CN105779425A - 一种l-核糖异构酶及其在生物法制备l-核糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑核糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该L‑核糖异构酶具有较好的热稳定性和pH稳定性，对L‑核酮糖的催化效率能达到85％以上。本发明还公开了包含上述L‑核糖异构酶的重组菌以及该重组菌的构建方法，该重组菌对L‑核酮糖的催化效率能达到81％以上。本发明描述的L‑核糖异构酶对于L‑核糖的工业化生产具有很好的应用前景与经济价值。
Description
技术领域
本发明属于一种技术领域，具体涉及来自发酵放线纤维菌(Actinotaleafermentans NX-1)的L-核糖异构酶及其应用。
背景技术
L-核糖属于极其稀有的单糖，是一种重要的医药中间体，具有重要的医学价值，由L-核糖合成的各种L-核糖衍生物，广泛应用于抗病毒与抗肿瘤领域。
目前L-核糖的制备主要采用化学法，需要经历至少7步的复杂反应，而且面临副产物多，产率低下等问题。L-核糖异构酶(L-RI)能够以L-核酮糖为原料制备L-核糖，具备反应温和、产率高等特点，而L-核酮糖能够通过生物法从L-***糖催化得到。目前文献仅报道了三种L-核糖异构酶，分别来源于Acinetobacter sp.DL-28，Geodermatophilus obscurusDSM43160和Cellulomonas parahominis MB426。然而已发现的L-RI对L-核酮糖的催化效率均不高，因此挖掘对L-核酮糖具有高催化能力的L-RI对于生产L-核糖有着极其重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种对L-核酮糖具有高催化能力的L-核糖异构酶。
本发明还要解决的技术问题是，提供一株包含上述L-核糖异构酶的基因工程菌及其构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述L-核糖异构酶和上述基因工程菌在制备L-核糖中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种L-核糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该L-核糖异构酶来自发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)。
编码权利要求1所述L-核糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组质粒，该重组质粒含有上述L-核糖异构酶基因。
一种重组菌，该重组菌含有上述L-核糖异构酶基因。
上述重组菌的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到质粒上，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至宿主菌，即得到重组菌。
其中，所述的质粒为pET-28a(+)，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
具体的质粒构建方法与重组菌构建方法如下：
(1)构建表达质粒：利用如下引物序列扩增SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
引物1：5’-CGGGATCC(BamH I)ATGACCCGTACGTATGTGACCCGTC-3’；
引物2：5’-CCCAAGCTT(Hind III)TTAGCGAATGTGCGTCACCAGACGG-3’；
PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，ExTag聚合酶0.5μL，ddH2O14μL；
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；然后54℃退火2min，72℃延伸5min，循环30次,4℃保存；
回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a-afri；
(2)构建重组菌：将重组质粒pET-28a-afri转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；经抗性培养基筛选得到阳性克隆：分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶BamH I和Hind III酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-28a-afri，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为重组菌。
对重组质粒pET-28a-afri进行测序，结果表明***片段为一个含有747bp，编码249个氨基酸组成的蛋白质。
上述L-核糖异构酶在制备L-核糖中的应用。
其中，以1～100g/L的L-核酮糖为底物，L-核酮糖浓度优选为100g/L，加入L-核糖异构酶进行酶转化反应，酶的用量为10～500U，L-核糖异构酶的添加量优选为20U；反应温度30～70℃，反应温度优选为37℃；转化时间1～12h，转化时间优选为3h。
其中，L-核糖异构酶的酶活定义方法为：以L-核酮糖为底物，单位时间内催化生成1μmol L-核糖所需的L-核糖异构酶的酶量定义为1U。
上述L-核糖异构酶的制备方法：
将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3h，至OD600为0.6时加入0.2～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或0.5～20g/L的乳糖，继续诱导表达6～20h后，离心收集菌体。
将得到的菌体悬于pH7.0磷酸钾缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心，收集上清液(粗酶液)，粗酶液经0.22μm滤膜过滤后，使用Ni-NTA亲和树脂进行纯化，得到L-核糖异构酶纯酶。本发明可以利用纯化后的酶或者粗酶液添加到反应体系中。
上述重组菌在制备L-核糖中的应用。
其中，以1～100g/L的L-核酮糖为底物，L-核酮糖的添加量为100g/L；加入重组菌进行转化反应，重组菌的加入量为10～100g/L(以菌体湿重计算)，重组菌的添加量为50g/L湿菌体；反应温度30～70℃，反应温度优选为37℃；转化时间1～48h，转化时间优选为3h。
