CN105779401B - 一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶godl8及其基因和应用 - Google Patents

一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶godl8及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8及其基因和应用。本发明提供了一种来源于黑曲霉Aspergillus niger L75的葡萄糖氧化酶GODL8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示，且本发明提供了编码上述葡萄糖氧化酶的编码基因godL8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或6所示。本发明的葡萄糖氧化酶具有以下性质：最适pH 4.5，最适温度45℃，具有较好的热稳定性。作为一种新型的酶制剂，可应用于饲料、食品、医药等行业。

Description

一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C.1.1.3.4,GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。早在1904年人们就发现了GOD，但没有引起足够的重视。1928年Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现GOD。Kusai(1960)等、Pazur和Swobod-da(1964)分别从青霉素和黑曲霉中提纯GOD。Petruccioli(1995)等用青霉素的突变株生产出GOD。我国自1986年开始研究GOD的制备提纯工艺，1998年正式投入生产。
葡萄糖氧化酶的研究和生产已经过了几十年的历程，但目前对GOD的研究报道主要集中在其应用于血糖的测定，在食品中用于啤酒、果汁等的脱氧保鲜以及改善面粉质量等等。农业部在1999年就将葡萄糖氧化酶作为允许使用的饲料酶制剂添加剂之一，其在动物生产及饲料保存方面有一定的使用效果。
食品加工工艺中部分糖蛋白分解后，还原糖的醛基和氨基酸的羧基会产生美拉德反应，使产品褐变。用GOD-过氧化氢酶组合***处理食品，能将葡萄糖分子上的醛基转变为羧基，生成葡萄糖酸，消除美拉德反应。常应用于蛋品、马铃薯制品，果酱制品以及海鲜中，延长了产品的货架期。含有黄酮、亚油酸、亚麻酸等还原性物质的食品，如果汁、茶饮料、葡萄酒、啤酒、蛋黄酱、果酱等，存在氧会使还原性物质氧化，致使产品浑浊、沉淀、变色。加入适量GOD或GOD-过氧化氢酶复合物，可有效地保护食品中的还原性物质。GOD能阻止好氧菌生长繁殖，产生过氧化氢，起到杀菌作用。
GOD能专一氧化葡萄糖，故可用于测定各种食品和混合物中葡萄糖的含量。目前用固定化技术制成的GOD分析仪已用于测定发酵液的残糖量。据此原理制成的葡萄糖测定试剂盒，可定量测定果汁、饮料及牛奶等多种食品中葡萄糖的含量。GOD与葡萄糖反应生成葡萄糖酸的同时产生强氧化剂过氧化氢，能将面筋分子中的巯基(-SH)氧化为二硫键(-S-S-)，可取代对人体有致癌作用的溴酸钾，增强面筋强度和面团延展性，增大面包体积。尿糖试纸、血糖试纸测定糖含量的试剂已商品化，因操作简单、无毒、无害、易控制，已广泛应用于临床。
目前葡萄糖氧化酶虽然已经有商品出售，但是由于产量较低，生产成本高，使得其应用受到限制。因此开发酶活力高、性质优良及生产成本低的葡萄糖氧化酶就成了当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够应用的耐高温酸性葡萄糖氧化酶。
本发明的再一目的是提供编码上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶的应用。
本发明提供了一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
Figure BDA0000991245760000021
Figure BDA0000991245760000031
其中，该酶基因编码616个氨基酸和一个终止密码子，N端22个氨基酸为其预测的信号肽序列MRAQLFLRAV LAACLITMPA CG(SEQ ID NO.2)。因此，成熟的耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8的理论分子量为69.9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
Figure BDA0000991245760000032
本发明的葡萄糖氧化酶GODL8具有较好的热稳定性，在偏酸性和中性的范围内均具有较高活性，最适反应pH 4.5，最适反应温度45℃。
本发明提供了编码上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶的基因godL8。具体地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
Figure BDA0000991245760000041
Figure BDA0000991245760000051
本发明通过PCR的方法分离克隆了葡萄糖氧化酶基因godL8，cDNA全序列分析结果表明，葡萄糖氧化酶GODL8结构基因godL8全长1851bp。其中，信号肽的碱基序列：atgcgcgcgc agctgtttct gcgcgcggtg ctggcggcgt gcctgattac catgccggcg tgcggc(SEQID NO.5)。
成熟的葡萄糖氧化酶GODL8的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
Figure BDA0000991245760000052
Figure BDA0000991245760000061
将葡萄糖氧化酶基因godL8序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Aspergillus niger CBS 513.88的葡萄糖氧化酶氨基酸序列一致性为84％。说明GODL8是一种新的葡萄糖氧化酶。
本发明还提供了包含上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶基因godL8的重组载体，优选为pPIC-godL8。将本发明的葡萄糖氧化酶基因去掉信号肽后***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的葡萄糖氧化酶基因***到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC-godL8。
本发明还提供了包含上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶基因godL8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，进一步优选为重组毕赤酵母菌株GS115/godL8。
本发明还提供了一种制备耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组耐高温酸性葡萄糖氧化酶表达；
3)回收并纯化所表达的耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115(Pichia pastoris)，得到重组菌株GS115/godL8。
本发明还提供了上述耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8的应用，尤其是在食品、饲料与医药行业中氧化葡萄糖的应用。
本发明从黑曲霉Aspergillus niger L75中克隆得到一个新的葡萄糖氧化酶基因，其编码的葡萄糖氧化酶在酸性和中性条件下具有较高的酶活力，并且其最适温度为45℃，且具有较好的热稳定性。
附图说明
图1为本发明的重组葡萄糖氧化酶的最适pH。
图2为本发明的重组葡萄糖氧化酶的pH稳定性。
图3为本发明的重组葡萄糖氧化酶的最适温度。
图4为本发明的重组葡萄糖氧化酶的热稳定性。。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体
本发明从黑曲霉Aspergillus niger L75中分离得到一种新的耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂
