CN105794853B - 沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病中的应用，沼泽红假单胞菌发酵液由沼泽红假单胞菌LY‑6（Rhodopseudomonas palustris LY‑6）培养得到。本发明首次利用沼泽红假单胞菌应用于防控稻瘟病，具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点。

Description

沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病中的应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病中的应用。
背景技术
稻瘟病是水稻的重要病害之一，该病分布广泛，全世界约有80余个国家和地区发生此病，我国南北稻区也均有发生。病害流行地区，一般减产10%～20%，严重时可达40%～50%，特别重的田块甚至颗粒无收。对于稻瘟病的防治，目前还是以化学防治为主，但由于抗药性增强及发现不及时，农药施用极不科学合理，农药施用剂量与次数严重超标，引起环境污染和农产品质量安全等重大问题。因此，如何减少农药用量以及绿色综合防控稻瘟病仍然是当前我国水稻生产上面临的重要问题。
生物防治以其无毒、无害、无污染、不易产生抗药性和高效等优点，在植物病虫害防治中越来越受到人们的重视。光合细菌（Photosynthetic Bacteria，PBS）是能在厌氧条件下进行不放氧气的光合作用的一类细菌的总称，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。其种类繁多、分布广泛，普遍存在于海洋、江河、湖泊、水田、活性污泥和土壤中，已知的光合细菌共有绿硫细菌科（Chlorobiaceae）、红硫细菌科（Chromatiaceae）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）3个科。光合细菌在培养过程中会分泌大量的蛋白和次生代谢产物，其复杂的代谢功能和独特的生理生态特性使其在农畜业、饲料、环保、食品加工、生物能源和医药保健等领域得到广泛应用。
目前在稻瘟病的生物防治研究方面已经取得了一定的进展。在微生物源生物农药中，芽孢杆菌和木霉属真菌都能有效的抑制稻瘟病菌的营养生长，而放线菌发酵液对稻瘟病叶瘟的防治也有一定的效果。光合细菌沼泽红假单胞菌发酵液在稻瘟病的防控上还未曾见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病中的应用，利用沼泽红假单胞菌菌株制成的菌剂，生产成本低，对稻瘟病防控效果显著。
为解决上述技术问题，提供了一种沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病的应用，所述沼泽红假单胞菌发酵液由沼泽红假单胞菌LY-6（Rhodopseudomonas palustris LY-6）培养得到。优选的，所述培养方法包括活化、种子培养、生产培养、离心过滤等步骤。
上述的应用，优选的，所述稻瘟病为水稻叶瘟，所述沼泽红假单胞菌发酵液在防控水稻叶瘟中的应用方法为：将所述沼泽红假单胞菌发酵液喷施于分蘖后期的水稻叶片上。
上述的应用，优选的，所述稻瘟病为水稻穗瘟，所述沼泽红假单胞菌发酵液在防控水稻穗瘟中的应用方法为：将所述沼泽红假单胞菌发酵液喷施于抽穗期的水稻叶片。上述的应用，优选的，所述沼泽红假单胞菌发酵液的喷施量为15 L/亩～20 L/亩，每隔10 d～15d喷施一次。
上述的应用，优选的，所述沼泽红假单胞菌发酵液的制备方法具体包括以下步骤：
（1）活化：将沼泽红假单胞菌LY-6的菌株按双层平板培养法培养至红色单菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养的红色单菌落接入至接入至血清瓶中，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液；
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期；
（4）发酵液制备：将步骤（3）生产培养得到的菌液离心过滤，收集滤液，即为沼泽红假单胞菌发酵液。
上述的应用，优选的，所述步骤（2）中，种子培养在温度为30℃～32℃、光照条件为2500 Lx～4000 Lx、pH为7.0条件下进行。
上述的应用，优选的，所述步骤（3）中，生产培养在温度为30℃～32℃、光照条件为2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0条件下进行。
上述的应用，优选的，所述步骤（3）中所述菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5 %～10 %。
上述的应用，优选的，所述步骤（4）中，所述离心的转速为8000 rpm～12000 rpm、温度为4℃、离心时间为15 min～20 min。
上述的应用，优选的，所述步骤（4）中，所述离心过滤具体为取离心后的上清液，用0.22 μm滤膜进行抽滤。
本申请所采用的沼泽红假单胞菌LY-6 (Rhodopseudomonas palustris LY-6)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2014525（沼泽红假单胞菌LY-6已申请专利保护，专利申请号：201410750073.2），保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2014年11月5日，该菌株被命名为沼泽红假单胞菌LY-6（Rhodopseudomonas palustris LY-6）。
所述沼泽红假单胞菌菌株LY-6，具有以下主要特征：革兰氏阴性，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌，主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4 d～8 d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2 mm～0.60 mm；液体培养基中培养7 d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30 ℃～32 ℃，pH=7。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明提供了一种沼泽红假单胞菌LY-6在防控稻瘟病的应用，沼泽红假单胞菌LY-6的发酵液中含有外泌蛋白和代谢产物，可有效防治稻瘟病，如水稻叶瘟、水稻穗瘟；具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点。
（2）本发明的沼泽红假单胞菌LY-6的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到用于稻瘟病防控的发酵液。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实例2中发酵液在大田对水稻叶瘟的防治效果对比图。