上述重组菌的制备方法：
将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3h，至OD600为0.6时加入0.2～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或0.5～20g/L的乳糖，继续诱导表达6～20h后，离心收集菌体。
有益效果：本发明提供了一种L-核糖异构酶，该酶具有较好的稳定性，反应温度为30～70℃，反应pH为5.5～10，该L-核糖异构酶显示出对L-核酮糖极高的催化效率。该对L-核酮糖具有高催化能力的L-核糖异构酶在最适催化条件下，对L-核酮糖的转化率可达75％以上，对于L-核糖的工业化生产具有广泛的应用前景和经济价值。
附图说明
图1为重组质粒pET-28-afri的构建示意图。
图2 L-核糖异构酶制备L-核糖的反应曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：来源于发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)的基因组提取。
发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)为本实验室保藏，用GenomicDNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的发酵放线纤维菌(Actinotalea fermentans NX-1)的基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。
实施例2：L-核糖异构酶编码基因(afri)的克隆和重组菌构建。
2.1 afri基因的PCR扩增。
根据GeneBank上已有的功能未知序列(Genbank登录号No.WP_034244055)，运用VectorNTI软件设计引物Primer1和Primer2，引物序列为：
引物1：5’-CGGGATCC(BamH I)ATGACCCGTACGTATGTGACCCGTC-3’；
引物2：5’-CCCAAGCTT(Hind III)TTAGCGAATGTGCGTCACCAGACGG-3’；
以实施例1获得的基因组为模板，扩增发酵放线纤维菌基因片段。
PCR扩增体系为：基因组DNA 2μL，引物Primer1和Primer2各1μL，dNTP2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，Ex-Tag聚合酶0.5μL，ddH2O 14μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；然后54℃退火2min，72℃延伸5min，循环30次,4℃保存。
将扩增条带切胶后用Axygen公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于Takara公司pMD18-T载体上并转化大肠杆菌JM109。通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。将测得全长序列在GenBank数据库中进行分析，并借助Vector NTI软件确定其中的完整阅读框。
2.2 afri基因的表达
利用pET-28a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确认基因克隆的正确性。
2.2.1限制性酶切反应，纯化及连接反应
经纯化后的PCR产物，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的酶进行酶切反应。本实验中，所用的酶是BamH I和Hind III。酶切体系为：PCR产物或质粒溶液12.5μL，BamH I 1μL，Hind III 1μL，10×缓冲液2.5μL，ddH2O 8μL，总体积25μL。
由于所选用的两个酶切位点在pET-28a(+)空质粒上相距很近(约30bp)，因此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需要经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的目的。
经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的质粒4μL，T4连接酶1μL，10×连接酶缓冲液1μL。连接后获得重组质粒pET-28-afri，其主要结构如图1所示。
2.2.2质粒制备与转化
质粒抽提采用质粒提取试剂盒，参照生产商的说明书进行操作。质粒转化细胞使用氯化钙法。
2.2.3重组质粒pET-28-afri的转化
(1)取0.1-1μg重组质粒pET-afri DNA于200μL感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上1-3min。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min。
(4)取200μL菌体涂布于选择性LB固体培养基表面。37℃培养12-16h至单菌落出现。
2.2.4重组子的鉴定
将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用BamH I和HindIII对重组质粒进行单-双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段***质粒pET-28-afri，含此重组质粒pET-28-afri的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌BL21-AFRI。测序结果显示***片段含有一个长747bp的开放阅读框架。
实施例3：L-核糖异构酶的诱导表达。
将重组大肠杆菌BL21-AFRI接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％的接种量转接到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养2～3h，至OD600约为0.6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mmol/L)，或者添加1g/L乳糖进行诱导，然后继续诱导表达6h后，离心收集菌体。
实施例4：重组L-核糖异构酶的纯化。
