CN105779562A - 一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，涉及生态环境保护领域。其步骤是：分别采集小麦在不同土壤化学计量比的根际土壤，将根际土壤在20‑300C下风干，过2‑3mm筛后溶于去离子水，得到混合液；测定土壤含水量：先将铝盒放在烘箱中烘干，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温，称量烘干土壤+铝盒的重量；土壤悬浮液制备：称取风干的新鲜土壤样品，置于经灭菌的锥形瓶中，得到土壤悬浮液；培养基制备；接种于培养；计数与计算。本发明检测方法操作简单，有效克服了土壤腐殖质的干扰，能够对不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量变化做出准确测定。

Description

一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法

技术领域：

本发明涉及生态环境保护领域，主要涉及一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，适合于高等学校、科研单位、医疗卫生和环境保护部门等测定土壤微生物的数量。

背景技术：

随着我国化肥工业的发展，化肥成为维持我国农业稳产增产最重要的生产资料，至2011年我国单位耕地面积化肥使用量已高达468.7kg/hm²。不可否认，化肥的大量使用对促进我国粮食增产、农民增收和保障我国粮食安全发挥了重要的作用。然而，持续的过量化肥施用及其低效利用造成了大量氮磷养分的流失，进而严重威胁到区域的生态安全。2010年《第一次全国污染源普查公报》已指出，化肥的过量施用已成为我国农业面源污染的主要来源。因此，关于化肥减施增效途径探索的研究持续被报道。基于作物的生态化学计量理论，进行作物施肥管理，极有可能是实现化肥减施增效的又一条途径。生态化学计量学是研究植物生态过程中体内不同元素比例关系的一种理论，被认为是连接植物与元素的桥梁。基于作物的生态化学计量理论，进行作物施肥管理，极有可能是实现化肥减施增效的又一条途径。

根际作为土壤-植物生态***物质交换的活跃界面，是植物-土壤-微生物三者互作的场所，其微生物种群特征不仅可反映根际土壤养分循环和呼吸状况，而且还能较植物更敏感地反映土壤养分状况。小麦作为我国主要的粮食作物，其产量直接影响我国的粮食安全供应，因此研究小麦在不同土壤化学计量比根际土壤微生物数量的变化，对保障我国粮食安全和农业可持续性发展具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是在于提供了一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，该方法操作简便、快速、技术要求相对较低，测定结果精密度和准确度高、重复性好，适合于大批量土壤样品微生物数量的精确测定。

技术方案：为实现以上目的，本发明主要采取以下技术措施：

首先对土壤样品进行前处理，再测定土壤含水量，然后称取土壤加无菌水制备土壤悬浮液，再用经灭菌的电动移液器将土壤悬浮液进行稀释，然后分别经灭菌的电动移液器取适宜稀释度的土壤悬浮液于平板培养基中，涂抹后进行培养，然后计数培养后平板培养基上的菌落数，再计算土壤微生物的数量。

一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，按照下述步骤进行：

（1）分别采集小麦在不同氮磷比的根际土壤，将根际土壤在20-30⁰C下风干，过2-3mm筛后溶于去离子水，得到混合液。

（2）测定土壤含水量：先将铝盒放在烘箱中于103⁰C下烘干8-10小时，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温，称取铝盒重量，取10-20克新鲜土壤样品放入上述烘干后的铝盒中，称量新鲜土壤+铝盒的重量，将其放入烘箱中在103⁰C下烘干20-24小时，取出置于上述干燥器中冷却至室温，然后称量烘干土壤和铝盒的重量，计算土壤含水量；

（3）土壤悬浮液制备：称取新鲜土壤样品，置于经灭菌的250-325毫升乐扣杯中，再加入无菌水，使加入的土壤与无菌水比例为1g:9ml，将装有土壤悬浮液的乐扣杯置于震荡器中震荡，使土壤分散，即得到10^-1土壤悬浮液。取10^-1土壤悬浮液10ml，再加入无菌水90ml，即得到10^-2土壤悬浮液。依次稀释10倍土壤悬浮液，即得到10^-3～10^-6土壤悬浮液。