图2为本发明实例3中发酵液在大田对水稻穗瘟的防治效果对比图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。本发明的沼泽红假单胞菌LY-6（Rhodopseudomonas palustris LY-6），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014525，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2014年11月5日。
实施例1：
一种本发明的沼泽红假单胞菌LY-6发酵液的制备方法，包括以下步骤：
（1） 活化：将沼泽红假单胞菌LY-6菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：（NH4）2SO4 0.1 wt%、Mg SO4 0.02 wt%、NaHCO3 0.5 wt%、K2HPO4 0.05 wt%、NaCl 0.02 wt%、酵母膏0.15 wt%和琼脂1.5 wt%，pH=7.0。
（2）种子培养：将步骤（1）培养出得红色单菌落接入至120 mL血清瓶中，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期；采用的培养基为光合细菌液体培养基，配方为：（NH4）2SO4 0.1 wt%、MgSO4 0.02wt%、NaHCO3 0.5 wt%、K2HPO4 0.05 wt%、NaCl 0.02 wt%、酵母膏0.15 wt%（均为质量分数），pH=7.0。
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基（培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致）进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5 %，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0条件下，培养至对数生长期。经过步骤（3）生产培养后的菌液，其菌液浓度为5×109 cfu/mL。
（4）发酵液制备：将步骤（3）生产培养得到的菌液进行8000 rpm、4℃、15 min离心后，收集上清，然后用0.22μm滤膜进行抽滤去除上清中残留的菌体，收集滤液，即制得沼泽红假单胞菌发酵液。
对比例1：
将实施例1中获得的发酵液放入灭菌锅中，121℃下灭活30 min即获得失活的发酵液。
实施例2：沼泽红假单胞菌LY-6发酵液田间对叶瘟的防控
分别将实施例1制得的发酵液、对比例1中制得的失活的发酵液、化学农药（稻瘟灵，120 mL/亩）喷施于分蘖后期的水稻叶片，每个处理设3个重复，每亩20 L，每隔15 d喷施一次，共施用3次。最后一次施药15 d后，按5点法取样计算水稻叶片病情指数，并计算各自的防治效果。
图1为对比例1的失活的发酵液、实施例1的发酵液以及化学农药对水稻叶瘟的防治效果对比图，A、B代表显著性差异（P<0.01）。从图1中可知：施用失活的发酵液、发酵液以及农药各自的防治效果为8.7 %、47.4 %和44.4 %，并且通过统计分析发现，喷施发酵液和化学农药的防治效果没有显著性差异。
实施例3：沼泽红假单胞菌LY-6发酵液田间对穗瘟的防控
分别将实施例1制得的发酵液、对比例1中制得的失活的发酵液和化学农药（稻瘟灵，120 mL/亩）喷施于抽穗期的水稻叶片，每个处理设3个重复，每亩20 L，每隔15 d喷施一次，共施用2次。15 d后，按5点法取样计算水稻穗子病情指数，并计算各自的防治效果。
图2为对比例1的失活的发酵液、实施例1的发酵液以及化学农药对水稻穗瘟的防治效果对比图，A、B代表显著性差异（P<0.01）。施用失活的发酵液、发酵液以及农药各自的防治效果为11.4 %、34.7 %和46.3 %，并且通过统计分析发现，喷施发酵液和化学农药的防治效果没有显著性差异。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.沼泽红假单胞菌发酵液在防控稻瘟病中的应用，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌发酵液由沼泽红假单胞菌LY-6（Rhodopseudomonas palustris LY-6）经活化、种子培养、生产培养至对数生长期，然后将菌液经离心过滤，收集滤液得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述稻瘟病为水稻叶瘟，所述沼泽红假单胞菌发酵液在防控水稻叶瘟中的应用方法为：将所述沼泽红假单胞菌发酵液喷施于分蘖后期的水稻叶片上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述稻瘟病为水稻穗瘟，所述沼泽红假单胞菌发酵液在防控水稻穗瘟中的应用方法为：将所述沼泽红假单胞菌发酵液喷施于抽穗期的水稻叶片。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌发酵液的喷施量为15 L/亩～20 L/亩，每隔10 d～15 d喷施一次。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌发酵液的制备方法具体包括以下步骤：
（1）活化：将沼泽红假单胞菌LY-6的菌株按双层平板培养法培养至红色单菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养的所述红色单菌落接入至血清瓶中，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液；
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的所述菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期；
（4）发酵液制备：将步骤（3）生产培养得到的菌液离心过滤，收集滤液，即为沼泽红假单胞菌发酵液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，种子培养在温度为30℃～32℃、光照条件为2500 Lx～4000 Lx、pH为7.0条件下进行。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，生产培养在温度为30℃～32℃、光照条件为2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0条件下进行。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中所述菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5 %～10 %。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，所述离心的转速为8000rpm～12000 rpm、温度为4℃、离心时间为15 min～20 min。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，所述离心过滤具体为取离心后的上清液，用0.22 μm滤膜进行抽滤。
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