、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、C2～C4烯基、C2～C4炔基、C3～C6环烷基或C2～C4酰氧基；R₂为-H或卤素。

22.5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物，其结构式为：

23.权利要求1～22任一项所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物药学上可接受的盐。

24.一种药物组合物，是由权利要求1～22任一项所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物或权利要求23所述的盐添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

25.权利要求1～22任一项所述的5-叔丁基异噁唑-3-基-3-(4-取代苯基)脲衍生物或权利要求23所述的盐在制备治疗急性髓性白血病药物中的用途。