（4）培养基制备：分别配置检测土壤真菌培养基、检测土壤放线菌培养基和检测土壤细菌培养基，将培养基在121⁰C下灭菌30分钟，冷却至40-50⁰C后，将培养基倒入经灭菌培养皿中制备平板培养基。

（5）接种于培养：用经灭菌的电动移液器取上述10^-2～10^-4土壤悬浮液0.1毫升，置于检测土壤真菌培养基中，用经灭菌的电动移液器取上述10^-3～10^-5土壤悬浮液0.1毫升，置于检测土壤放线菌培养基中，用经灭菌的电动移液器取上述10^-4～10^-6土壤悬浮液0.1毫升，置于检测土壤细菌培养基中，每个稀释度重复3次，用经酒精灯火焰灭菌的刮铲将培养基表面悬浮液涂抹均匀，置于28⁰C下培养3-5天（根际土壤全类真菌），28⁰C下培养5-7天（根际土壤全类放线菌），300C下培养1-2天（根际土壤全类细菌）。

（6）计数与计算：选择培养皿中生长的菌落数为20-100个菌落的稀释度进行计算，采用“单位质量干土中菌数等于菌落平均数与稀释倍数的乘积除以干土所占百分比”计算以上各微生物数量。

其中步骤（2）中采用下列公式计算土壤含水量：

土壤含水量%={1-[ （烘干土壤+铝盒）（g）-铝盒（g）] / [（新鲜土壤+铝盒）（g）-铝盒（g）]}×100%。

用于实现本发明检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的培养基配方：

（1）检测土壤真菌培养基：磷酸二氢钾1克、七水硫酸镁0.5克、蛋白胨5克、琼脂15克、水1升，灭菌121⁰C。

（2）检测土壤放线菌培养基：可溶性淀粉20克、硝酸钾1克、氯化钠0.5克、三水磷酸氢二钾0.5克、七水硫酸镁0.5克、七水硫酸铁0.01克、琼脂20克、水1升、pH7.4～7.6，灭菌121⁰C。

（3）检测土壤细菌培养基：牛肉膏3克、蛋白胨10克、氯化钠5克、琼脂15克、水1升、pH7.4～7.6，，灭菌121⁰C。

本发明具有以下优点：

1.使用本发明检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，测定不同土壤化学计量比小麦根际土壤真菌、放线菌和细菌数量的结果不仅精密度和准确度高，而且重复性好。

2.本发明检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，排出了土壤水分导致测定结果偏低的影响，提高了测定准确性。

3.本发明检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，实用性广，适合于强筋、弱筋小麦在不同土壤化学计量比下根际土壤中微生物数量的测定。

附图说明

图1为本发明一种强筋小麦在不同土壤化学计量比对根际土壤真菌的影响示意图。

图2为本发明一种强筋小麦在不同土壤化学计量比对根际土壤放线菌的影响示意图。

图3为本发明一种强筋小麦在不同土壤化学计量比对根际土壤细菌的影响示意图。

图4为本发明一种弱筋小麦在不同土壤化学计量比对根际土壤真菌的影响示意图。

图5为本发明一种弱筋小麦在不同土壤化学计量比对根际土壤放线菌的影响示意图。

图6为本发明一种弱筋小麦在不同土壤化学计量比对根际土壤细菌的影响示意图。

具体实施方式

一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，包括以下步骤：

（1）土壤前处理1：对于检测不同化学计量比小麦根际土壤微生物数量的样品，应在晴天采样，采样时用直径为2厘米的土钻采10钻根际土壤。采集的土壤应先去除样品中可见的植物残体和动物以及小石子，再将土壤样品彻底混合均匀，将根际土壤在20-30⁰C下风干，过2-3mm筛。