限制性内切酶和连接酶均购自Fermentas公司；其它均为国产生化试剂。
3、培养基
(1)大肠杆菌培养基LB：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0；
(2)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)；
(3)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1黑曲霉Aspergillus niger L75中葡萄糖氧化酶编码基因godL8的克隆
提取黑曲霉Aspergillus niger L75基因组DNA：
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。
根据葡萄糖氧化酶基因序列设计合成引物P1，P2
P1:5'-GCGAATTCATTTGGTTTCCGATTCTGGCGAGCGCGC-3'；
P2:5'-GCTGCGGCCGCTTACAGGCAATACCAGCAGCCATAATAG-3'。
以黑曲霉Aspergillus niger L75总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。将该片段回收后与pEASY-T3载体连接转化后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。
实施例2重组葡萄糖氧化酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码葡萄糖氧化酶的godL8双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟葡萄糖氧化酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有黑曲霉Aspergillus niger L75葡萄糖氧化酶基因godL8的重组质粒pPIC-godL8并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/godL8。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定葡萄糖氧化酶的活力。重组葡萄糖氧化酶的表达量为52U/mL。
实施例3重组葡萄糖氧化酶的活性分析
葡萄糖氧化酶活性测定方法：GOD活性测定一般采用邻-联茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(GOD)作用下，氧供体邻-联茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。测定540nm处吸光度的变化，根据标准曲线结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
实施例4重组葡萄糖氧化酶GODL8的性质测定
1、重组葡萄糖氧化酶GODL8的最适pH和pH稳定性的测定
将纯化的重组葡萄糖氧化酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行酶活力测定。结果(图1)表明，重组葡萄糖氧化酶GODL8的最适pH为4.5，在pH 2.0～6.5有80％以上的相对酶活性。葡萄糖氧化酶GODL8于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中37℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明葡萄糖氧化酶GODL8在pH 2.0～9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％以上，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、葡萄糖氧化酶GODL8的最适温度及热稳定性测定
葡萄糖氧化酶GODL8的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为葡萄糖氧化酶GODL8在不同温度下处理不同时间，再在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为45℃，在30～60℃下均保持较高酶活。酶的热稳定性试验表明(图4)，葡萄糖氧化酶GODL8有良好的热稳定性，在70℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。
3、不同金属离子化学试剂对葡萄糖氧化酶GODL8酶活的影响测定
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在45℃、pH 4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组葡萄糖氧化酶GODL8的活力没有明显变化，只有SDS微弱抑制其活力。当Cu2+，Ag+和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制葡萄糖氧化酶GODL8酶活力，5mmol SDS使其活力全部丧失。
4、葡萄糖氧化酶GODL8抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：
用pH 2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH 7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH 2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的葡萄糖氧化酶液加入0.5mL胃蛋白酶，取pH 7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的葡萄糖氧化酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/葡萄糖氧化酶(w/w)≈0.1，37℃保温60和120min取样，在pH4.5及45℃条件下测定酶活性。实验结果表明葡萄糖氧化酶GODL8用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120min后，胰蛋白酶处理后的葡萄糖氧化酶GODL8的酶活比处理前提高了15％，胃蛋白酶处理后的葡萄糖氧化酶GODL8活性比处理前提高了20％。
Figure IDA0000991245850000011
Figure IDA0000991245850000021
Figure IDA0000991245850000031
Figure IDA0000991245850000041
Figure IDA0000991245850000051

Claims (9)

1.一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
2.一种耐高温酸性葡萄糖氧化酶基因godL8，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8。
3.如权利要求2所述的耐高温酸性葡萄糖氧化酶基因godL8，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
4.包含权利要求2或3所述耐高温酸性葡萄糖氧化酶基因godL8的重组载体。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC-godL8。
6.包含权利要求3所述耐高温酸性葡萄糖氧化酶基因godL8的重组菌株。
7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌株GS115/godL8。
8.一种制备耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4或5的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组耐高温酸性葡萄糖氧化酶表达；
3)回收并纯化所表达的耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8。
9.权利要求1所述耐高温酸性葡萄糖氧化酶GODL8在食品、饲料与医药行业中的应用。
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