获得的重组菌E.coli BL21-AFRI的菌体悬于磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，用生理盐水清洗两次，使用超声波破碎仪破碎细胞(400W，30min)，12000rpm离心10min，所得上清液为可溶性目标蛋白(粗酶液)。粗酶液经0.2μm滤膜过滤后，将样品加至Ni-NTA亲和树脂中，控制流速在15mL/h左右，用10倍柱床体积Wash-Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑)冲洗，最后用10倍柱床体积Elution-Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑)洗脱并收集目标蛋白，将目的蛋白溶液4℃下于磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中过夜透析。纯化后的目的蛋白酶活力达到12.3U/mg，经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组L-核糖异构酶蛋白的分子量为35kDa。
酶的酶活定义方法：以L-核酮糖为底物，单位时间内催化生成1μmolL-核糖所需的L-核糖异构酶的酶量定义为1U。
实施例5：重组L-核糖异构酶热稳定性实验。
取纯化后的重组L-核糖异构酶50μL(20mg/mL)于40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和75℃不同温度水浴中处理1～3h，然后加入到50μL含有50mM Tris-盐酸冲液(pH 7.5)的反应体系中，添加L-核酮糖至终浓度100mM，在最适反应温度下水浴反应30min，通过液相色谱测定L-核糖生成量。测得结果见表1。
表1温度对L-核糖异构酶的影响
实施例6：重组L-核糖异构酶pH稳定性实验。
取纯化后的重组L-核糖异构酶50μL(20mg/mL)于90μL pH分别为5.5、6.0、6.5、7.5、8.0、9.0和10.0条件下中室温处理0～12h，然后加入到50μL含有50mM Tris-盐酸冲液(pH 7.5)的反应体系中，添加L-核酮糖至终浓度100mM，最适温度下水浴反应30min，通过液相色谱测定L-核糖生成量。测得结果见表2。
表2 pH对L-核糖异构酶稳定性的影响
实施例7：重组L-核糖异构酶的应用。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L L-核酮糖作为转化底物，溶解于50mMTris-盐酸冲液的反应体系中(pH 7.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-核糖异构酶于体系中，最适温度下反应12h，通过液相色谱测定L-核糖生成量。经测定，转化液中L-核糖浓度为8.5g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到85％，见图2。
实施例8：产重组L-核糖异构酶的基因工程菌的应用。
转化反应的总体积为100mL，以100g/L L-核酮糖作为转化底物，悬浮于50mMTris-盐酸冲液的反应体系中(pH 7.5)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-核糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，最适温度下反应36h，通过液相色谱测定L-核糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为81g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到81％。
实施例9：来源于Actinotalea fermentans NX-1L-核糖异构酶与蛋白WP_034244055催化性能对比。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L L-核酮糖作为转化底物，溶解于50mMTris-盐酸缓冲液的反应体系中(pH 7.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-核糖异构酶和蛋白WP_034244055(该基因由南京金斯瑞生物科技公司全基因合成并按实施例4进行蛋白纯化)于体系中，最适温度下反应12h，通过液相色谱测定L-核糖生成量。经测定，Actinotaleafermentans NX-1 L-核糖异构酶转化液中L-核糖浓度为8.5g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到85％；蛋白WP_034244055转化液中L-核糖浓度为7.0g/L，重组L-核糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到70％。
Claims (10)
1.一种L-核糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述L-核糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有权利要求2所述L-核糖异构酶基因。
4.一种重组菌，其特征在于，该重组菌含有权利要求2所述L-核糖异构酶基因。
5.权利要求4所述重组菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到质粒上，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至宿主菌，即得到重组菌。
6.根据权利要求所述述重组菌的构建方法，其特征在于，所述的质粒为pET-28a(+)，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1所述L-核糖异构酶在制备L-核糖中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以1～100g/L的L-核酮糖为底物，加入L-核糖异构酶进行酶转化反应，酶的用量为10～500U，反应温度30～70℃，转化时间1～20h。
9.权利要求4所述重组菌在制备L-核糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以1～100g/L的L-核酮糖为底物，加入重组菌进行转化反应，重组菌的加入量为10～100g/L，反应温度30～70℃，转化时间1～48h。
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