（2）测定土壤含水量2：先将铝盒放在烘箱中于103⁰C下烘干8-10小时，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温（20-25⁰C，以下相同），称取铝盒重量，取10-20克新鲜土壤样品放入上述烘干后的铝盒中，称量新鲜土壤+铝盒的重量，将其放入烘箱中在103⁰C下烘干20-24小时，取出置于上述干燥器中冷却至室温（20-25⁰C），然后称量烘干土壤+铝盒的重量，采用下列公式计算土壤含水量：

土壤含水量%={1-[ （烘干土壤+铝盒）（g）-铝盒（g）] / [（新鲜土壤+铝盒）（g）-铝盒（g）]}×100%。

例如：测定某土壤的含水量，铝盒重量为13.66克，新鲜土壤+铝盒重量为24.66克，烘干土壤+铝盒重量为21.34克，那么，该土壤的含水量=[1-（21.34-13.66）/（24.66-13.66）]×100%=30.18%，即每100克新鲜土壤中含有30.18克水分。

通常土壤含水量为12%-50%。若不测定土壤含水量，在制备土壤悬浮液时不考虑土壤中的水分，将使土壤悬浮液的稀释度升高，导致测定的土壤微生物数量结果偏低，影响测定的准确性。本发明在土壤悬浮液制备时，通过测定的土壤含水量，准确计算出相当于10克烘干重的新鲜土壤中的水分量，使加入的无菌水量与土壤中水分量之和为90毫升，从而得到准确的10^-1土壤悬浮液。

（3）土壤悬浮液制备3：称取相当于10克烘干重的上述新鲜土壤样品，在无菌工作台上，将土壤置于经灭菌（121⁰C，30分钟）的250-325毫升乐扣杯中，用经灭菌（121⁰C，30分钟）的瓶口分液器（Socorex Calibrex 521，10-100毫升，瑞士产）加入无菌水，使加入的无菌水与土壤中水之和为90毫升，将装有土壤悬浮液的乐扣杯盖紧后置于震荡器中，在120转/分钟下震荡30分钟，使土壤彻底分散，即得到10^-1土壤悬浮液。例如：采用上述含水量为30.18%的土壤制备悬浮液时，应称取19.76克新鲜土壤，再加无菌水至90毫升，即得到准确的10^-1土壤悬浮液。

（4）培养基配置4：检测土壤真菌培养基配置：称取磷酸二氢钾1克、七水硫酸镁0.5克、蛋白胨5克、琼脂15克于2升烧杯中，加水1升，边加热边搅拌煮沸，使试剂融化，然后将培养基分装至500毫升三角瓶中，每瓶装培养基250毫升，在瓶口加塞棉塞，将装有培养基的三角瓶置于高压灭菌锅中，在121⁰C灭菌30分钟。检测土壤放线菌培养基配置：称取可溶性淀粉20克、硝酸钾1克、氯化钠0.5克、三水磷酸氢二钾0.5克、七水硫酸镁0.5克、七水硫酸铁0.01克、琼脂20克于2升烧杯中，加水1升、调节pH7.4～7.6，按上述相同方法进行培养基分装、灭菌。检测土壤细菌培养基配置：称取牛肉膏3克、蛋白胨10克、氯化钠5克、琼脂15克于2升烧杯中，加水1升、调节pH7.4～7.6，按上述相同方法进行培养基分装、灭菌。取出灭菌后的培养基冷却至40-50⁰C时，在无菌工作台上，将上述真菌、放线菌和细菌培养基分别倒入经灭菌（121⁰C，45分钟）的直径为9厘米的培养皿中，每个培养皿倒入培养基15-20毫升。即可分别得到真菌、放线菌和细菌平板培养基。

（5）接种于培养5：用经灭菌（121⁰C，30分钟）的电动移液器（BIOHIT eLINE，5-300毫升，芬兰产）分别取上述10^-2～10^-4、 10^-3～10^-5和 10^-4～10^-6土壤悬浮液0.1毫升，分别接种到检测土壤细菌、放线菌和真菌培养基中，每个稀释度重复3次，用经酒精灯火焰灭菌的刮铲将培养基表面悬浮液涂抹均匀，置于28⁰C下培养3-5天（真菌），28⁰C下培养5-7天（放线菌），30⁰C下培养1-2天（细菌）。

（6）计数与计算6：选择培养基中生长的菌落数为20-100个菌落的稀释度进行计数。采用“单位质量干土中菌数等于菌落平均数与稀释倍数的乘积除以干土所占百分比”计算以上各微生物数量。

以下是不同土壤化学计量比对不同小麦根际土壤微生物数量影响实验：

（1）土壤采集和处理

取不同土壤化学计量比下小麦根际土壤，除去其中可见动植物残体，过筛（孔径2-3mm），混匀，置密封的塑料桶内。

（2）实验处理

实验为裂区设计，主区为氮肥处理，设四个施氮水平：0(N0)、100(N1)、150(N2)和200(N3)mg N kg-1，裂区为磷肥处理，设四个施磷水平：0(P0)、20(P1)、40(P2)和60(P3)mg N kg-1，所有处理均施K₂O为底肥，3次重复。小麦于2014年10月14日播种，每盆播种14株，3叶期后留苗7株。于2015年6月3日小麦成熟收割后，取小麦根际土壤。

（3）测定结果阐述

测定结果表明，对于强筋小麦根际土壤，测定的各处理根际土壤真菌数量变化趋势为，强筋小麦根际土壤真菌数量在低土壤氮磷化学计量比时显著高于高土壤氮磷化学计量比（图1），即低土壤氮磷化学计量比显著促进强筋小麦根际土壤真菌的数量。测定的各处理根际土壤放线菌数量变化趋势为，强筋小麦根际土壤放线菌数量在高土壤氮磷化学计量比时显著高于低土壤氮磷化学计量比（图2），即高的土壤氮磷化学计量比显著促进强筋小麦根际土壤放线菌的数量。测定的各处理根际土壤细菌数量变化趋势为，强筋小麦根际土壤细菌数量在低和高的土壤氮磷化学计量比时显著高于中等土壤氮磷化学计量比（图3），即土壤氮磷化学计量比从低到高对强筋小麦根际土壤细菌的数量表现为先抑制后促进。这阐明该方法能准确的预测土壤氮磷化学计量比对强筋小麦根际土壤微生物数量的变化。

对于弱筋小麦根际土壤，测定的各处理根际土壤真菌数量变化趋势为，弱筋小麦根际土壤真菌数量在低土壤氮磷化学计量比时显著高于高土壤氮磷化学计量比（图4），即低土壤氮磷化学计量比显著促进弱筋小麦根际土壤真菌的数量。测定的各处理根际土壤放线菌数量变化趋势为，弱筋小麦根际土壤放线菌数量在低和高的土壤氮磷化学计量比时显著低于中等土壤氮磷化学计量比（图5），即土壤氮磷化学计量比从低到高对弱筋小麦根际土壤放线菌的数量表现为先促进后抑制。测定的各处理根际土壤细菌数量变化趋势为，弱筋小麦根际土壤细菌数量在低土壤氮磷化学计量比时显著低于高土壤氮磷化学计量比（图6），即低土壤氮磷化学计量比显著抑制弱筋小麦根际土壤真菌的数量。这阐明该方法能准确的预测土壤氮磷化学计量比对弱筋小麦根际土壤微生物数量的变化。

由于本方法测定方法简单，测定的结果误差小，准确度高，可用于研究不同土壤氮磷化学计量比对强筋和弱筋小麦根际土壤真菌、放线菌和细菌数量的变化。实验结果表明，对于强筋小麦根际土壤，磷元素能促进根际土壤真菌的数量，氮元素能促进根际土壤放线菌和真菌数量。对于弱筋小麦根际土壤，高浓度的磷和磷元素对于根际土壤真菌、放线菌和细菌均有一定的抑制作用。

Claims (3)

1.一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）分别采集小麦在不同氮磷比的根际土壤，将根际土壤在20-30⁰C下风干，过2-3mm筛后溶于去离子水，得到混合液；

（2）测定土壤含水量：先将铝盒放在烘箱中于103⁰C下烘干8-10小时，取出铝盒置于下部放有部分干燥硅胶的干燥器中冷却至室温，称取铝盒重量，取10-20克新鲜土壤样品放入上述烘干后的铝盒中，称量新鲜土壤+铝盒的重量，将其放入烘箱中在103⁰C下烘干20-24小时，取出置于上述干燥器中冷却至室温，然后称量烘干土壤和铝盒的重量，计算土壤含水量；

（3）土壤悬浮液制备：称取新鲜土壤样品，置于经灭菌的250-325毫升乐扣杯中，再加入无菌水，使加入的土壤与无菌水比例为1:9g/ml，将装有土壤悬浮液的乐扣杯置于震荡器中震荡，使土壤分散，即得到10^-1土壤悬浮液；取10^-1土壤悬浮液10ml，再加入无菌水90ml，即得到10^-2土壤悬浮液；依次稀释10倍土壤悬浮液，即得到10^-3～10^-6土壤悬浮液；

（4）培养基制备：分别配置检测土壤真菌培养基、检测土壤放线菌培养基和检测土壤细菌培养基，将培养基在121⁰C下灭菌30分钟，冷却至40-50⁰C后，将培养基倒入经灭菌培养皿中制备平板培养基；

（5）接种于培养：用经灭菌的电动移液器取上述10^-2～10^-4土壤悬浮液0.1毫升，置于检测土壤真菌培养基中，用经灭菌的电动移液器取上述10^-3～10^-5土壤悬浮液0.1毫升，置于检测土壤放线菌培养基中，用经灭菌的电动移液器取上述10^-4～10^-6土壤悬浮液0.1毫升，置于检测土壤细菌培养基中，每个稀释度重复3次，用经酒精灯火焰灭菌的刮铲将培养基表面悬浮液涂抹均匀，置于28⁰C下培养3-5天（根际土壤全类真菌），28⁰C下培养5-7天（根际土壤全类放线菌），300C下培养1-2天（根际土壤全类细菌）；

（6）计数与计算：选择培养皿中生长的菌落数为20-100个菌落的稀释度进行计算，采用“单位质量干土中菌数等于菌落平均数与稀释倍数的乘积除以干土所占百分比”计算以上各微生物数量。

2.根据权利要求1所述的一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，其特征在于其中步骤（2）中采用下列公式计算土壤含水量：

土壤含水量%={1-[ （烘干土壤+铝盒）（g）-铝盒（g）] / [（新鲜土壤+铝盒）（g）-铝盒（g）]}×100%。

3.根据权利要求1所述的一种检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的方法，其特征在于用于检测不同土壤化学计量比小麦根际土壤微生物数量的培养基配方：

（1）检测土壤真菌培养基：磷酸二氢钾1克、七水硫酸镁0.5克、蛋白胨5克、琼脂15克、水1升，灭菌121⁰C；

（2）检测土壤放线菌培养基：可溶性淀粉20克、硝酸钾1克、氯化钠0.5克、三水磷酸氢二钾0.5克、七水硫酸镁0.5克、七水硫酸铁0.01克、琼脂20克、水1升、pH7.4～7.6，灭菌121⁰C；

（3）检测土壤细菌培养基：牛肉膏3克、蛋白胨10克、氯化钠5克、琼脂15克、水1升、pH7.4～7.6，，灭菌121⁰C。